麻黃-甘草藥對抑制過敏性哮喘的效應(yīng)及機(jī)制初探

袁為遠(yuǎn)，魏盼，包凱帆，姚露，王霄彤，王思齊，鄭劼，洪敏，江國榮

(1．南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；2．江蘇省中藥藥效與安全評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023；3．南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 蘇州 215003；4．南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院·整合醫(yī)學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023)

過敏性哮喘是一種復(fù)雜的慢性炎癥性呼吸道疾病，目前約有3億人患有哮喘，且每年至少有25萬人死于這種疾病，嚴(yán)重威脅了公眾健康[1]。中藥在治療過敏性疾病中具有良好效果，其中麻黃-甘草藥對常用于治療過敏性疾病。藥對，又可稱為對藥，主要是由2味藥組成的配伍相對固定的藥物組合。麻黃-甘草藥對源自張仲景的《金匱要略》，包括小青龍湯、麻杏石甘湯等經(jīng)方中均巧施麻黃-甘草藥對，在臨床上廣泛用于風(fēng)寒感冒、過敏性哮喘等疾病的治療，且多用于緩解慢性阻塞性肺疾病及哮喘引起的氣道重塑[2]。本研究考察了麻黃-甘草藥對屋塵螨(HDM)誘導(dǎo)小鼠過敏性哮喘的作用，并對其機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料

1.1 藥物

麻黃為麻黃科植物草麻黃EphedrasinicaStaph.的干燥草質(zhì)莖(安徽廣印堂中藥股份有限公司，產(chǎn)地：內(nèi)蒙古，批號：20150302)；甘草為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根及根莖(山西萬輝制藥有限公司，產(chǎn)地：內(nèi)蒙古，批號：150302)，藥材經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)谷巍教授鑒定。硫酸沙丁胺醇片，購自江蘇亞邦愛普森藥業(yè)有限公司，批號：E181024。

1.2 動(dòng)物

BALB/c小鼠，雄性，SPF級，體質(zhì)量18～22 g，購于南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場，許可證號：SCXK(蘇)2017-0001。小鼠飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫：22～25 ℃，濕度：50%～60%，自由飲食飲水。實(shí)驗(yàn)步驟及造模方法均經(jīng)由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會批準(zhǔn)，倫理審查號：ACU171007。

1.3 試劑

HDM(批號：322781)購自美國Greer Laboratory公司,乙酰甲膽堿(批號：1396364)購自美國Sigma公司；4%中性多聚甲醛通用型組織固定液(批號：1808266)購自biosharp公司；小鼠IgE ELISA Kit(批號：156530014)，IL-4 ELISA Kit(批號：167465001)，IL-5 ELISA Kit(批號：4277363)，IL-13 ELISA Kit(批號：4331312)均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；BCA蛋白定量試劑盒(批號：YWB002)購自翼飛雪生物科技公司；E-cadherin抗體(批號：610181)購自美國BD公司；N-cadherin抗體(批號：2018-1-AP)，α-SMA抗體(批號：14395-1-AP)，Vimentin抗體(批號：10366-1-AP)均購自美國Proteintech公司；ECL發(fā)光液(批號：1705102)購自美國Millipore公司；Masson染液(批號：20161031)，嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)液(批號：20170605)購自南京建成科技有限公司；小鼠二步法免疫組化檢測試劑盒(批號：K183314A)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.4 儀器

無創(chuàng)全身體積描記系統(tǒng)(WBP)-肺功能檢測系統(tǒng)(法國EMKA公司，型號：gyd-003)；電子天平(瑞典METTLER TOLEDO公司，型號：PL203)；Countstar細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(上海睿鈺生物科技有限公司，型號：IC1000)；BioStack Ready酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司，型號：SyneRgy 2)；冷凍離心機(jī)(美國BECKMAN公司，型號：GS-15R)；倒置熒光顯微鏡(德國ZEISS，型號：AxionA1)；光學(xué)顯微鏡(江南光電集團(tuán)股份有限公司，型號：XSP-18B)；包埋儀(德國Leica公司，型號：EG1150H)；切片機(jī)(德國Leica公司，型號：EG1150H)；活細(xì)胞成像分析系統(tǒng)(德國ZEISS公司，型號：Axio vert A1)。

2 方法

2.1 麻黃-甘草藥對提取物的制備

稱取麻黃飲片3.0 kg，甘草飲片1.5 kg，按2∶1的比例[3]先加入少量無水乙醇充分浸潤，再加入8倍量無水乙醇加熱煮沸后回流提取2 h。趁熱使用3層紗布過濾，濾渣再用8倍量三蒸水加熱回流提取2 h。趁熱過濾，合并2次濾液，減壓濃縮至稠浸膏。最后，冷凍干燥制成干粉，計(jì)算得到1 g干粉相當(dāng)于6.34 g生藥。該提取物下文中簡稱MG。

2.2 造模及給藥方案

SPF級雄性BALB/c小鼠56只，根據(jù)體質(zhì)量分層隨機(jī)分為4組，每組14只，分別為空白組、模型組、沙丁胺醇(Sal)組、MG組，其中每組各取6只(共24只)用于檢測小鼠氣道反應(yīng)性。除空白組外其余3組于第0、7、14天3次腹腔注射0.1 mL的HDM溶液(濃度為0.5 mg/mL)致敏，第21～23天連續(xù)3 d滴鼻10 μL的HDM溶液(濃度為2.5 mg/mL)激發(fā)，空白對照小鼠給予等體積PBS溶液。MG組為全程給藥，按生藥量7.02 g/kg灌胃給藥，Sal組于第17天開始給藥，連續(xù)給藥7 d，按0.78 mg/kg灌胃給藥，給藥體積均為0.1 mL/10 g。

2.3 氣道高反應(yīng)性測定

各組小鼠在最后1次激發(fā)24 h后測定氣道反應(yīng)性。將小鼠放入體描箱，每次可同時(shí)測定2只小鼠，讀取呼氣間歇(Penh)基礎(chǔ)值后，小鼠分別接受乙酰甲膽堿的霧化，乙酰甲膽堿的濃度從低到高依次為0、6.25、12.5、25、50 mg/mL，霧化劑量為每次300 μL，時(shí)間為90 s，每個(gè)濃度霧化完成之后，觀察到小鼠是否存在氣促、抓頭、煩躁等缺氧表現(xiàn)，然后記錄5 min Penh數(shù)值，取平均值比較各組小鼠的氣道反應(yīng)性。

2.4 小鼠肺組織病理學(xué)及免疫組織化學(xué)檢測

取未灌洗過的左上葉肺組織，使用4%的中性多聚甲醛溶液固定48 h，石蠟包埋后切成厚度為5 μm的薄片備用。各組切片分別進(jìn)行HE染色和Masson染色，200倍顯微鏡下觀察小鼠肺部炎癥浸潤及膠原沉積情況。并且各切片根據(jù)免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行操作后，在200倍顯微鏡下觀察E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、α-SMA和TGF-β1的表達(dá)，使用Mantra圖像分析軟件對以上各目標(biāo)蛋白進(jìn)行光密度(OD)半定量分析。

2.5 嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(EOS)和血清IgE測定

小鼠末次HDM滴鼻激發(fā)24 h后，眼眶后靜脈叢采血，將20 μL全血與380 μL嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)液混合均勻，顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。將全血室溫靜置1 h后，3 500 r/min離心15 min，吸取血清，血清用PBS稀釋50倍，按小鼠IgE ELISA試劑盒操作步驟進(jìn)行測定。

2.6 BALF和肺中細(xì)胞因子檢測

小鼠BALF液收集：眼眶后靜脈叢采血后，將小鼠麻醉處理，打開其胸腔并結(jié)扎左肺(結(jié)扎的肺部用于病理及細(xì)胞因子的檢測)，將小鼠頸部肌肉向兩側(cè)分離并暴露氣管，在氣管上剪一個(gè)小口用于22 G針頭進(jìn)行氣管插管，用注射器分2次分別注入0.3 mL 4 ℃ PBS進(jìn)行灌洗，重復(fù)3次，并收集灌洗液。將BALF灌洗液以1 000 r/min，4 ℃離心10 min，吸取上清液移至1.5 mL EP管中，-20 ℃保存用于測定BALF中的細(xì)胞因子。

小鼠肺勻漿制備：取未灌洗小鼠肺組織樣本稱質(zhì)量，加入4 ℃ PBS溶液量為肺組織樣本質(zhì)量的20倍，肺組織和4 ℃ PBS加入勻漿器中，研磨成5%的肺勻漿，靜置10 min后，3 500 r/min，4 ℃離心15 min，吸取上清液儲存于-20 ℃凍存待測。

根據(jù)ELISA試劑盒說明書的操作方法，分別檢測小鼠BALF和肺勻漿中的IL-4、IL-5和IL-13的表達(dá)水平，使用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白校正，pg/mg為最終表示單位。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 MG對HDM誘導(dǎo)的哮喘模型小鼠氣道反應(yīng)性的影響

如圖1所示，在乙酰甲膽堿6.25、12.5、25、50 mg/mL濃度的霧化下，模型組Penh值相較于空白組顯著升高(P<0.05～0.01)，MG組小鼠Penh值相比于模型組顯著性降低(P<0.05～0.01)。

3.2 MG對HDM誘導(dǎo)的過敏性哮喘模型炎癥反應(yīng)的影響

與空白組比較，HDM誘導(dǎo)的哮喘模型組小鼠全血EOS，血清IgE，BALF和肺Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13的表達(dá)均明顯升高(P<0.05～0.01)。給予Sal或MG后，均能不同程度地降低模型小鼠全血EOS，血清IgE，BALF和肺IL-4、IL-5、IL-13的水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05～0.01)。結(jié)果見表1～3。

表1 MG對HDM誘導(dǎo)的過敏性哮喘模型EOS及IgE水平的影響

注：與空白組比較,##P<0.01；與模型組比較,**P<0.01。

表2 MG對HDM誘導(dǎo)的過敏性哮喘模型BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平的影響

注：與空白組比較,#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較,*P<0.05，**P<0.01。

3.3 MG對HDM誘導(dǎo)的哮喘模型小鼠肺組織病理變化的影響

HE結(jié)果顯示，模型組小鼠肺組織支氣管周圍有明顯的炎性細(xì)胞浸潤與黏液的分泌且伴隨著支氣管壁的增厚；相比于模型組，Sal組及MG組支氣管周圍的黏液分泌及炎性細(xì)胞顯著減少。Masson染色結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組小鼠肺部氣道細(xì)胞外沉積顯著增加，Sal組及MG組均能有效抑制哮喘小鼠氣道細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。見圖2。

表3 MG對HDM誘導(dǎo)的過敏性哮喘模型肺IL-4、IL-5和IL-13水平的影響

注：與空白組比較,#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較,**P<0.01。

3.4 MG對HDM誘導(dǎo)的哮喘模型小鼠支氣管上皮異常間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及氣道重塑的影響

結(jié)果見圖3和表4。與空白組比較，模型組支氣管上皮的E-cadherin分布紊亂且表達(dá)明顯減少(P<0.01)，N-cadherin和Vimentin表達(dá)明顯增加(P<0.01)；在給予Sal和MG后，E-Cadherin的表達(dá)均有增加的趨勢，N-cadherin的表達(dá)明顯減少(P<0.01)，Sal亦可明顯下調(diào)Vimentin的表達(dá)(P<0.01)，MG對Vimentin的表達(dá)也有下調(diào)趨勢。此外，本文還考察了MG對支氣管平滑肌的影響，相對于空白組，α-SMA的表達(dá)明顯增加(P<0.01)，Sal及MG組α-SMA表達(dá)均明顯降低(P<0.05)。

表4 MG對HDM誘導(dǎo)的過敏性哮喘模型肺組織氣道重塑相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

注：與空白組比較,##P<0.01；與模型組比較,*P<0.05，**P<0.01。

3.5 MG對HDM誘導(dǎo)的哮喘模型小鼠TGF-β1的影響

結(jié)果見表5。與空白組比較，模型組小鼠BALF與肺TGF-β1水平顯著升高(P<0.05～0.01)，而血清TGF-β1無明顯變化。肺局部的TGF-β1呈現(xiàn)高濃度，在給予Sal及MG之后，肺局部TGF-β1的表達(dá)有不同程度的降低(P<0.05～0.01)，而對于BALF的TGF-β1，各給藥組TGF-β1水平均呈現(xiàn)下降趨勢。免疫組化結(jié)果如圖4和表6所示，相比于空白組，模型組TGF-β1的表達(dá)明顯增加，在給予Sal及MG之后，TGF-β1的表達(dá)均有不同程度的降低(P<0.01)。

表5 MG對HDM誘導(dǎo)的過敏性哮喘模型BALF、肺和血清TGF-β1表達(dá)的影響

注：與空白組比較,#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較,*P<0.05，**P<0.01。

組別TGFβ1空白組0.045±0.008模型組0.083±0.005##Sal組0.038±0.009**MG組0.051±0.004**

注：與空白組比較,##P<0.01；與模型組比較,**P<0.01。

4 討論

過敏性哮喘是一種以氣道高反應(yīng)性和Th2型細(xì)胞因子分泌增多為特征的慢性呼吸道炎癥性疾病[4]。臨床上用于治療哮喘的藥物如糖皮質(zhì)激素、β2受體激動(dòng)劑等[5]雖然能緩解哮喘癥狀，但仍無法解決其反復(fù)發(fā)作的問題[6]。中醫(yī)藥防治過敏性疾病的有效性及其減少反復(fù)發(fā)作、減輕發(fā)作程度方面的特點(diǎn)與優(yōu)勢已被長期的臨床實(shí)踐所證實(shí)[7-8]。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)MG能夠顯著抑制由異硫氰酸熒光素誘導(dǎo)的Th2型變應(yīng)性接觸性皮炎的癥狀[9]。本研究利用HDM誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型來考察MG對過敏性哮喘的作用，結(jié)果表明，在HDM誘導(dǎo)的過敏性哮喘模型中，伴隨著EOS增多，血清IgE異常，Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13分泌增多以及氣道高反應(yīng)性等特征。給予MG干預(yù)之后，可顯著抑制EOS、肺組織炎癥浸潤以及Th2型細(xì)胞因子的分泌，改善小鼠氣道高反應(yīng)性，提示MG對過敏性哮喘的癥狀具有良好治療作用。

氣道重塑因發(fā)病機(jī)制復(fù)雜與誘導(dǎo)因素繁多而成為哮喘難以根治的主要因素[10]。氣道重塑的病理構(gòu)成主要是上皮功能與結(jié)構(gòu)的改變[11]，且氣道上皮受損和修復(fù)機(jī)制與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的激活密不可分[12]。EMT的過程是指在外界因素誘導(dǎo)后上皮細(xì)胞的極性與粘附性丟失，表現(xiàn)為上皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白如E-cadherin等的表達(dá)下調(diào)，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白如N-cadherin、Vimentin、α-SMA等的表達(dá)上調(diào)，最終導(dǎo)致上皮屏障的完整性缺失[13]。本研究表明，給予MG后能夠顯著下調(diào)N-cadherin和α-SMA的表達(dá)，且能一定程度恢復(fù)E-cadherin的表達(dá)。提示MG能夠抑制EMT的進(jìn)程，這可能是其緩解哮喘發(fā)生的作用機(jī)制之一。

TGF-β1目前被認(rèn)為是誘導(dǎo)EMT發(fā)生的主要因素之一[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，HDM誘導(dǎo)的過敏性哮喘模型肺組織支氣管局部TGF-β1呈現(xiàn)高表達(dá)，這也可能是導(dǎo)致支氣管上皮異常間質(zhì)轉(zhuǎn)化的誘因之一。MG能夠有效抑制肺TGF-β1的表達(dá)，而對BLAF中TGF-β1未見明顯影響，提示MG能夠通過降低肺部TGF-β1的表達(dá)從而緩解哮喘氣道重塑的發(fā)生與發(fā)展。