補腎益智方治療阿爾茨海默病斑馬魚模型的作用及機制研究

顧曉群，余黎，武相，白宇，徐奚如，張靜，周春梅，張彪

(1.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院/江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇 南京 210023)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種常見的中樞神經系統退行性疾病[1]，以進行性認知功能減退為主要癥狀[2]，伴有腦內淀粉樣蛋白沉積、神經纖維纏結和神經炎癥等病理表現[3]。AD的發(fā)病機制復雜，目前尚無公認有效的治療手段。

補腎益智方是臨床驗方，采用補腎活血化痰醒竅法，在干預老年遺忘型輕度認知障礙(Amnestic mild cognitive impairment,aMCI)中取得了較好的臨床效果[4]，能夠有效改善患者的認知，提高MoCA量表評分及中醫(yī)癥候評分。補腎益智方以枸杞、黨參、山萸肉補腎健脾為君，白術、熟地、益智仁健脾益腎為臣，郁金、當歸、菖蒲和遠志活血化痰為佐，川芎引藥上行為使，方中諸藥合用使髓海充盈，血脈通暢。本實驗利用斑馬魚模型對補腎益智方干預AD的療效和作用機制進行了研究。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

實驗用斑馬魚屬AB品系，6月齡，購于南京堯順禹生物科技有限公司。斑馬魚飼養(yǎng)于獨立的養(yǎng)殖系統中，每缸放置斑馬魚10～12條，水溫26～30 ℃，電導率550～580 μS/cm，pH值為7.0～7.5，光照周期為光照∶黑暗=14 h∶10 h，每日定時喂食豐年蝦2次。

1.2 主要試劑

六水合氯化鋁(AlCl3·6H2O,分析純,南京化學試劑股份有限公司，批號：160427899D)；鹽酸多奈哌齊(北京華威銳科化工有限公司，批號：HW18C2607-2)；補腎益智方飲片(江蘇省中醫(yī)院)；引物(上海生工生物工程股份有限公司)；乙酰膽堿酯酶(ACHE)測試盒、乙酰膽堿轉移酶(ChAT)測試盒(南京建成生物工程研究所，批號：20180118，20180122)；反轉錄試劑盒(Prime Script RT Master Mix)、熒光定量PCR試劑盒(SYBR Premix Ex Tap TM)(愛必夢生物科技有限公司，批號：009983473)；Anti-BACE1 Antibody(Proteintech，批號：00054471)；Anti-APP Antibody(Biorbyt，批號：DF4488)；Anti-Nrf2 Antibody、Anti-Keap1 Antibody(LifeSpan Biosciences，批號：64364，147565)；Anti-beta-actin Antibody HRP(杭州華安生物有限公司，批號：HL0926)；羊抗兔抗體(北京博奧森生物技術有限公司，批號：AH11279138)。

1.3 儀器

T型迷宮(自制)；臺式高速冷凍離心機(艾本德中國有限公司，型號：5417R)；實時定量PCR儀(賽默飛世爾科技有限公司，型號：7500)；超靈敏化學發(fā)光成像儀(GE醫(yī)療生命科學部，型號：LAS4000)。

1.4 實驗方法

1.4.1 染毒 實驗選取同一批斑馬魚，隨機分成5組，分為空白對照組、模型組、陽性藥組、補腎益智方高劑量組和低劑量組，每組12條。除空白對照組，其余各組均用AlCl3·6H2O配制成濃度為100 μg/L的溶液持續(xù)浸泡斑馬魚30 d，每日更換一半的染毒培養(yǎng)液。染毒結束后利用T迷宮實驗剔除染毒失敗的斑馬魚，造模成功的模型組10條、陽性藥組10條、補腎益智方高劑量組11條和低劑量組12條。

1.4.2 藥物干預

1.4.2.1 中藥制備 補腎益智方組成：枸杞20 g，黨參15 g，山萸肉12 g，白術10 g，熟地15 g，益智仁6 g，郁金10 g，當歸10 g，石菖蒲8 g，遠志6 g，川芎10 g。取補腎益智方全方5劑，先用10倍水浸泡0.5 h，煎煮1 h，過濾，再用5倍水煎煮1 h，過濾，2次藥液混合，用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至610 mL左右，生藥量約1 g/mL。用純水稀釋成1 mg/mL濃度的母液，分裝數管，凍存于-20 ℃冰箱。

1.4.2.2 給藥 造模結束后，分別給予模型組常規(guī)培養(yǎng)液，陽性藥組鹽酸多奈哌齊20 μg/mL，高、低劑量組補腎益智方30、10 μg/mL浸泡斑馬魚14 d，每日更換一半的新鮮藥液。

1.4.3 T迷宮實驗 本實驗所用T型迷宮如圖1所示，迷宮由水平等長的左右臂和垂直甬道組成，右臂與營養(yǎng)豐富區(qū)(Enriched chamber,EC)相連，EC區(qū)底部鋪滿營養(yǎng)泥，左上角設有人工綠植，右下角放有裝有5只斑馬魚的燒杯。在給藥結束之后，按照文獻[5]方法進行T迷宮測試，測試前1 d，給予測試斑馬魚1個適應期，讓其在迷宮內自由活動20 min。測試當天，在甬道起點放入測試魚，讓其在T迷宮中自由活動，測試時間6 min，觀察并記錄魚從起點到找到EC區(qū)的潛伏時間，測試結束后給予食物獎勵。未找到EC區(qū)的魚，在6 min后引導其進入EC區(qū)并停留3 min，同樣給予食物獎勵。每條測試魚都有1個對應編號的獨立容器，測試結束后放回各自容器中。每天測試1次，共測試4 d，記錄每次潛伏時間，以4 d潛伏時間的變化情況作為考察其學習記憶能力的主要指標。

1.4.4 ACHE、ChAT的活力測定 T迷宮實驗后，每組隨機取3只斑馬魚，冰上快去取腦，以質量∶體積=1∶9制備10%腦組織勻漿，2 500 r/min離心15 min，取上清，按試劑盒說明書進行ACHE、ChAT酶活力測試。

1.4.5 免疫組織化學染色 T迷宮實驗后，每組隨機取3只斑馬魚，剪下魚頭用4%多聚甲醛固定24 h，5%乙酸脫鈣，常規(guī)石蠟包埋，切片厚4～5 μm。取包埋后的切片，室溫脫蠟、水化，熱抗原修復，用3%過氧化氫滅活內源酶活性，封閉非特異性位點后，一抗4 ℃孵育過夜。選用神經核抗原(NeuN)和膠質纖維酸性蛋白(GFAP)的一抗分別標記神經元和星型膠質細胞。復溫、清洗，孵二抗，滴加DAB溶液，顯微鏡下觀察，染色合適即用自來水沖洗終止染色，蘇木素復染1～2 min，細胞核變藍色時終止，1%鹽酸酒精分化3 s，乙醇、二甲苯梯度脫水，晾干片子后滴加適量中性樹膠封片，蓋上蓋玻片，顯微鏡下拍照。

1.4.6 qPCR檢測 將剩余的斑馬魚在冰上快速取腦，每個樣品加500 μL的Trizol進行勻漿，加100 μL氯仿4 ℃ 12 000×g離心15 min后分層，取上層清液加入等體積異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌，DEPC水溶解得到樣品總RNA。根據反轉錄試劑盒說明書實驗步驟，將RNA反轉錄成cDNA，凍存于-80 ℃冰箱。再根據qPCR試劑盒說明書，對淀粉樣前體蛋白(APP)、β-分泌酶(BACE1)、γ-分泌酶(γ-Secretase)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、核因子E2相關因子2(Nrf2)、Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白-1(Keap1)的mRNA進行相對定量分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4.7 Western blot檢測

1.4.7.1 蛋白質提取 取Trizol、氯仿混合分層后的下層紅色水相，加入0.3 mL無水乙醇，4 ℃ 2 000×g離心5 min，吸取上層酚醇有機相，加1.5 mL異丙醇，4 ℃ 12 000×g離心10 min，沉淀即為蛋白。用洗滌液2 mL(鹽酸胍溶于95%乙醇中，濃度為0.3 mol/L)清洗沉淀3次。每次清洗先將沉淀保留于清洗液中20 min，后在4 ℃ 7 500×g離心5 min。然后將沉淀真空干燥5～10 min，溶解于1%SDS中，50 ℃水浴，用Tip頭反復吹打助溶，不溶物在4 ℃ 10 000×g離心10 min后去除。

1.4.7.2 蛋白表達檢測 用BCA法測定蛋白濃度，配平，加入4×樣品緩沖液，95 ℃變性5～10 min。分別配置8%的分離膠和5%濃縮膠，上樣量為20 μg；80 V電泳30 min后，120 V 1.5～2 h。電泳結束后，采用濕轉，100 V 120 min，將蛋白轉移至PVDF膜上。轉膜結束后用5%脫脂奶粉封閉2 h，TBS-T清洗3次，每次5 min。隨后用5%脫脂奶粉稀釋一抗，BACE1(1∶1 000)、APP(1∶1 000)、Keap1(1∶2 000)、β-actin(1∶4 000)，5%BSA稀釋Nrf2(1∶2 000)，4 ℃孵育過夜，TBS-T清洗5次，每次5 min。用5%脫脂奶粉稀釋的二抗(1∶6 000)室溫孵育2 h，TBS-T清洗5次，每次5 min。按照ECL發(fā)光液說明書，將A液和B液1∶1混合，將條帶放入發(fā)光液中顯影。運用Image J對條帶面積和灰度值進行分析。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 T迷宮實驗

結果見表2。

表2 各組斑馬魚潛伏時間比較

注：與空白對照組相比，△P<0.05；與模型組相比，*P<0.05。

如表2所示，T迷宮實驗的前3 d，各組斑馬魚的潛伏時間無明顯差異。第4天起，與空白對照組相比，模型組的潛伏時間明顯延長(P<0.05)，陽性藥組、補腎益智方低劑量組和高劑量組之間潛伏時間無明顯差異；與模型組相比，陽性藥組、中藥組潛伏時間均有明顯縮短(P<0.05)，以高劑量組最為顯著。

2.2 免疫組化染色

斑馬魚腦組織免疫組化染色結果(圖2～3)顯示，模型組的端腦神經細胞數量較正常組明顯減少，排列紊亂，星型膠質細胞幾乎不可見；與模型組相比，高、低劑量的補腎益智方干預后，端腦神經元數量較模型組明顯增多、排列更有序，星型膠質細胞數量增加。運用Image J軟件對陽性區(qū)域面積及光密度進行分析(圖4)，與模型組相比，補腎益智方高劑量組斑馬魚端腦NeuN陽性區(qū)域總光密度顯著提高(P<0.01)，補腎益智方高、低劑量組斑馬魚端腦GFAP陽性區(qū)域總光密度顯著提高(P<0.05～0.01)。

2.3 ACHE和ChAT活力測定

結果見圖5，與模型組相比，陽性藥組和補腎益智方低、高劑量組ACHE活力顯著降低(P<0.05～0.01)，陽性藥組及補腎益智方高劑量組ChAT活力顯著增加(P<0.05～0.01)。

圖2斑馬魚腦組織神經元免疫組化染色

注：與空白對照組相比，△△P<0.01； 與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。
圖4斑馬魚腦組織免疫組化染色陽性區(qū)域光密度比較

2.4 補腎益智方對斑馬魚腦組織Aβ生成相關基因表達的影響

qPCR結果(圖6)表明，與空白對照組相比，模型組Aβ生成相關的appb、bace1、aph-1基因表達明顯增高(P<0.01)，陽性藥組、補腎益智方高劑量組與空白對照組之間無明顯差異。與模型組相比，陽性藥組appb、bace1表達明顯降低(P<0.05),補腎益智方高劑量組appb、bace1表達呈現極顯著的降低(P<0.01)；補腎益智方低劑量組對appb、bace1基因表達的影響不明顯，差異無統計學意義。與模型組相比，陽性藥組、補腎益智方高、低劑量組aph-1基因表達無明顯差異。

2.5 補腎益智方對斑馬魚腦組織氧化應激相關基因表達的影響

結果見圖7，與模型組相比，補腎益智方高劑量組sod、cat、nrf2基因表達顯著增加(P<0.01)，keap1表達顯著降低(P<0.01)。與空白對照組相比，模型組sod、cat的表達略高于空白對照組，與機體應激反應相關，陽性藥干預組的sod表達略低于模型組，差異無統計學意義。

2.6 補腎益智方對斑馬魚腦組織相關蛋白表達的影響

斑馬魚腦組織Western blot檢測結果如圖8所示，與模型組相比，經補腎益智方干預后，APP、BACE1、Nrf2、Keap1的蛋白表達均有顯著變化。其中，高劑量組APP蛋白表達與模型組相比顯著降低(P<0.05)，Nrf2蛋白表達顯著增高(P<0.01)，BACE1、Keap1蛋白表達顯著降低(P<0.01)。

3 討論

AD是嚴重威脅老年人健康的疾病之一，患者通常表現為腦中Aβ沉積、神經纖維纏結、乙酰膽堿含量降低、神經炎癥等。Aβ沉積是AD最為典型的病理改變，與淀粉樣前體蛋白(Amyloid precursor protein，APP)的代謝異常密切相關，β-分泌酶和γ-分泌酶是Aβ沉積的關鍵剪切酶[6-7]。β-分泌酶和γ-分泌酶的增加會加速APP分解，產生大量Aβ，引發(fā)一系列的病理改變，包括神經元凋亡、氧化應激反應等[8-9]。神經元凋亡是AD患者常見的腦部病理變化，常伴有星型膠質細胞數目減少、功能低下等。星型膠質細胞是腦內唯一具有糖原儲備功能的細胞，為神經元提供能量底物和還原當量，調節(jié)神經元活動[10]，并且對淀粉樣蛋白的清除有關鍵作用[11]。在AD的進程中，星型膠質細胞的衰減，不利于淀粉樣蛋白的清除，從而加重斑塊形成。AD的一系列病理改變會引起腦部的氧化應激反應，SOD和CAT是人體內清除氧自由基的主要酶，是機體對抗氧化應激反應的關鍵酶[12-13]，Nrf2是細胞氧化應激中的關鍵因子，通常與Keap1結合發(fā)揮作用，在發(fā)生氧化應激反應時，兩者解離活化[14]。在AD患者體內，這些因子往往表達異常，是機體抗氧化能力下降的表現。此外，乙酰膽堿的含量與AD的嚴重程度呈正相關[15]，因其檢測難度大，一般由ACHE和ChAT的活力來間接反映，ACHE是乙酰膽堿水解酶，ChAT是乙酰膽堿主要的合成酶，AD患者常表現為ACHE活力增加，ChAT活力降低[16-17]。AD是一種復雜的神經系統退行性疾病，針對單一靶點的治療難以取效，因此，在治療時，應盡可能兼顧各個靶點，減少Aβ生成、增加乙酰膽堿含量的同時，改善機體內環(huán)境，減輕氧化應激反應，才能有效改善AD。

斑馬魚是一種新型的模式動物，與人類基因高度相似，擁有主要的神經電生理系統，包括神經遞質受體、轉運蛋白和酶的合成代謝等，能模擬AD等復雜神經系統疾病，已成為AD研究中的新載體，具有簡便、高效等優(yōu)點。本實驗結合斑馬魚在藥物篩選中高通量的特點以及中藥復方多靶點多層面的優(yōu)勢，對補腎益智方干預AD的療效和可能的作用機制進行探究。

本實驗首先通過T迷宮實驗檢測斑馬魚的學習記憶功能，發(fā)現補腎益智方能夠縮短潛伏時間，有效改善斑馬魚的認知。為了更直觀地觀察補腎益智方對斑馬魚腦組織神經元和星型膠質細胞的作用，我們通過免疫組化染色，發(fā)現補腎益智方干預后，斑馬魚腦中神經元、星型膠質細胞的數量及陽性區(qū)域總光密度值顯著增加，說明補腎益智方能有效促進神經元的修復和再生，提高星型膠質細胞數目，從而增加腦內能量供應，促進神經元活動。

本實驗檢測了ACHE和ChAT酶的活力，發(fā)現補腎益智方干預AD斑馬魚后，有效地增加了ChAT活力，同時降低ACHE活力，一定程度上提高了斑馬魚腦中乙酰膽堿的含量。接著，運用qPCR技術對斑馬魚腦組織的appb、bace1、aph-1、sod、cat、nrf2、keap1基因表達水平進行了檢測。結果表明，補腎益智方組appb、bace1的表達顯著降低，說明補腎益智方能通過降低APP和β-分泌酶，來減少Aβ的產生。以往的研究表明，大部分β-分泌酶抑制劑在減少β-分泌酶表達的同時，會降低γ-分泌酶的表達，并通過Notch信號通路產生一定的副作用。而本實驗發(fā)現，補腎益智方的干預不會對γ-分泌酶的表達產生影響，一定程度上避免了經Notch信號通路產生的副作用。同時，補腎益智方還能通過增加sod、cat基因的表達，增強機體清除氧自由基的能力，同時增加nrf2的表達，誘導其與keap1結合，進入非活性狀態(tài)，達到抗氧化應激的作用。最后，通過Western blot法檢測相關蛋白的表達情況，與qPCR結果一致，補腎益智方能夠降低APP、BACE1的蛋白表達，增加Nrf2以結合Keap1，從而減少Keap1的表達。

綜上所述，補腎益智方能夠有效地改善AD斑馬魚的學習記憶能力，減少Aβ生成，減輕氧化應激反應，改善AD內環(huán)境，從而達到改善AD癥狀的作用。本研究豐富了補腎益智方的科學內涵，為中醫(yī)藥干預AD提供了依據。本實驗還存在著一些不足，斑馬魚作為一種新型的動物模型，商業(yè)化抗體較少，文中涉及的一些指標蛋白尚無法檢測，未來隨著斑馬魚的廣泛應用，將進行更為廣泛和深入的研究。