基于nano LC-MS/MS法的黃明膠膠原蛋白鑒定研究

張濤,宋世震,劉睿

(1.武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430065；2.江蘇省海洋藥用生物資源研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023；3.江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心/中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇 南京 210023；4.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023)

黃明膠CollaCoriiBovis為?？苿游稂S牛BosTaurusdomesticus的皮經(jīng)加工熬制而成的膠。黃明膠味甘，性平，主入肺、大腸經(jīng)。具有滋陰潤燥、養(yǎng)血止血的功效[1]。黃明膠一詞，首見于《食療本草》，可“敷腫，治咳嗽不差，止吐血、咯血”?！侗静菥V目》記載黃明膠“治吐血、衄血、下血、血淋，下痢，妊婦胎動血下，風(fēng)濕走注疼痛，打撲損傷，湯火灼瘡，一切癰疽腫毒，活血止痛，潤燥，利大小腸”[2]。

近年來，以電泳法、HPLC法、全自動氨基酸分析法對黃明膠中主要的蛋白質(zhì)類、肽類、氨基酸類、無機(jī)元素等成分進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究[3-4]；基于LC-QQQ MS分析特征性肽段的方法，被用來鑒別或輔助鑒別膠類藥材的真?zhèn)蝃5-7]，這些工作為黃明膠的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了前期研究思路。為此，本文采用基于shutgun技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究思路與方法對黃明膠中蛋白質(zhì)、肽類成分開展全面分析與鑒別，為黃明膠的物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定了工作基礎(chǔ)，也為阿膠、鹿角膠、龜甲膠等膠類藥材功效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供借鑒。

1 材料

戴安U3000 NanoRSLC納升液相系統(tǒng)(美國DIONEX公司)；Thermo Q Exactive Orbitrap質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher公司)；BP 211D電子天平(德國Sartorius公司)；Rotavapor R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司)；離心濃縮儀(美國Labconco公司)；Freezone 4.5 plus冷凍干燥機(jī)(美國Labconco公司)。

碳酸氫銨，胰蛋白酶(Promega質(zhì)譜測序級)，乙腈、甲醇、甲酸等質(zhì)譜用試劑均為質(zhì)譜級(德國Merck公司)。Seppack C18固相萃取小柱(Waters公司)；多肽測定試劑盒(美國Thermo公司)。黃明膠(批號：170510，170515，購于安徽亳州藥材市場)。

2 方法

2.1 黃明膠樣品的酶解

參照2015版《中國藥典》的方法稍作修改，取黃明膠粉末0.1 g，加1%碳酸氫銨溶液50 mL，超聲處理30 min，取適量黃明膠溶液10 000 r/min離心后，取上清液100 μL，置于2 mL離心管中，加入0.1 μg/μL的胰蛋白酶溶液20 μL，搖勻，37 ℃恒溫酶解12 h，加入10% TFA溶液60 μL終止反應(yīng)，后用Seppak C18固相萃取小柱脫鹽處理，離心濃縮儀干燥，得黃明膠酶解物，采用多肽試劑盒測定黃明膠酶解物中總多肽量，黃明膠酶解物置于-20 ℃保存，備用。

2.2 nano-LC MS/MS分析

戴安U3000 NanoRSLC納升液相系統(tǒng)，色譜柱為5 μm Reprosil C18AQ(75 μm×150 mm)，LC-MS/MS系統(tǒng)分析樣品。用初始流動相將黃明膠酶解物樣品復(fù)溶至多肽濃度為1 μg/μL，上樣2 μL，流速400 nL/min，流動相A(乙腈/甲酸/水=2/0.2/98，v/v/v)，流動相B(乙腈/甲酸/水=80/0.2/20，v/v/v)，2%～30%B線性梯度洗脫150 min。Thermo Q Exactive Orbitrap質(zhì)譜儀用于肽段分析，噴霧電壓為2.5 kV，離子傳輸毛細(xì)管溫度為200 ℃；質(zhì)譜一級全掃描范圍為m/z300～2 000，分離寬度為3 Da；串聯(lián)質(zhì)譜分析采用一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)依賴的二級質(zhì)譜掃描模式，依次選取一級質(zhì)譜中離子強(qiáng)度最高的5個離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離(CID)二級串聯(lián)質(zhì)譜，每個樣品重復(fù)進(jìn)樣1次。采用Xcalibur軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

2.3 黃明膠中蛋白質(zhì)類成分的鑒定研究

二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用PEAKS 8.5軟件進(jìn)行搜庫鑒定分析，選擇?？苿游?Uniport.org下載)數(shù)據(jù)庫，檢索參數(shù)設(shè)置為：前體離子誤差10 ppm；子離子誤差1 Da；可變翻譯后修飾選擇氧化修飾(Oxidation,+15.99 Da)；N-端乙?；?N-term Acetylation,+42.01 Da)；脫酰胺化(Deamidation,+0.98 Da)；羥基化(Hydroxylation,+15.99 Da)。允許2個位點(diǎn)誤切，假陽性率(FDR)≤1%；樣品搜庫選擇胰蛋白酶酶切(Trypsin)方式；其他參數(shù)為默認(rèn)參數(shù)，在上述檢索條件下所得分值有顯著性意義(P<0.05)被認(rèn)定為有效的鑒定結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 黃明膠中蛋白質(zhì)類成分的鑒定

從2個批次的黃明膠中共測定了1 378個肽段序列信息，鑒定了30個蛋白質(zhì)(唯一肽段數(shù)量≥2)，nano LC-MS/MS總離子流圖(TIC)見圖1。由表1可見，黃明膠中主要成分來源于膠原蛋白，包括：膠原Ⅰ蛋白α1鏈(COL1A1)、α2鏈(COL1A2)，膠原Ⅲ蛋白α1鏈(COL3A1)，膠原Ⅱ蛋白α1鏈(COL2A1)，膠原ⅩⅦ蛋白α1鏈(COL17A1)，膠原Ⅺ蛋白α1鏈(COL11A1)，膠原Ⅺ蛋白α2鏈(COL11A2)，膠原Ⅹ蛋白α1鏈(COL10A1)，膠原Ⅳ蛋白α1鏈(COL4A1)。其中以COL1A1、COL1A2、COL3A1為主，唯一肽段數(shù)量分別達(dá)到260、236及118，鑒定獲得的肽段覆蓋率在70%以上。圖2為主要膠原蛋白在鑒定的蛋白中占比情況，來源于COL1A1、COL1A2、COL3A1的肽段占84.3%。

3.2 黃明膠中肽段的分析鑒定

黃明膠為牛皮經(jīng)過充分煎煮、熬制后，膠原蛋白變性、降解、溶脹后的產(chǎn)物，通過胰蛋白酶特異性的切斷賴氨酸(Lys,K)和精氨酸(Arg,R)后的酰胺鍵而獲得多種肽段，進(jìn)一步通過MS/MS圖譜與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的比對實(shí)現(xiàn)序列鑒定，從而明確黃明膠中蛋白質(zhì)類成分的組成及來源。表1與圖2表明，膠原I蛋白和膠原Ⅲ蛋白為黃明膠中的主要成分，基于MS/MS圖譜搜庫比對的準(zhǔn)確性、唯一肽段的數(shù)量及覆蓋率是評價蛋白質(zhì)鑒定準(zhǔn)確率的重要指標(biāo)。

表1 黃明膠中鑒定的蛋白質(zhì)情況

注：O.氧化Oxidation(Met,M);A.酰胺化Acetylation(N-term);D.脫酰胺化Deamidation(Asn,N,Gln,Q);H.羥基化Hydroxylation(Pro,P)。

圖2膠原蛋白在黃明膠鑒定的蛋白質(zhì)類成分中的占比情況

以本文鑒定的肽段中-10lgP=79.42高的肽段HGNRGEPGPAGAVGPAGAVGPR為例，其MS/MS圖譜見圖3，m/z為999.007 1，主要碎片離子峰包括：y3+(329.19)，y4+(428.26)，y5+(499.30)，y6+(556.32)，y7+(627.36)，y8+(724.41)，y9+(781.43)，y10+(880.50)，y11+(951.54)，y12+(1 008.56)，y13+(1 079.60)，y14+(1 176.65)，y15+(1 233.67)，y16+(1 346.72)，y17+(1 475.76)，y18+(1 532.78)，y19+(1 688.88)，y20+(1 802.92)，y21+(1 859.94)，b3+(309.13)，b4+(465.23)，b5+(522.25)，b6+(651.29)，b7+(764.40)，b8+(821.36)，b10+(989.45)，b11+(1 046.47)，b12+(1 117.51)，b13+(1 216.58)，b14+(1 273.60)，b15+(1 370.64)，b17+(1 498.71)，b18+(1 569.75)，b19+(1 668.82)，b20+(1 725.85)，b21+(1 822.90)。經(jīng)鑒定，HGNRGEPGPAGAVGPAGAVGPR肽段來源于COL1A2的H973-R994序列。

3.3 黃明膠膠原蛋白的修飾類型與位點(diǎn)鑒定

蛋白質(zhì)的翻譯后修飾(Post-translational modifications,PTMs)是指蛋白質(zhì)在翻譯后的化學(xué)修飾，通常為蛋白質(zhì)生物合成的較后步驟。我們在鑒定黃明膠蛋白質(zhì)類成分的過程中注意到黃明膠的膠原蛋白主要有4種修飾形式：脯氨酸(Pro,P)的羥基化，天冬酰胺(Asn,N)和谷氨酰胺(Gln,Q)的脫酰胺化，甲硫氨酸(Met,M)的氧化，以及N-端的酰胺化，其中以羥基化與脫酰胺化較多。

以肽段GNDGATGAAGPPGPTGPAGPPGFPGAVGAK為例，如圖4所示，肽段經(jīng)過碎裂后獲得了一系列y離子，2個肽段的y7～y18離子均一致，而從y19離子開始，2個肽段對應(yīng)的y離子均相差15.99(△m/z)，經(jīng)過計(jì)算推測，即因肽段GNDGATGAAGPPGPTGPAGPPGFPGAVGAK的Pro12發(fā)生了羥基化，故2個MS/MS圖譜計(jì)算出的肽段序列氨基酸序列一致，僅在Pro12處分別為Pro和羥脯氨酸(Hyp)，兩個肽段分別為GDDGATGAAGPPGPTGPAGPPGFPGAVGAK與GDDGATGAAGPP(+15.99)GPTGPAGPPGFPGAVGAK，通過分析比較y離子發(fā)生偏差的情況可確定肽段發(fā)生修飾的位點(diǎn)與數(shù)量。

為此，我們對鑒定獲得的肽段及蛋白質(zhì)主要修飾的位點(diǎn)與數(shù)量進(jìn)行了分析，COL1A1(P02453)為例，鑒定的肽段中有297個肽段源于COL1A1，其中260個唯一肽段，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)這些肽段中，有124個Pro發(fā)生了羥基化修飾，即發(fā)生Pro→Hyp的轉(zhuǎn)化，14個Gln發(fā)生了脫酰胺修飾，即發(fā)生Gln→谷氨酸(Glu)的轉(zhuǎn)化，10個Asn發(fā)生了脫酰胺修飾，即發(fā)生Asn→天冬氨酸(Asp)的轉(zhuǎn)化，5個Met發(fā)生了氧化修飾，15個氨基酸殘基發(fā)生了N-端酰胺化修飾。

我們在肽段的分析鑒定的過程中還發(fā)現(xiàn)，有些肽段的相同氨基酸位點(diǎn)上，同時鑒定到有修飾與未修飾的肽段，以COL1A1的G322-K351為例，從黃明膠的樣品中共鑒定到如下肽段：GNDGATGAAGPPGPTGPAGPPGFPGAVGAK(-10lgP=60.97)，GN(+0.98)DGATGAAGPPGPTGPAGPPGFPGAVGAK(-10lgP=53.69)，GNDGATGAAGPPGPTGPAGPP(+15.99)GFPGAVGAK(-10lgP=55.98)，GNDGATGAAGPP(+15.99)GPTGPAGPP(+15.99)GFP(+15.99)GAVGAK(-10lgP=64.13)，GN(+0.98)DGATGAAGPPGPTGPAGPP(+15.99)GFP(+15.99)GAVGAK(-10lgP=54.31)，這些肽段源于同一個氨基酸序列，如，肽段GNDGATGAAGPPGPTGPAGPPGFPGAVGAK未發(fā)生修飾，而GN(+0.98)DGATGAAGPPGPTGPAGPPGFPGAVGAK在Asn2位置發(fā)生了脫酰胺修飾，Pro21位置未見修飾；GNDGATGAAGPPGPTGPAGPP(+15.99)GFPGAVGAK則在Pro21位置發(fā)生了羥基化修飾，Asn2位置未見修飾。因此，雖然肽段來源相同，但發(fā)生修飾的情況卻不同，這可能與黃明膠的生產(chǎn)加工過程中發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)有關(guān)。脫酰胺修飾使得Asn脫去乙?；葾sp，釋放出游離羧基，Pro發(fā)生羥基化修飾后生成Hyp，在Pro的五元環(huán)中引入-OH，從兩類修飾特性來看，以不同的方式釋放出游離的-OH基團(tuán)，一定程度上增加了肽段的親水性。目前，這些修飾的發(fā)生階段、發(fā)生機(jī)理仍不清楚，但是特定的氨基酸殘基發(fā)生的修飾可能與黃明膠的功效、藥性等相關(guān)，而上述主要的4類修飾是原藥材特有的PTM還是在加工熬制過程中發(fā)生的修飾，這些問題有待后續(xù)研究來進(jìn)一步闡釋。

4 討論

黃明膠中含有膠原蛋白為主的蛋白質(zhì)類成分，然而一直以來對于黃明膠等膠類藥材的物質(zhì)基礎(chǔ)研究報道較少，為此，本文通過nano-LC Orbitrap MS/MS技術(shù)對黃明膠中蛋白質(zhì)、多肽類成分進(jìn)行了系統(tǒng)分析鑒定，基于牛科動物的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，從黃明膠中共分析鑒定了1 378個肽段信息及30個蛋白質(zhì)類成分，較為系統(tǒng)的揭示了黃明膠中蛋白質(zhì)類成分主要源于膠原Ⅰ蛋白α1鏈、α2鏈及膠原Ⅲ蛋白α1鏈，為黃明膠的功效物質(zhì)基礎(chǔ)研究、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定等提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

蛋白質(zhì)、肽類成分是構(gòu)成動物性中藥的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，而由于技術(shù)方法、儀器平臺的限制，多年來發(fā)展較為緩慢，而隨著蛋白質(zhì)組、多肽組、代謝組等多組學(xué)技術(shù)手段的發(fā)展，帶來了動物藥發(fā)展的新機(jī)遇，因而，開展動物藥系統(tǒng)功效物質(zhì)基礎(chǔ)研究勢在必行。隨著近年來動物藥蛋白質(zhì)、肽類成分組成的不斷研究揭示，我們發(fā)現(xiàn)動物藥在加工、炮制、提取過程中，在機(jī)體生物酶的作用下，動物藥中大量的蛋白質(zhì)、肽類成分會發(fā)生變性、溶出、溶解、特異性/非特異性降解、修飾等變化，產(chǎn)生并釋放出具有生物活性的多肽，發(fā)揮特殊的生物效應(yīng)。本文基于蛋白質(zhì)組分析,較系統(tǒng)地研究了黃明膠的物質(zhì)組成，為膠類動物藥功效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提出了新的方法與思路。