手術(shù)中一種新的細(xì)胞治療方法——內(nèi)皮祖細(xì)胞

李 潔 李 萍 閻春生 哈小琴

1963年，首次報(bào)道血液中可能存在內(nèi)皮細(xì)胞，而后在心臟移植患者的冠狀動脈內(nèi)壁發(fā)現(xiàn)了受體來源的內(nèi)皮細(xì)胞，提示受體血液中的內(nèi)皮細(xì)胞定居于移植物并參與血管壁的構(gòu)建，再次證明移植物表面存在內(nèi)皮細(xì)胞，而這些內(nèi)皮細(xì)胞只可能來源于血液。1997年，Asahara等[1]首次證明循環(huán)外周血中存在能分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞,并稱之為血管內(nèi)皮祖細(xì)胞。內(nèi)皮祖細(xì)胞來源于骨髓,它們進(jìn)入循環(huán)血,在血管移植物上分化為內(nèi)皮細(xì)胞[2]。內(nèi)皮祖細(xì)胞是在缺氧等病理?xiàng)l件下從骨髓中募集的，在缺血組織的新生血管形成中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。目前已經(jīng)建立了兩種主要的EPCs亞型：所謂的“早期”EPCs(隨后稱為早期EPCs)和后期衍生的EPCs(晚期EPCs)[3]。在體外培養(yǎng)過程中，根據(jù)其生物學(xué)特性和外觀可對其進(jìn)行分類?！霸缙凇盓PCs出現(xiàn)在外周血來源的單核細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞特異性培養(yǎng)基中培養(yǎng)后不到1周，而在2～3周后可以發(fā)現(xiàn)晚期的EPCs。晚期EPCs被認(rèn)為主要是通過其分化成成熟內(nèi)皮細(xì)胞的能力直接參與新生血管的形成，而早期EPCs將各種血管生成因子表達(dá)為內(nèi)源性貨物，以旁分泌的方式促進(jìn)血管生成，在心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)過程中，各種因素控制EPCs向血管形成區(qū)域的歸巢。

EPCs在人血液中循環(huán)，具有分化為內(nèi)皮細(xì)胞的能力，它們參與血管生成，能夠以各種方式將炎癥和缺血/再灌注損傷(I/R)造成的損害降到最低[4]。例如，EPCs顯示細(xì)胞內(nèi)過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶或錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutases, MnSOD)等抗氧化酶水平升高。抗氧化應(yīng)激能力的增強(qiáng)使EPCs能夠在缺血損傷后活性氧(reactive oxygen species, ROS)升高的微環(huán)境中發(fā)揮作用。EPCs的數(shù)量可能與血管修復(fù)有關(guān)，循環(huán)EPCs數(shù)量的減少預(yù)示著心血管事件的發(fā)生。然而，EPCs的明確定義還沒有找到,到目前為止，EPCs還沒有特異性的細(xì)胞表面標(biāo)記或一致的表型，這些細(xì)胞在外周血中非常罕見。另外，EPCs主要受HIF-1、VEGF、SDF等多種細(xì)胞因子的動員歸巢至特定部位并入血管內(nèi)皮，受多種信號系統(tǒng)的調(diào)節(jié)進(jìn)行分化完成血管新生[5]。各種治療手段亦會影響血EPCs水平的改變。研究不同治療手段對EPCs的影響不僅可以預(yù)測患者治療后的轉(zhuǎn)歸而且可以指導(dǎo)制定聯(lián)合治療策略，掌握不同治療手段對EPCs的不同影響，有助于權(quán)衡聯(lián)合治療方案。

一、內(nèi)皮組細(xì)胞與經(jīng)皮冠狀動脈介入治療術(shù)

EPCs在心血管系統(tǒng)和經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention, PCI)術(shù)后冠狀動脈再狹窄的病理生理學(xué)中的作用是有爭議的。盡管研究描述了EPCs在動脈粥樣硬化過程中的保護(hù)作用，但在再狹窄中，EPCs、內(nèi)皮修復(fù)和誘導(dǎo)新內(nèi)膜增殖之間存在復(fù)雜的關(guān)系，因此，尚不清楚EPCs在這種情況下是否具有有益或有害的影響，有研究者為了探究經(jīng)皮冠狀動脈介入治療支架置入術(shù)前后循環(huán)EPCs與冠狀動脈再狹窄和不良心血管事件的關(guān)系，在PCI術(shù)前及術(shù)后1天取靜脈血，通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行免疫表型分析，總白細(xì)胞計(jì)數(shù)和EPCs鑒定[6]。結(jié)果表明，基線EPCs計(jì)數(shù)與年齡和冠狀動脈疾病的程度呈負(fù)相關(guān)，與另一項(xiàng)研究結(jié)果相似[7]。

而在這項(xiàng)研究中，約2/3的患者PCI術(shù)后EPCs計(jì)數(shù)下降，且EPCs計(jì)數(shù)與PCI術(shù)后預(yù)后無顯著相關(guān)性。這與其他研究描述的由于PCI導(dǎo)致內(nèi)皮損傷進(jìn)而致使EPCs動員從而使EPCs計(jì)數(shù)增加有所不同，而對于這些不同的結(jié)果，研究者也表明可以通過研究的EPCs亞群的差異以及PCI引起的血管損傷程度的差異來解釋[7]。EPCs的研究具有挑戰(zhàn)性，目前還沒有完全準(zhǔn)確定義EPCs的標(biāo)準(zhǔn)，所以導(dǎo)致了EPCs不同亞群的鑒定。同時(shí)，內(nèi)皮祖細(xì)胞的動員和功能受到心血管危險(xiǎn)因素、伴隨疾病和PCI損傷內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量的影響，而這些影響又難以控制，因此，需要繼續(xù)研究，以闡明EPCs在PCI術(shù)后再狹窄和預(yù)后中的作用。

二、內(nèi)皮祖細(xì)胞與心臟手術(shù)

手術(shù)后外周血中EPCs的突增可能是多因素的，涉及氧化應(yīng)激損傷、缺氧和炎性反應(yīng)，手術(shù)后已知的用于募集EPCs的化學(xué)引誘物如MIF、CXCL12和CXCL8水平明顯增加[8]。當(dāng)將這些發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化回體外實(shí)驗(yàn)時(shí)，結(jié)果表明，在體外測量的生理濃度下，既沒有CXCL12也沒有CXCL8介導(dǎo)的EPCs遷移效應(yīng)，使用所描述的EPCs分離模型和隨后的遷移測定，MIF被鑒定為EPCs遷移的主要介質(zhì)。在這方面，實(shí)驗(yàn)證明MIF和VEGF對缺氧條件下EPCs遷移的影響最大。但是，VEGF的測量顯示VEGF在術(shù)后的血液濃度中無顯著變化，這可能和部分手術(shù)中VEGF與肝素的結(jié)合有關(guān)。因此，MIF可能在心臟手術(shù)患者的EPCs募集中在血管生成趨化因子中起主導(dǎo)作用，并且可能通過將EPCs運(yùn)輸?shù)綋p傷部位來啟動并促進(jìn)心肌缺血再灌注后的愈合過程。MIF水平在心肌缺血再灌注后立即增加，MIF介導(dǎo)的對EPCs募集的影響是否可能影響心臟重塑和血管生成仍然是推測，這對預(yù)防心肌缺血再灌注后的心力衰竭具有重要意義[9]。

三、內(nèi)皮祖細(xì)胞與減肥手術(shù)

尚不清楚在肥胖癥中毛細(xì)血管密度或循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量是否減少，或者是否也存在小血管的纖維化。此外，從未評估過減輕重量對這些參數(shù)的可能影響。因此，一項(xiàng)研究調(diào)查了25例嚴(yán)重肥胖患者的EPCs和毛細(xì)血管密度，均進(jìn)行了減肥手術(shù)，18例血壓正常的強(qiáng)壯(able-bodied)患者和12例高血壓強(qiáng)壯(able-bodied)患者作為對照。所有患者在減肥手術(shù)期間都接受了皮下脂肪活檢。在5例患者中，在腹部整形術(shù)的外科手術(shù)期間，約1年后持續(xù)減輕體重后獲得第2次活檢。肥胖導(dǎo)致EPCs和毛細(xì)血管密度降低，體重減輕后EPCs顯著增加，肥胖患者的血管膠原含量明顯增加。在血壓正常的肥胖患者和高血壓肥胖患者之間沒有觀察到血管膠原的顯著差異。在顯著減輕體重后，膠原蛋白含量幾乎正?；Ｔ诟鹘M之間及減肥前后的應(yīng)力應(yīng)變關(guān)系均無差異。綜上所述，數(shù)據(jù)表明肥胖導(dǎo)致微血管稀疏，肥胖患者的EPCs明顯減少。減肥手術(shù)引起的顯著體重減輕似乎能顯著改善EPCs的數(shù)量，但不能改善毛細(xì)血管稀疏，無論血壓升高與否，肥胖患者都存在明顯的皮下小阻力動脈纖維化，持續(xù)的減肥手術(shù)可誘導(dǎo)微血管纖維化幾近恢復(fù)[10]。

四、內(nèi)皮祖細(xì)胞與骨科手術(shù)

一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)在大鼠股骨截骨模型中評估了局部使用體外擴(kuò)張EPCs對血管生成的刺激和骨折部位骨愈合的促進(jìn)作用，根據(jù)放射學(xué)、組織學(xué)和顯微CT結(jié)果，EPCs治療組與對照組比較，局部EPCs治療可顯著促進(jìn)大鼠股骨節(jié)段性骨缺損的骨再生。在一項(xiàng)類似的研究中，同一研究小組報(bào)道局部EPCs治療對生物力學(xué)穩(wěn)定性有良好的影響[11]。有報(bào)道表明，外周血來源的EPCs有助于體外間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的成骨分化，而MSCs支持EPCs的增殖[12]。另外有實(shí)驗(yàn)在體外共培養(yǎng)系統(tǒng)中研究了骨髓EPCs (BM-EPCs)與MSCs的相互作用，其數(shù)據(jù)表明，BM-EPCs和MSCs之間通過旁分泌和直接細(xì)胞接觸機(jī)制發(fā)生交聯(lián)，從而調(diào)節(jié)血管生成反應(yīng)[13]。在大鼠模型研究中，觀察到EPCs與間充質(zhì)干細(xì)胞之間的協(xié)同作用，并認(rèn)為EPCs在新生血管形成的初始階段對完全骨再生至關(guān)重要，而EPCs治療的積極效果也已在韌帶組織再生中得到證實(shí)[14]。另有研究探討了局部移植的人外周血CD34+細(xì)胞對內(nèi)側(cè)副韌帶損傷愈合的影響，與對照組比較，通過肉眼觀察，組織學(xué)和生物力學(xué)評估顯示CD34+細(xì)胞移植組的韌帶愈合顯著增強(qiáng)，推測循環(huán)人CD34+細(xì)胞的局部移植可通過新血管形成促進(jìn)有利環(huán)境來增強(qiáng)韌帶愈合過程[15]?；隗w外和動物模型EPCs研究的良好結(jié)果，臨床試驗(yàn)開始。作為一項(xiàng)臨床試驗(yàn)的試點(diǎn)病例，有研究報(bào)道了將自體外周血CD34+細(xì)胞移植到脛骨骨折不愈合患者體內(nèi)的結(jié)果，骨折經(jīng)細(xì)胞移植治療12周后實(shí)現(xiàn)臨床及影像學(xué)愈合，并且未發(fā)生嚴(yán)重的短期并發(fā)癥[16]。EPCs具有向內(nèi)皮細(xì)胞分化、參與新血管構(gòu)建等獨(dú)特功能，可塑性強(qiáng)，可為骨和韌帶組織工程提供治療方案。在不久的將來，可能會吸引更多的研究者來探索這些細(xì)胞在骨科手術(shù)中的潛力。

五、內(nèi)皮祖細(xì)胞與腹腔鏡手術(shù)

癌癥的進(jìn)展在很大程度上依賴于新生血管的形成，循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞具有體外形成完整血管結(jié)構(gòu)的能力，在腫瘤血管生成中發(fā)揮重要作用，手術(shù)損傷可導(dǎo)致動物模型中EPCs的動員，這可能對癌癥患者的預(yù)后產(chǎn)生負(fù)面影響。有實(shí)驗(yàn)研究了20例接受開腹手術(shù)治療各種形式的腹部癌癥的患者，以及20例年齡和性別都與其相匹配的健康對照組[17]。術(shù)前、術(shù)后第1天和第2天分別測定外周血單個(gè)核細(xì)胞中循環(huán)EPCs的數(shù)量，其定義為CD34+/KDR+細(xì)胞。與基線值比較，手術(shù)導(dǎo)致循環(huán)EPCs水平在第1天和第2天顯著升高，對照組中EPCs水平無變化。手術(shù)組的變化幅度明顯大于對照組。接受非腫瘤性疾病腹腔鏡手術(shù)的受試者術(shù)后EPCs水平也有所增加?；颊呤中g(shù)組和健康對照組的主要特征為：在年齡、性別分布、體重、血脂和血壓等方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而手術(shù)干預(yù)后癌癥患者的白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血漿C反應(yīng)蛋白水平明顯升高，總、高密度脂蛋白膽固醇、血清甘油三酯下降，EPCs計(jì)數(shù)的變化與年齡、體重、血脂參數(shù)、血壓或術(shù)后C反應(yīng)蛋白水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，手術(shù)干預(yù)時(shí)間是唯一與EPCs計(jì)數(shù)變化有顯著直接關(guān)系的因素。本研究證明了腹腔鏡手術(shù)干預(yù)后，循環(huán)的CR34+/KDW細(xì)胞在腹部腫瘤患者中迅速增加。綜上所述，接受選擇性腹腔鏡手術(shù)的癌癥患者術(shù)后EPCs增加，而手術(shù)應(yīng)激誘導(dǎo)的EPCs動員對腫瘤和腫瘤轉(zhuǎn)移生長的潛在不良影響需要在未來的研究中加以解決。

六、展 望

介入手術(shù)后，EPCs被動員通過血液循環(huán)向受損傷部位和缺血組織聚集從而發(fā)揮其生理作用，參與胚胎血管形成、出生后血管形成、血管創(chuàng)傷后血管愈合、缺血性疾病血管再生等。EPCs的數(shù)量反映了修復(fù)內(nèi)皮和血管損傷的內(nèi)源性能力。另外，EPCs的數(shù)量還與高血壓、糖尿病、血脂異常、吸煙、年齡等危險(xiǎn)因素呈負(fù)相關(guān)，與心血管疾病發(fā)生率和病死率有關(guān)[18～21]。然而，EPCs的研究還未完全，有必要進(jìn)一步研究EPCs的不同亞型，并評估其在人類疾病中的功能作用，使其在各類手術(shù)中的進(jìn)一步研究成為可能，為外科醫(yī)生提供新的治療方式。