白藜蘆醇聚合物膠束的制備及質量評價

周韻秋，冀素平，劉聰，顏雄，典靈輝

論著

白藜蘆醇聚合物膠束的制備及質量評價

周韻秋，冀素平，劉聰，顏雄，典靈輝

523808 東莞，廣東醫(yī)科大學藥學院

制備白藜蘆醇（RES）聚合物膠束并對其進行質量評價。

采用薄膜分散法，以聚乙烯己內(nèi)酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物（SPS）和 D-α 生育酚聚乙二醇 1000 琥珀酸酯（TPGS）為載體材料，制備白藜蘆醇聚合物膠束（RES-SPS-TPGS-PMs）；采用納米粒度分析儀、差示掃描量熱法（DSC）及傅立葉變換紅外光譜法（FTIR）對其進行表征；采用高效液相色譜法測定聚合物膠束的包封率和載藥量；采用動態(tài)膜透析法考察載藥膠束的體外釋放特性。

制備的膠束平均粒徑為（52.4 ± 0.66）nm，多分散指數(shù)為 0.06 ± 0.01，包封率為（97.12 ± 9.08）%，載藥量為（2.37 ± 0.22）%。白藜蘆醇在聚合物膠束中可能以無定型或分子的形式存在，且白藜蘆醇與載體材料之間形成了氫鍵。體外釋放結果表明白藜蘆醇聚合物膠束具有明顯的緩釋效果。

該膠束制備工藝簡單，其粒徑、包封率、載藥量可控，具有緩釋作用。

白藜蘆醇； 聚合物膠束； Soluplus； 質量評價； 體外釋放

白藜蘆醇（resveratrol，RES）是一種天然的多酚類化合物，富含于葡萄、花生和漿果等[1-3]，具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗糖尿病、抗衰老和心臟保護的作用[2-4]。但由于其疏水性導致口服生物利用度低，嚴重影響臨床應用[5-6]。有報道采用不同的方法提高其口服生物利用度，比如制備成脂質體、固體分散體、納米乳劑等，但作用效果不顯著。聚合物膠束是一種新型的口服遞藥系統(tǒng)，倍受廣泛關注。聚合物膠束具有核-殼結構，疏水性內(nèi)核可以包載疏水性藥物，增加藥物的穩(wěn)定性[7]。膠束材料具有較小的納米尺寸，可通過腫瘤組織的 EPR 效應（enhanced permeability and retention effect）在腫瘤部位蓄積，從而實現(xiàn)藥物的被動靶向[8]。聚合物膠束具有良好的穩(wěn)定性，尤其是兩親性結構的聚乙烯己內(nèi)酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物形成的膠束Soluplus。Soluplus 具有較低的臨界膠束濃度值（CMC）（約 10-8mol/L），當其濃度超過 CMC 時，會自動形成膠束，將疏水性藥物包載在疏水核心，進而提高膠束的包封率和載藥量，并且其分子結構中羰基與藥物分子的羥基形成氫鍵，大大提高膠束的穩(wěn)定性[9-10]。D-α 生育酚聚乙二醇 1000 琥珀酸酯（TPGS）具有促口服吸收作用[11]，可作為混合膠束材料。因此本實驗以 Soluplus 和 TPGS 為納米載體材料，采用薄膜分散法制備功能化的白藜蘆醇混合膠束，并對其進行體外質量評價，為后期體內(nèi)研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 白藜蘆醇（純度≥ 99%）購自上海麥克林生化科技有限公司；Soluplus 購自德國 BASF 公司；TPGS 購自美國 Sigma 公司；甲醇（色譜純）購自天津市四友精細化學品有限公司；其他試劑均為分析純；超純水自制。

1.1.2 儀器與設備 SZ-100 納米粒度分析儀購自日本 Horiba 公司；UV-650 紫外可見分光光度計購自上海美譜達儀器有限公司；Agilent 1260 高效液相色譜儀購自美國安捷倫科技有限公司；Scientz-10ND 普通型冷凍干燥機購自寧波新芝生物科技股份有限公司；Discovery DSC25 熱分析儀購自美國 TA Instruments 公司；WQF-510A 傅立葉變換紅外光譜儀購自北京瑞利分析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 白藜蘆醇聚合物膠束的含量測定方法

1.2.1.2 白藜蘆醇標準曲線的建立 精密稱量白藜蘆醇 5.0 mg，用甲醇溶解并定容至 50 ml，配制成 100 μg/ml 的溶液作為儲備液。吸取白藜蘆醇儲備液適量，用甲醇分別稀釋成 1、2、5、10、20、30、40、50、100 μg/ml 的工作液，按“1.2.1.1”項下色譜條件進樣，記錄各濃度對應的峰面積（A），以峰面積（A）為縱坐標，濃度（C）為橫坐標，進行線性回歸，求出線性回歸方程。

1.2.1.3 精密度實驗 精密移取白藜蘆醇儲備液適量，無水乙醇稀釋配制低、中、高 3 個濃度的對照品溶液（5、20、50 μg/ml），按“1.2.1.1”項下色譜條件進樣，測定峰面積，一天內(nèi)連續(xù)測定3 次，連續(xù)測定 3 d，計算日內(nèi)和日間精密度。

1.2.1.4 回收率實驗 按處方比例，精密吸取相應比例的空白聚合物膠束溶液各 3 份，加入白藜蘆醇儲備液，用甲醇稀釋至濃度分別為 5、20、50 μg/ml，按“1.2.1.1”項下色譜條件進樣，測定峰面積。代入標準曲線方程計算回收率。

1.2.2 白藜蘆醇聚合物膠束的處方工藝研究

1.2.2.1 聚合物膠束的制備方法 稱取適量白藜蘆醇，40 mg Soluplus 溶于 1.0 ml 甲醇中，磁力攪拌至完全溶解；旋轉蒸發(fā)除去甲醇得到均勻的含藥薄膜，加入一定量的 TPGS 水溶液，渦旋 5 min，磁力攪拌一段時間，過 0.22 μm 濾膜，最終得到白藜蘆醇聚合物膠束溶液。以粒徑和包封率為考察指標，篩選出膠束的最佳制備工藝。

1.2.2.2 投藥量對聚合物膠束的影響 固定 TPGS 的濃度、Soluplus 濃度、磁力攪拌時間、磁力攪拌速度及水化量，考察投藥量為 1、2、3 mg 對聚合物膠束粒徑及包封率的影響。

1.2.2.3 TPGS 濃度對聚合物膠束的影響 固定其他條件不變，考察 TPGS 的濃度為 0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 μg/ml 對聚合物膠束粒徑和包封率的影響。

1.2.2.4 磁力攪拌速度對聚合物膠束的影響 固定其他條件不變，考察磁力攪拌速度為500、600、700、800 r/min對聚合物膠束粒徑和包封率的影響。

1.2.2.5 磁力攪拌時間對聚合物膠束的影響 固定其他條件不變，考察磁力攪拌時間為 1、1.5、2、2.5、3 h 對聚合物膠束粒徑及包封率的影響。

1.2.2.6 水化量對聚合物膠束的影響 固定其他條件不變，考察水化量為 1、2、3、4 ml 對聚合物膠束粒徑及包封率的影響。

1.2.3 白藜蘆醇聚合物膠束的質量評價

1.2.3.1 白藜蘆醇聚合物膠束粒徑的測定 將白藜蘆醇聚合物膠束用超純水稀釋到適當濃度，測定其平均粒徑和 PDI，測試溫度為 25 ℃，重復檢測 3 次。

1.2.3.2 聚合物膠束的包封率和載藥量測定 采用濾膜過濾法進行聚合物膠束藥物包封率的測定。濾膜過濾法能夠將包封和未包封的藥物分開；因白藜蘆醇難溶于水，未包封的藥物大多會以游離微晶形式存在，故可被濾膜截留；取 250 μl 白藜蘆醇聚合物膠束溶液，過 0.22 μm 濾膜，用甲醇破壞膠束結構并定容至 5 ml，用 HPLC 法測定，計算膠束中包封的藥物的含量。按照以下公式計算包封率（EE）和載藥量（DL）：EE（%）= 膠束中包封的藥物的質量/加入藥物的質量 × 100%，DL（%）=膠束中包封的藥物的質量/（加入藥物的質量+ 加入的載體材料的質量）× 100%。

1.2.3.3 差示掃描量熱法（DSC） 分別取白藜蘆醇原料藥、空白聚合物膠束凍干粉、白藜蘆醇與空白聚合物膠束的物理混合物、白藜蘆醇聚合物膠束凍干粉 6 mg 置于鋁坩堝中，以空白鋁坩堝為對照。在氮氣保護下，升溫速率為 10 ℃/min，掃描區(qū)間溫度為30 ~ 300 ℃，記錄吸收曲線。

1.2.3.4 紅外光譜（FTIR） 將白藜蘆醇原料藥、空白聚合物膠束凍干粉、白藜蘆醇與空白聚合物膠束的物理混合物、白藜蘆醇聚合物膠束凍干粉分別與 KBr 壓片后，在 4000 ~ 400 cm-1范圍內(nèi)進行紅外光譜掃描。

1.2.3.5 聚合物膠束的體外釋放及機制的考察 采用動態(tài)膜透析袋法考察白藜蘆醇聚合物膠束的體外釋放行為。以磷酸鹽緩沖液（pH 7.4，0.5% Tween80）為釋放介質。取適量的白藜蘆醇聚合物膠束溶液，平行 3 份，每份白蘆藜醇的含量均為 1.0 mg，置于處理過的透析袋（MWCO 為 10 000）內(nèi)；將含藥透析袋兩端扎緊后浸入 20 ml 已超聲脫氣的釋放介質中。在（37 ± 0.5）℃、100 r/min 的條件下進行釋放實驗，分別于 0.5、1、2、3、4、5、6、8、9、10、12、24、36、48、72、96、120 h 時取出全部釋放介質，每次取出釋放介質后立即補入等溫等體積的新鮮釋放介質。將取出的液體經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾后，按照“1.2.1.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積，得到不同時間點的藥物濃度，從而計算出累積釋放百分數(shù)（Q），繪制累積釋放曲線。

2 結果

2.1 白藜蘆醇聚合物膠束的含量測定結果

白藜蘆醇在 1 ~ 100 μg/ml 范圍內(nèi)峰面積和濃度呈良好的相關性，線性回歸方程為A = 46.16C – 31.327（2= 0.9995）。低、中、高 3 個濃度的日內(nèi)精密度分別為 114.57%、100.91%、101.31%，RSD 分別為 1.58%、1.52%、1.44%；日間精密度分別為 116.14%、103.65%、104.39%，RSD 分別為 1.09%、1.57%、1.37%，表明精密度符合方法學要求。低、中、高 3 個濃度的回收率分別為 110.45%、99.10%、100.21%，RSD 為 0.84%、0.13%、0.06%（n = 3），表明回收率符合方法學要求。

2.2 白藜蘆醇聚合物膠束的處方工藝研究

2.2.1 投藥量對聚合物膠束的影響 結果如圖 1所示，粒徑隨著投藥量的增加，呈緩慢增加的趨勢；而包封率隨著投藥量的增加逐漸降低；當投藥量達到 3 mg 時，粒徑急劇增加，包封率驟減。當投藥量達到 2 mg 時，粒徑為（80.17 ± 0.38）nm；PDI 為（0.16 ± 0.02）；包封率 88.86%；大于 80%，所以確定投藥量為 2 mg。

圖 1 投藥量對聚合物膠束粒徑和包封率的影響

Figure 1 Effect of dosage on particle size and encapsulation efficiency of polymeric micelles

2.2.2 TPGS 濃度對聚合物膠束的影響 隨著 TPGS 濃度的增加，粒徑變化趨勢不顯著；而包封率大致呈增加趨勢（圖 2）。當濃度為 0.05 mg/ml時，粒徑為（79.50 ± 0.66）nm；PDI 為（0.20 ±0.02）；包封率為 94.50%。而當濃度為 0.03 mg/ml 時，粒徑為（77.40 ± 0.26）nm；PDI 為（0.18 ± 0.01）；包封率為 90.51%。綜合考慮，確定 TPGS 濃度為 0.03 mg/ml。

圖 2 TPGS 濃度對聚合物膠束粒徑和包封率的影響

Figure 2 Effect of TPGS concentration on particle size and encapsulation efficiency of polymeric micelles

圖 3 磁力攪拌速度對聚合物膠束粒徑和包封率的影響

Figure 3 Effect of magnetic stirring speed on particle size and encapsulation efficiency of polymeric micelles

2.2.3 磁力攪拌速度對聚合物膠束的影響 磁力攪拌速度的改變對粒徑的影響較小，當磁力攪拌速度達到700 r/min 時，包封率最高，為 84.55%；再增加磁力攪拌速度，包封率反而減小。綜合考慮，選定磁力攪拌速度為 700 r/min（圖 3）。

2.2.4 磁力攪拌時間對聚合物膠束的影響 粒徑隨著磁力攪拌時間的延長而波動較??；包封率的變化與磁力攪拌時間也不成正相關。當時間為 1 h 時，包封率最大，為 93.92%（圖 4）。綜合以上分析，確定磁力攪拌時間為 1 h。

2.2.5 水化量對聚合物膠束的影響 粒徑隨著水化量的增加呈逐漸增加的趨勢，而包封率逐漸減?。▓D 5）。故選定水化量為 1 ml。

2.2.6 最佳制備工藝的確定 經(jīng)綜合分析，確定最佳制備工藝的投藥量為 2 mg；Soluplus 的量為 40 mg；TPGS 濃度為 0.03 mg/ml；水化量為 1 ml；在磁力攪拌速度為 700 r/min條件下攪拌 1 h。

圖 4 磁力攪拌時間對聚合物膠束粒徑和包封率的影響

Figure 4 Effect of magnetic stirring time on particle size and encapsulation efficiency of polymeric micelles

2.3 白藜蘆醇聚合物膠束的質量評價

2.3.1 白藜蘆醇聚合物膠束的外觀形態(tài) 如圖 6 所示，白藜蘆醇（RES + H2O）混懸液呈白色、混懸狀。本實驗以最佳工藝制備的白藜蘆醇聚合物膠束（RES-SPS-TPGS-PMs）溶液呈藍色乳光，為澄明透亮的均一、穩(wěn)定溶液。此外觀是聚合物膠束制備成功的一個標志。

2.3.2 白藜蘆醇聚合物膠束粒徑的測定 納米粒粒徑的大小是評價藥物制劑的一個關鍵指標。將最佳工藝制備的聚合物膠束加入適量水稀釋，用激光粒度儀測定粒徑和 PDI，分別為（52.4 ± 0.66）nm和（0.06 ± 0.01），說明制備的膠束溶液粒度小且分布均勻（圖 7）。

2.3.3 差示掃描量熱法（DSC） 由圖 8可知，白藜蘆醇原料藥在 271 ℃有吸收峰存在，該點是白藜蘆醇的熔融峰，說明原料藥具有晶體的性質。白藜蘆醇聚合物膠束凍干樣品中，白藜蘆醇的特征吸收峰消失，說明白藜蘆醇在聚合物膠束中，晶型已經(jīng)發(fā)生了改變，可能以無定型或分子的形式存在。物理混合物中，在白藜蘆醇熔融峰附近并非平滑曲線，說明一部分白藜蘆醇仍為晶體形式，進一步說明膠束中藥物晶型發(fā)生了改變。

圖 5 水化量對聚合物膠束粒徑和包封率的影響

Figure 5 Effect of hydration amount on particle size and encapsulation efficiency of polymeric micelles

圖 6 白藜蘆醇混懸液（左）和白藜蘆醇聚合物膠束溶液（右）的外觀圖

Figure 6 Appearance of resveratrol suspension (left) and resveratrol polymeric micelles solution (right)

2.3.4 紅外光譜 由圖 9可知，白藜蘆醇粉末在 3250 cm-1處出現(xiàn)酚羥基的特征吸收峰；966 cm-1為反式 C=C 的特征峰；1610 cm-1、1510 cm-1處為苯環(huán)的特征吸收峰。從白藜蘆醇聚合物膠束的紅外譜圖中可以看出白藜蘆醇的部分特征吸收峰發(fā)生改變，說明白藜蘆醇被包載在膠束材料中。空白膠束凍干粉與白藜蘆醇的物理混合物的紅外光譜中，既有空白膠束的特征吸收峰，也有芹菜素的特征吸收峰；此外，在空白膠束中出現(xiàn)了 C=O 的特征吸收峰（1729 cm-1、1623 cm-1），白藜蘆醇聚合物膠束中也出現(xiàn)了 C=O 的特征吸收峰（1727 cm-1、1616 cm-1），相較于空白膠束位移發(fā)生了稍許改變。由此也表明了在聚合物膠束中，白藜蘆醇的羥基與載體中的羰基之間形成了氫鍵，從而有較高的載藥量與包封率。

圖 7 白藜蘆醇聚合物膠束的粒徑分布圖

Figure 7 Particle size distribution of resveratrol polymeric micelles

a：白藜蘆醇原料藥；b：空白聚合物膠束凍干粉；c：空白膠束與白藜蘆醇原料藥的物理混合物；d：白藜蘆醇聚合物膠束凍干粉

Figure 8 Differential scanning calorimetry of resveratrol polymeric micelles

a：白藜蘆醇原料藥；b：空白聚合物膠束凍干粉；c：空白膠束與白藜蘆醇原料藥的物理混合物；d：白藜蘆醇聚合物膠束凍干粉

Figure 9 Infrared absorption spectrum of resveratrol polymer micelles

圖 10 白藜蘆醇聚合物膠束的累積釋放

Figure 10 Cumulative release of resveratrol polymeric micelles

2.3.5 聚合物膠束的體外釋放及機制的考察 白藜蘆醇聚合物膠束的釋放曲線如圖 10 所示。白藜蘆醇聚合物膠束在 120 h 內(nèi)僅僅釋放 45.83%，顯示達到明顯的緩釋效果，說明 Soluplus 作為聚合物膠束釋藥系統(tǒng)的載體具有緩釋作用。分別用零級動力學方程、一級動力學方程、Higuchi 方程對膠束的體外釋放度進行擬合度分析，結果見表 1。結果顯示，聚合物膠束的體外釋放曲線更符合 Higuchi 方程，表明其體外釋放以擴散為主?？赡苡捎诎邹继J醇分子結構上的羥基與載體材料結構上的羰基形成了氫鍵，致使藥物從聚合物膠束的疏水核心擴散到釋放介質的過程更加緩慢。

表 1 白藜蘆醇聚合物膠束的不同釋放模型擬合方程

3 結論

常用的聚合物膠束的制備方法有直接溶解法、透析法、微相分離法、溶劑揮發(fā)法、薄膜分散法等。薄膜分散法往往制備簡單，具有較高的包封率和載藥量。本研究采用薄膜分散法制備白藜蘆醇聚合物膠束，制備的膠束包封率與載藥量較高。納米粒粒徑的大小是評價藥物制劑的一個關鍵指標。用于口服的聚合物納米尺寸通常小于 100 nm，本試驗制備的白藜蘆醇聚合物膠束的粒徑約 52 nm，符合口服吸收對粒徑大小的要求[12]。白藜蘆醇聚合物膠束的 DSC 結果顯示，白藜蘆醇在聚合物膠束中，晶型已經(jīng)發(fā)生了改變，可能以無定型或分子的形式存在。從 FTIR 分析結果可以得出，白藜蘆醇與載體之間形成了氫鍵，由于氫鍵的存在，大大提高了聚合物膠束的包封率、載藥量及穩(wěn)定性。載藥膠束的釋放采用動態(tài)透析袋法。在滿足漏槽條件的前提下，選擇磷酸鹽緩沖液（pH 7.4，0.5% Tween80）為釋放介質考察白藜蘆醇聚合物膠束的釋放特性；由體外釋放曲線可知，白藜蘆醇聚合物膠束具有顯著的緩釋效果，達到了長循環(huán)的目的，說明白藜蘆醇幾乎完全包封于膠束中。白藜蘆醇聚合物膠束的釋放行為更符合 Higuchi 擴散方程，說明聚合物膠束中藥物的釋放主要以擴散為主。本研究為白藜蘆醇口服制劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

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Preparation and quality evaluation of resveratrol loaded polymeric micelles

ZHOU Yun-qiu, JI Su-ping, LIU Cong, YAN Xiong, DIAN Ling-hui

To prepare resveratrol-soluplus-TPGS-polymeric micelles (RES-SPS-TPGS-PMs) and evaluate its quality.

The RES-SPS-TPGS-PMs were prepared by the thin film hydration method, and the micelles were characterized by the nanoparticle analyzer, differential scanning calorimeter (DSC) and Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR). The HPLC method was established for determining the encapsulation efficiency and drug loading capability. Therelease of resveratrol from polymeric micelles was evaluated by dialysis method.

The particle size and polymer dispersity index (PDI) of RES-SPS-TPGS-PMs were (52.4 ± 0.66) nm and (0.06 ± 0.01), respectively. Encapsulation efficiency and drug loading were (97.12 ± 9.08)% and (2.37 ± 0.22)%, respectively. Resveratrol possibly existed in an amorphous or molecular form in the polymer micelles and the hydrogen bonds were formed between resveratrol and polymer. The release profile showed that resveratrol-loaded polymeric micelles were sustained-release formulations.

The preparation process of RES-SPS-TPGS-PMs was simple, its particle size, entrapment efficiency and drug loading capacity could be controllable, and it possesses a slow drug-release effect.

Resveratrol; Polymeric micelles; Soluplus; Quality evaluation; Vitro release

DIAN Ling-hui, Email:dianlh@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.01.006

Author Affiliation:College of Pharmaceutical Sciences, Guangdong Medical University, Dongguan 523808, China

廣東省東莞市社會科技發(fā)展（重點）項目（2017507152463）；廣東醫(yī)科大學重點培育項目（Z2017002）；廣東省教育廳青年創(chuàng)新人才類項目（2018KQNCX093）；廣東省科技計劃項目（2014A020212296）；廣東省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201610571016、201710571055、201810571084）

典靈輝，Email：dianlh@163.com

2019-08-26