帶狀皰疹T 淋巴細(xì)胞亞群變化及其與Bcl-2 表達(dá)的關(guān)系

茅榮鑫，胡慶★，劉展菱，劉開玲，劉秋萍

（1.南寧市第六人民醫(yī)院，廣西 南寧；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧；3.南寧市第八人民醫(yī)院，廣西 南寧）

0 引言

帶狀皰疹是水痘-帶狀皰疹病毒（VZV)感染性疾病，多發(fā)生于老年人及體質(zhì)較差者。有臨床研究表明[1]，約有10%的帶狀皰疹患者并發(fā)帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛，帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛導(dǎo)致的疼痛、失眠、抑郁等嚴(yán)重影響了患者的生存質(zhì)量。目前帶狀皰疹的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，且臨床上治療帶狀皰疹的方法雖多，但療效均不盡如意、作用機(jī)理尚不十分清晰。因此，深入研究帶狀皰疹的發(fā)病機(jī)理，為今后尋找更加有效的治療方法提供理論依據(jù)已成為當(dāng)務(wù)之急。因此，本研究分析了2018 年6 至2018 年12 月本院收治的40 例帶狀皰疹患者的T 淋巴細(xì)胞亞群的變化及其與Bcl-2表達(dá)的關(guān)系，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2018 年6 月至2018 年12 月南寧市第六人民醫(yī)院收治的符合納入標(biāo)準(zhǔn)的帶狀皰疹患者40 例作為實(shí)驗(yàn)組，并選取同期內(nèi)該院體檢科經(jīng)檢查無異常的健康志愿者40 人作為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組男18 例，女22 例，年齡37-66 歲，平均年齡52.73±6.83 歲；對(duì)照組男性20 人，女性20 人，年齡39-67 歲，平均年齡53.58±6.71 歲，兩者性別、年齡的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)南寧市第六人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照帶狀皰疹中國(guó)專家共識(shí)[2]進(jìn)行診斷：由VZV 再活化引起的一種病毒性皮膚病，有成簇水皰，沿神經(jīng)分布，排列成帶狀，單側(cè)性，有明顯神經(jīng)痛。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合上述帶狀皰疹診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）初次發(fā)病，病程小于等于7 天，年齡45-70 歲之間；（3）未經(jīng)相關(guān)治療；（4）無認(rèn)知障礙，了解本研究項(xiàng)目流程，同意參加本實(shí)驗(yàn)并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）伴有嚴(yán)重的心、肺等系統(tǒng)性疾病者；（2）有嚴(yán)重中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥；（3）惡性腫瘤患者；（4）妊娠及哺乳期婦女；（5）已接受帶狀皰疹相關(guān)治療措施者。

1.4 樣本的采集與檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)組患者就診當(dāng)天、未采取相關(guān)治療措施之前，于肘靜脈處抗凝管采集患者外周血5mL，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+T 淋巴細(xì)胞、CD8+T 淋巴細(xì)胞水平和比例以及其表面Bcl-2 抗原的表達(dá)，具體操作方法如下。

1.4.1 外周血T 淋巴細(xì)胞分離

①實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前將Hanks 應(yīng)用液配制好待用（一份原液—份雙蒸水，混合攪拌均勻后分裝，榜高壓蒸汽滅菌，使用前用無菌的溶液調(diào)節(jié)PH 至7.2-7.6）；②將抗凝血輕柔搖晃，使血液混合均勻，與Hanks 應(yīng)用液以比例混勻稀釋；③在無菌狀態(tài)下將人類淋巴細(xì)胞分離液加入刻度離心管中；④用吸管將稀釋旳血液沿離心管緩慢地加入到人類淋巴細(xì)胞分離液液面之上。稀釋血液體積與淋巴細(xì)胞分離液體積兩者總高度不超過刻度離心管的三分之二，擰緊離心管管蓋；⑤將刻度離心管置于離心機(jī)中，配平后1500rpm 離心15min；⑥離心后可見管內(nèi)分為四層，從上至下分別為：血漿層、白膜層（本實(shí)驗(yàn)所需層）、人類淋巴細(xì)胞分離液層、粒細(xì)胞及紅細(xì)胞層；⑦用吸管小心吸出白膜層，置于管中，-80°C 保存，待檢。

1.4.2 T 細(xì)胞亞群檢測(cè)

①取兩個(gè)EP 管分別標(biāo)記A、B；②將抗凝全血標(biāo)本混合均勾，移液器吸取抗凝全血分別加入兩個(gè)EP 管中；③A 管中加入抗人類CD4-FITC/CD8-PE T 細(xì)胞流式抗體2.5uL；B 管加入PE-Cy5鼠IgG1 同型對(duì)照抗體10uL、FITC 鼠IgG1 同型對(duì)照抗體2.5uL 以及PE 鼠IgG1 同型對(duì)照抗體2.5uL（以上步驟避光操作）；④4°C避光孵化30min；⑤孵育完畢后，兩管中均加入人類紅細(xì)胞裂解液500uL，避光，4°C 裂解10-15min；⑥加入PBS 緩沖液1000uL 終止裂解；⑦低溫超速離心機(jī)4°C，400xg，離心5min，去上清，加入PBS緩沖液1000uL 吹打混勻，重復(fù)低溫超速離心，去上清；⑧加入PBS緩沖液1000uL 吹打混勻后，加入96 孔板中，每孔200uL，設(shè)復(fù)孔，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，設(shè)門，做兩色熒光流式細(xì)胞檢測(cè)，測(cè)定CD4+T 淋巴細(xì)胞以及CD8+T 淋巴細(xì)胞，檢測(cè)兩種標(biāo)記細(xì)胞百分比。

1.4.3 CD4+T 淋巴細(xì)胞表面Bcl-2 的檢測(cè)

①取2 支EP 試管A、B；②A、B 中分別加入CD4+10uL 和懸液100uL；③室溫避光10min；④加500uL 破膜劑（1×perm）避光10min；⑤用含0.5%的胎牛血清和0.1%疊氮鈉的PBS 洗一次；⑥離心1500r/min 5 分鐘棄上清液；⑦A 中加20uL Bcl-2FITC 抗體混勻，B 中加IgG-FITC 對(duì)照，室溫避光30 分鐘；⑧用含1%的疊氮鈉的PBS 洗1 次；⑨離心1500r/min 5 分鐘棄上清液；⑩加入500uL PBS 混勻上機(jī)。

1.4.4 CD8+T 淋巴細(xì)胞表面Bcl-2 的檢測(cè)

操作步驟同CD4+T 淋巴細(xì)胞表面Bcl-2 的檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間的比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，運(yùn)用pearson 相關(guān)性分析探索CD4+T 淋巴細(xì)胞、CD8+T 淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)與Bcl-2 表達(dá)的相關(guān)性。以P＜0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 各組CD4+T 淋巴細(xì)胞、CD8+T 淋巴細(xì)胞水平及其比例的比較

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組患者CD4+T 淋巴細(xì)胞明顯降低（P＜0.05）、CD8+T 淋巴細(xì)胞明顯增高（P＜0.05），CD4+T 淋巴細(xì)胞/CD8+T 淋巴細(xì)胞明顯降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞水平、比例的比較（n；%）

2.2 各組CD4+T 淋巴細(xì)胞、CD8+T 淋巴細(xì)胞表面Bcl-2 表達(dá)的比較

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組患者CD4 +T 淋巴細(xì)胞表面Bcl-2 的表達(dá)明顯降低（P＜0.05）、CD8+T 淋巴細(xì)胞表面Bcl-2 的表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞表面Bcl-2 表達(dá)水平的比較（n；%）

2.3 帶狀皰疹患者的CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞水平與Bcl-2表達(dá)的相關(guān)性

帶狀皰疹患者CD4+T 淋巴細(xì)胞與Bcl-2 的表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05），CD8+T 淋巴細(xì)胞水平與Bcl-2 的表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05）。見表3。

表3 帶狀皰疹患者的CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞水平與Bcl-2 表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，機(jī)體對(duì)VZV 的免疫主要是由T 淋巴細(xì)胞活化介導(dǎo)的[3]，VZV 初次感染后，機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)VZV 特異性的T淋巴細(xì)胞，由其釋放多種細(xì)胞因子、顆粒酶和穿孔素清除VZV，隨后部分VZV 特異性T 淋巴細(xì)胞活化后自發(fā)誘導(dǎo)凋亡，部分則成為記憶性CD4+ 和CD8+T 淋巴細(xì)胞。但是由于某些自身或外界因素的影響，使得記憶性T 淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，從而導(dǎo)致帶狀皰疹的發(fā)生，嚴(yán)重時(shí)皰疹泛發(fā)全身。

CD4+ 是輔助性T細(xì)胞表面標(biāo)志，其主要功能是協(xié)助B 細(xì)胞產(chǎn)生抗體、增強(qiáng)B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫和輔助其他淋巴細(xì)胞的功能；CD8+細(xì)胞代表抑制性和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，能夠抑制B淋巴細(xì)胞活性，抑制抗體的合成、分泌及T細(xì)胞的增殖，因而，CD8+細(xì)胞增加不利于抗體產(chǎn)生、疾病的控制。已有研究表明帶狀皰疹患者免疫功能異常，在細(xì)胞免疫應(yīng)答方面存在免疫抑制[4-5]，細(xì)胞免疫抑制主要是由CD4+T 淋巴細(xì)胞降低、CD8+T 淋巴細(xì)胞升高、CD4+/CD8+ 比例降低所致[6-8]，且均和帶狀皰疹的臨床特征有一定的相關(guān)性[9]。本研究結(jié)果顯示，帶狀皰疹患者較健康志愿者的CD4+T 淋巴細(xì)胞降低（P＜0.05）、CD8+T 淋巴細(xì)胞升高（P＜0.05）、CD4+/CD8+比例降低（P＜0.05），與上述國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果一致[6-8]。

細(xì)胞凋亡，又稱程序性細(xì)胞死亡，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡，涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等的作用。對(duì)免疫系統(tǒng)而言，細(xì)胞凋亡不僅是免疫系統(tǒng)發(fā)育過程中必不可少的一個(gè)環(huán)節(jié)，而且是免疫系統(tǒng)行使功能的一種方式。已有研究表明，T淋巴細(xì)胞凋亡參與了帶狀皰疹的發(fā)生、發(fā)展[10]，另有研究發(fā)現(xiàn)[11]，凋亡抑制蛋白c-FLIP 參與了帶狀皰疹患者VZV 細(xì)胞免疫，但非唯一相關(guān)因素。因此，進(jìn)一步研究帶狀皰疹患者T 淋巴細(xì)胞亞群上凋亡相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑，將有助于闡明帶狀皰疹的發(fā)病機(jī)制。

Bcl-2 基因是研究最早的與凋亡有關(guān)的基因，其是阻止凋亡的最后共同通路，通過阻止受損DNA 翻譯成參與細(xì)胞凋亡的的信號(hào)，或通過阻止凋亡基因產(chǎn)物的活化來實(shí)現(xiàn)的，從而保護(hù)多種細(xì)胞免于各種誘因所致的細(xì)胞凋亡[12]。已有研究表明，在諸多由T 淋巴細(xì)胞活化介導(dǎo)為主的免疫疾病中，均發(fā)現(xiàn)與凋亡途徑、分子Bcl-2 相關(guān)[13,14]。本研究結(jié)果顯示，帶狀皰疹患者CD4+T 淋巴細(xì)胞表面的Bcl-2 的表達(dá)低于健康志愿者，CD8+T 淋巴細(xì)胞表面的Bcl-2 的表達(dá)高于健康志愿者，并且CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞水平的變化均與其表面Bcl-2 的表達(dá)呈正相關(guān)，提示帶狀皰疹患者T淋巴細(xì)胞亞群的改變，可能與Bcl-2 調(diào)控的細(xì)胞凋亡相關(guān)。

綜上所述，帶狀皰疹患者存在CD4+T 淋巴細(xì)胞降低、CD8+T淋巴細(xì)胞升高、CD4+T 淋巴細(xì)胞降低/ CD8+T 淋巴細(xì)胞升高，其機(jī)制十分復(fù)雜，Bcl-2 調(diào)控的細(xì)胞凋亡可能是其變化的原因之一。仍需進(jìn)一步的臨床及基礎(chǔ)研究以明確其機(jī)制，為今后尋找?guī)畎捳畎邢蛩幬镏委煛⑻岣吲R床上帶狀皰疹的治療效果、減少帶狀皰疹患者的痛苦提供更多的理論依據(jù)。