納米羥基磷灰石抗腫瘤作用的研究進(jìn)展

何佳穎 張雨凇 覃文聘 牛麗娜 焦 凱

癌癥是威脅全球公共健康的主要原因之一，其發(fā)生率還在持續(xù)增加，每年新增病例超過1000萬例[1]。目前，癌癥的常規(guī)治療僅限于化療、放療和手術(shù)。然而化療和放療往往對(duì)正常細(xì)胞有嚴(yán)重的不良反應(yīng)。手術(shù)雖可以完全切除原發(fā)腫瘤和可見的轉(zhuǎn)移，但腫瘤通過微轉(zhuǎn)移侵襲鄰近組織或擴(kuò)散到遠(yuǎn)處組織往往限制了其療效[2]。近年來，基于羥基磷灰石性質(zhì)的研究飛速發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)羥基磷灰石納米顆粒(hydroxyapatite nanoparticle，nHAP)可以負(fù)載基因、蛋白、藥物等進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，從而影響細(xì)胞的分化以及基因的表達(dá)[3]。此外，nHAP本身也具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用。與傳統(tǒng)的化療比較，使用nHAP治療可以有效地抑制腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，而不會(huì)損傷正常細(xì)胞，為腫瘤治療做出了巨大貢獻(xiàn)。然而，亦有文獻(xiàn)指出，一定濃度的nHAP可促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移并促進(jìn)其惡性潛能[4]。

因此，本文從nHAP對(duì)腫瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和功能的影響、nHAP形成礦化膠原纖維防止腫瘤侵襲展開綜述，并對(duì)nHAP促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及其惡性潛能的風(fēng)險(xiǎn)加以分析，為nHAP在腫瘤治療領(lǐng)域中的應(yīng)用提供參考和借鑒。

一、nHAP

1.nHAP概況:HAP是一種天然的磷灰石礦物，其分子式為Ca5(PO4)3(OH)，主要存在于脊椎動(dòng)物的骨、牙齒等硬組織中。HAP屬六方晶系，其結(jié)構(gòu)為六角柱體，具有較好的穩(wěn)定性。但是其本身容易團(tuán)聚形成較大的晶體，使得其生物學(xué)性能下降[5]。合成納米級(jí)HAP，使其具有較大的比表面積，并且其生物相容性和生物活性均優(yōu)于醫(yī)用鈦、硅及碳材料等植入醫(yī)用材料，可作為一種骨骼或牙齒的誘導(dǎo)因子，應(yīng)用于硬組織修復(fù)及骨填充[6]。此外，nHAP對(duì)DNA和蛋白質(zhì)具有高親和力，常用于蛋白質(zhì)層析實(shí)驗(yàn)[7]。

2.nHAP制備方法：nHAP的制備方法眾多，主要分為干法和濕法兩類[8]。干法合成相對(duì)較少，主要采用固相法；濕法合成主要包括：水熱合成法、化學(xué)沉淀法、微乳液法等。其中nHAP較為普遍的制備方法是水熱合成法和化學(xué)沉淀法。水熱合成法比較環(huán)保且成本較低，但對(duì)設(shè)備要求較高，需要耐高溫、高壓的密閉容器。該方法通常采用Ca(NO3)2和(NH4)2HPO4作為原料，在一定的pH值和較高的溫度與壓力的條件，鈣鹽和磷酸鹽在水溶液中反應(yīng)將合成nHAP，并可通過控制水熱條件得到不同的納米晶體物相。

化學(xué)沉淀法因其實(shí)驗(yàn)條件簡(jiǎn)單、成本較低，是合成納米材料常用的方法之一。將不同的含Ca和P的化合物在水溶液中發(fā)生沉淀反應(yīng)，即可得到HA，但其顆粒尺寸分布范圍廣且顆粒分散度低。在此基礎(chǔ)上使用添加劑改性或冷凍干燥可減小顆粒尺寸及改善顆粒分散度，得到nHAP。

二、nHAP對(duì)腫瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和功能的影響

Han等[9]研究了nHAP對(duì)正常和腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的不同抑制作用及其機(jī)制。將nHAP直接注入裸鼠移植瘤中，可使腫瘤體積縮小50%以上，感染裸鼠的存活時(shí)間也明顯增長(zhǎng)。研究表明，nHAP的抗腫瘤作用主要是通過抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成來實(shí)現(xiàn)的。由于其對(duì)核糖體的高親和力，降低了mRNA與核糖體的結(jié)合，從而抑制蛋白質(zhì)的合成，影響細(xì)胞增殖[10]。此外，相較其他納米材料，nHAP具有細(xì)胞毒性低的優(yōu)點(diǎn)[11]。如碳納米管和金屬氧化物納米材料可以從其表面釋放活性氧(ROS)，從而促進(jìn)細(xì)胞死亡，然而這種療法在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)對(duì)于正常細(xì)胞也有相同毒性。Han等[12]研究顯示，負(fù)責(zé)活性氧產(chǎn)生和清除的關(guān)鍵酶琥珀酸脫氫酶和超氧化物歧化酶的活性在nHAP處理后顯著降低，因此nHAP對(duì)于正常細(xì)胞殺傷作用小，有望為癌癥治療提供安全有效的替代方案。

在nHAP的體外實(shí)驗(yàn)中，Yin等[13]研究了以Bel-7402肝癌細(xì)胞作為單細(xì)胞懸液與nHAP的相互作用。其通過倒置顯微鏡觀察到，nHAP處理Bel-7402單細(xì)胞懸液24h后，Bel-7402細(xì)胞在培養(yǎng)基中仍呈均勻分布，無細(xì)胞貼壁。相反，對(duì)照組的細(xì)胞都已黏附。這一結(jié)果表明，隨著腫瘤細(xì)胞唾液酸殘基對(duì)其表面糖蛋白酸化程度的增加，其表面的負(fù)電荷也隨之增加，使表面帶正電荷的nHAP更容易吸附腫瘤細(xì)胞。nHAP包被Bel-7402細(xì)胞可顯著影響其細(xì)胞膜的功能，從而減少Bel-7402細(xì)胞的黏附。

單純皰疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase，HSV-TK)基因可通過阻斷DNA合成導(dǎo)致細(xì)胞死亡[14]，又稱“自殺”基因治療，在多種腫瘤模型中均有效。然而缺乏安全高效的基因遞送系統(tǒng)已成為“自殺”基因治療的一大障礙。Cheang等[15]制備了氧化石墨烯-羥基磷灰石(graphene oxide-hydroxyapatite，GO-nHAP)復(fù)合體作為載體將HSV-TK基因?qū)肴橄偌?xì)胞，并采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)GO-nHAP復(fù)合體的轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性。研究表明，nHAP與DNA結(jié)合可保護(hù)DNA不受核酸酶的自發(fā)降解，同時(shí)石墨烯的摻入使nHAP的比表面積大幅增加，為DNA提供了大量的結(jié)合位點(diǎn)。此外，GO-nHAP復(fù)合體對(duì)正常乳腺細(xì)胞的細(xì)胞毒作用尚可耐受，且具有高度穩(wěn)定性。因此GO-nHAP復(fù)合體可作為一種新型高效的腫瘤治療基因載體。

nHAP除被用作藥物、蛋白質(zhì)和基因傳遞的載體，還對(duì)腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用。Sun等[16]比較了nHAP對(duì)肺癌細(xì)胞(A549)和正常支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)的細(xì)胞毒性作用。在A549細(xì)胞中，nHAP可有效靶向線粒體，導(dǎo)致線粒體膜電位降低，caspase-3和caspase-9酶活性升高，從而誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。此外，nHAP引起腫瘤細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度持續(xù)升高，而正常對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度僅有一過性升高。其原因可能是nHAP在含有多種水解酶的內(nèi)體中迅速降解，從而引起細(xì)胞鈣超載，導(dǎo)致細(xì)胞壞死、凋亡或自噬。nHAP的線粒體靶向性增強(qiáng)以及A549細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的持續(xù)升高，導(dǎo)致nHAP的腫瘤特異性細(xì)胞毒性作用。

Nasser等[17]制備了nHAP/MgO復(fù)合體并測(cè)試其抗癌活性。研究發(fā)現(xiàn)，MgO具有雙層疏水外膜，其疏水特征與細(xì)胞膜類似，使細(xì)胞易于通過內(nèi)吞作用攝取MgO。nHAP在胞內(nèi)通過誘導(dǎo)腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)產(chǎn)生從而激活凋亡途徑，使腫瘤細(xì)胞壞死。磺酰羅丹明B(sulforhodamine B，SRB)染色結(jié)果表明，由介孔氧化鎂作為載體包裹nHAP形成的復(fù)合體，其抗癌活性比單獨(dú)使用MgO和nHAP提高了3倍，nHAP/MgO復(fù)合體作為靶向腫瘤組織和細(xì)胞的藥物顯示出良好的潛力。

三、nHAP形成礦化膠原纖維防止腫瘤侵襲

骨是多發(fā)性骨髓瘤、前列腺癌及乳腺癌等癌癥轉(zhuǎn)移的首選部位。轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞與骨細(xì)胞相互作用，促進(jìn)癌細(xì)胞擴(kuò)增，同時(shí)破壞體內(nèi)骨重建平衡。nHAP作為骨細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分在癌細(xì)胞黏附和遷移中發(fā)揮重要作用。因此了解骨細(xì)胞外基質(zhì)與骨轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞之間的相互作用對(duì)于調(diào)控和預(yù)防骨轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞生長(zhǎng)是必要的[18]。

He等[19]通過X射線散射和拉曼成像在小鼠乳腺癌模型中表征nHAP結(jié)構(gòu)。研究表明，容易發(fā)生腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的骨骼部位包含較不成熟的nHAP，并且在繼發(fā)腫瘤形成前，原發(fā)腫瘤可以進(jìn)一步促進(jìn)nHAP不成熟化。這是由于乳腺腫瘤可以通過刺激成骨細(xì)胞增加其新骨生成或分泌可溶性因子從而直接抑制骨礦物質(zhì)的生理性成熟。Choi等[20]通過聚合物誘導(dǎo)的液體前驅(qū)體(polymer-induced liquid-precursor，PILP)技術(shù)在體外促進(jìn)膠原的纖維內(nèi)礦化，并促進(jìn)成熟nHAP晶體的形成，隨后采用掃描電子顯微鏡觀察礦化膠原對(duì)腫瘤細(xì)胞黏附及侵襲能力的影響。結(jié)果表明膠原纖維的生理性礦化可減少腫瘤細(xì)胞的黏附，經(jīng)細(xì)胞核和絲狀肌動(dòng)蛋白(filamentous actin, F-actin)染色的細(xì)胞的共聚焦圖像分析證實(shí)，與礦化膠原相互作用的乳腺癌細(xì)胞擴(kuò)散及侵襲均顯著降低[21]。

Ahn等[22]使用nHAP和纖維蛋白的三維仿骨復(fù)合材料模擬骨的微環(huán)境，來研究腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)和nHAP之間的相互作用，建立了胃癌細(xì)胞(MKN74)的TME骨轉(zhuǎn)移模型。其通過F-actin染色檢測(cè)細(xì)胞增殖并分析細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果顯示，MKN74細(xì)胞在較高的nHAP濃度下表現(xiàn)出顯著的遷移減少和胞質(zhì)體積減小，表明nHAP對(duì)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增殖具有抑制作用。此外，nHAP同時(shí)具有顯著抑制腫瘤相關(guān)的血管生成的功能，從而阻斷了腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、代謝的營(yíng)養(yǎng)需求，起到抑制腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的目的。

大多數(shù)研究將促進(jìn)骨中轉(zhuǎn)移性腫瘤的形成歸因于生長(zhǎng)因子和其他可溶性信號(hào)的釋放。Siddharth等[23]研究證明，骨轉(zhuǎn)移的惡性潛能不僅由骨微環(huán)境中的生長(zhǎng)因子介導(dǎo)，而且還受到nHAP材料特性的影響，通過溶液沉淀反應(yīng)、水熱合成法制備出粒徑分布和結(jié)晶度均不同的nHAP，并在含血清的培養(yǎng)基中孵育。經(jīng)比色法測(cè)定，與較大、結(jié)晶較多的nHAP比較，較小、結(jié)晶較少的nHAP吸附了更多的血清蛋白。蛋白質(zhì)吸附的改變將影響纖維連接蛋白等生物分子調(diào)節(jié)細(xì)胞附著、局部黏附形成和增殖信號(hào)通路，從而影響乳腺腫瘤細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)。因此，調(diào)控腫瘤患者骨組織局部nHAP的晶體結(jié)構(gòu)及比表面積等理化特性，可能通過阻斷蛋白吸附作用，來抑制侵襲的腫瘤細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)，從而阻斷其高親和力，抑制腫瘤的侵襲和增殖潛能。

四、nHAP促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移

盡管上述研究展示出nHAP良好的抗腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移效果，但亦有研究顯示nHAP可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。Pathi等[24]開發(fā)了一種礦化三維腫瘤模型，利用該培養(yǎng)系統(tǒng)在體外研究了nHAP在病理相關(guān)條件下的促轉(zhuǎn)移作用。與非礦化腫瘤模型比較，礦化腫瘤模型中腫瘤細(xì)胞黏附、增殖現(xiàn)象顯著增加。這一結(jié)果表明，nHAP促進(jìn)了癌細(xì)胞的增殖及骨轉(zhuǎn)移，白細(xì)胞介素-8(interleukin-8，IL-8)可能在這一過程中發(fā)揮重要作用。IL-8具有促血管及破骨細(xì)胞生成的作用，可導(dǎo)致病理性骨吸收，加劇骨形成與吸收的失衡，從而進(jìn)一步刺激轉(zhuǎn)移性腫瘤生長(zhǎng)。而nHAP介導(dǎo)的αvβ3整合素可使IL-8分泌增加，促進(jìn)繼發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)和骨破壞。整合素是控制細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的細(xì)胞黏附受體，可以調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移表型。研究結(jié)果表明，癌細(xì)胞具有高水平的磷酸化形式的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)和蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)，其作為整合素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵，可以刺激IL-8等趨化因子的表達(dá)。這一研究為骨微環(huán)境中的礦物質(zhì)基質(zhì)調(diào)節(jié)腫瘤骨轉(zhuǎn)移相關(guān)的病理性骨重建提供了分子機(jī)制。

導(dǎo)管原位癌(ductal carcinoma in situ, DCIS)是大多數(shù)浸潤(rùn)性乳腺癌(invasive breast carcinomas, IBC)的癌前病變。DCIS的典型診斷是通過乳房X光檢查微鈣化(microcalcifications, MC)現(xiàn)象，即微鈣化點(diǎn)越多，提示DCIS惡性程度越高。而與惡性乳腺病變相關(guān)的微鈣化主要由nHAP和相關(guān)的磷酸鈣礦物組成。Frank等[25]在空白對(duì)照及含有HA的聚丙交酯-乙交酯(poly lactide-co-glycolide, PLG)支架中分別培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞，評(píng)價(jià)nHAP對(duì)惡性腫瘤進(jìn)展的影響。在HA支架中培養(yǎng)的DCIS細(xì)胞發(fā)生了與侵襲性增加相關(guān)的變化，如增殖失調(diào)、失去細(xì)胞間的接觸及細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性增加。結(jié)果表明，nHAP可以刺激癌前DCIS細(xì)胞表現(xiàn)侵襲性，其機(jī)制可能依賴于IL-8信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。其通過DNA分析來測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)，并用實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)測(cè)定IL-8基因的表達(dá)，觀察到nHAP在正常和DCIS細(xì)胞系中有抑制增殖作用，但在IBC細(xì)胞系中無此作用；相反，nHAP在DCIS和IBC細(xì)胞系中上調(diào)IL-8基因表達(dá)和可溶性因子分泌，但在正常細(xì)胞中不上調(diào)。這一數(shù)據(jù)表明，nHAP會(huì)導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞的增殖和IL-8分泌上調(diào)，促進(jìn)其惡性程度。此外，在nHAP支架中培養(yǎng)的DCIS細(xì)胞，其間充質(zhì)形狀發(fā)生改變并且細(xì)胞間的接觸減少，表現(xiàn)出更強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)性。綜上所述，nHAP在一定情況下存在促進(jìn)腫瘤惡變，并增強(qiáng)其侵襲性的風(fēng)險(xiǎn)，主要可能與腫瘤局部區(qū)域nHAP的晶體結(jié)構(gòu)及比表面積等理化特性相關(guān)[22]。

五、展 望

nHAP通過改變腫瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和功能，可有效抑制癌細(xì)胞的增殖并減少其黏附作用。同時(shí)其對(duì)于正常細(xì)胞和癌細(xì)胞具有不同作用機(jī)制，表現(xiàn)出無毒性的優(yōu)點(diǎn)。此外，nHAP還可以礦化腫瘤組織局部膠原纖維，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移及侵襲，提高患者生存率。綜上所述，nHAP與癌細(xì)胞及膠原纖維相互作用分子機(jī)制的發(fā)現(xiàn)為轉(zhuǎn)移性腫瘤的治療開辟了新的應(yīng)用前景。然而，需要注意的是，nHAP亦可在特定環(huán)境中促進(jìn)生長(zhǎng)因子和其他可溶性信號(hào)的釋放，從而增強(qiáng)腫瘤惡性潛能，并刺激其發(fā)生增殖和黏附，這可能受到nHAP晶體結(jié)構(gòu)及比表面積等理化特性的調(diào)控。因此，仍需通過技術(shù)手段進(jìn)一步探究nHAP理化特性與腫瘤微環(huán)境之間的相互作用機(jī)制，以推進(jìn)nHAP在轉(zhuǎn)移性腫瘤預(yù)防及治療領(lǐng)域中的作用。