補腎安胎沖劑調(diào)控VHL/HIF-1α信號通路改善復發(fā)性流產(chǎn)小鼠母胎界面血管生成的實驗研究

郝樂樂，李偉莉，吳 花，金 雅，王媛中，余欣慧

(1.安徽中醫(yī)藥大學，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，安徽 合肥 230031)

復發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)指與同一性伴侶發(fā)生2次或2次以上的自然流產(chǎn)，是女性妊娠期主要疾病之一，病因復雜，且仍有40%患者病因不明，嚴重影響育齡女性的身心健康，引起RSA的原因較多, 包括先天遺傳、女性解剖異常、內(nèi)分泌紊亂、盆腔感染因素、男性因素、心理因素及免疫因素等, 但其確切機制尚不明確[1]。因此RSA的機制研究引起越來越多學者的關(guān)注[2-3]。有研究表明，希佩爾-林道抑癌基因(Von Hippel-Lindau, VHL)缺陷會抑制缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)的降解，從而升高HIF-1α的表達，引起血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、細胞代謝等一系列改變，促進血管生成[4]。也有研究表明，補腎健脾活血法能改善子宮內(nèi)環(huán)境和胎盤的微循環(huán)[5]。補腎安胎沖劑是安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院的院內(nèi)制劑，在壽胎丸的基礎(chǔ)上改良而成，具有補腎健脾、養(yǎng)血安胎的作用，廣泛應(yīng)用于RSA患者的防治中，其保胎療效確切[6-7]。但補腎安胎沖劑影響血管生成的機制尚不明確。故本研究以VHL/HIF-1α信號通路作為切入點，旨在從母胎界面血管生成角度，探討補腎安胎沖劑的作用機制，為臨床保胎應(yīng)用補腎安胎沖劑提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 健康雌性CBA/J小鼠76只，雄性DBA/2小鼠30只，BALB/C小鼠8只，小鼠體質(zhì)量均為20 g左右，屬于SPF級，8周齡，均購于北京華阜康實驗動物有限公司[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2014-0004]。所有小鼠均飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學實驗動物中心[環(huán)境溫度：(24±2)℃；相對濕度：45%±5%；每日光照時間和黑夜時間均等，各12 h]，自由獲得水及食物，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本實驗方案經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準。

1.2 藥物 補腎安胎沖劑(每袋10 g，皖藥制字BZ20080017)由安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院提供；黃體酮膠囊(每粒50 mg，國藥制字H20041902)由浙江仙琚制藥股份有限公司提供。

1.3 試劑與儀器 ①酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒。VHL(貨號 EK-E20775R)、HIF-1α(貨號 EK-E20353R)：北京安迪華泰生物科技有限公司。②熒光定量PCR試劑。Trizol(批號 90803)：Life technogies公司；QuantiNova SyBr Green PCR試劑盒(批號 208054)：Qiagen；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號 00519963)：Thermo Scientific。③免疫組織化學法試劑。VHL(批號 AC11253656)、HIF-1α(批號 GR196812-1)：Bioss公司；通用型二抗試劑盒(批號 K136830B)、DAB顯色劑(批號 K136821F)、PBS(批號 WK163307-1)：北京中杉公司。④Western blot法試劑。山羊抗小鼠IgG(批號 127655)、山羊抗兔IgG(批號 129256)、β-actin(批號 17AV0303)：北京中杉公司；VHL(批號 AC11253656)、HIF-1α(批號 AE120101P)：Bioss公司；SDS(批號 1029H032)：Solarbio；PVDF膜(批號 R8CA8257E)：Millipore；ECL超敏發(fā)光試劑盒(批號 QF220648)：Thermo。

RM2135切片機(Leica)：德國；普通PCR儀(型號 K960)；顯微鏡(Nikon 80i)：日本；EPS300型電泳儀：Tanon；高速臺式冷凍離心機(JW-3021HR)：安徽嘉文儀器裝備有限公司；TS-1000水平搖床、LX 300型微量離心機：海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

2 方法

2.1 模型復制、分組及給藥 按照文獻[8]方法復制RSA小鼠模型和正常妊娠小鼠模型。每日凌晨5:00—6:00檢查雌鼠陰道，若見陰道栓，計為妊娠第1天；若未見陰道栓，則繼續(xù)合籠。共復制RSA模型小鼠50只，正常妊娠小鼠10只。將模型復制成功的RSA小鼠隨機分為5組：模型組，黃體酮組，補腎安胎沖劑高、中、低劑量組，每組10只。從妊娠第1天開始給藥，正常組、模型組小鼠給予等容積蒸餾水灌胃，黃體酮組小鼠以26 mg/(kg·d)黃體酮灌胃，補腎安胎沖劑高、中、低劑量組小鼠于妊娠第1天分別按35.1、11.7、3.9 g/(kg·d)灌胃。每日1次，連續(xù)15 d，末次給藥24 h后處死小鼠。

2.2 胚胎丟失率的計算 肉眼觀察各組孕鼠胚胎丟失情況并記錄，計算胚胎丟失率。參照趙愛明等[9]的方法制定胚胎丟失的標準，記錄每組孕鼠的存活胚胎數(shù)、丟失胚胎數(shù)，然后計算胚胎丟失率。胚胎丟失率=丟失胚胎數(shù)/(存活胚胎數(shù)+丟失胚胎數(shù))×100%。

2.3 ELISA法檢測外周血VHL、HIF-1α水平 從眶后靜脈叢采血2 mL，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液0.5～1 mL于試管中，-80 ℃保存。采用酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒測定外周血中VHL、HIF-1α的含量。

2.4 采用熒光定量PCR檢測VHL、HIF-1α mRNA的表達水平 運用Trizol法對小鼠蛻膜組織進行總RNA提取，然后進行逆轉(zhuǎn)錄操作，嚴格按照試劑盒說明書進行，熒光定量PCR檢測VHL、HIF-1α mRNA的表達水平。以cDNA作為熒光定量的模板，引物序列見表1。

表1 引物序列

2.5 免疫組織化學法檢測蛻膜組織VHL、HIF-1α表達水平 蛻膜組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，微波修復抗原。PBS液洗滌3次，滴加一抗(VHL、HIF-1α，稀釋至1∶200)，37 ℃孵育60 min。PBS洗滌后再滴加通用型二抗，37 ℃孵育20 min。DAB顯色，復染，脫水，封片。光鏡下以細胞胞漿、胞核中呈棕黃色或棕褐色為陽性對照。采用JEDR 80ID形態(tài)學圖像分析系統(tǒng)軟件(Version 1.0)對陽性反應(yīng)細胞的積分光密度值(integral optical density，IOD)進行分析。

2.6 Western blot法檢測蛻膜組織中VHL、HIF-1α蛋白水平 取小鼠蛻膜組織，按照總蛋白提取試劑盒說明書提取小鼠蛻膜組織總蛋白，用BCA蛋白測定試劑盒檢測蛋白濃度。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，然后用5%脫脂奶粉溶液在搖床上室溫封閉2 h，加入不同一抗VHL(稀釋至1∶300)和HIF-1α(稀釋至1∶300)，4 ℃孵育過夜。PBST洗滌3次，加入二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物酶(稀釋至1∶10 000)，孵育2 h。室溫孵育2 h，PBST洗滌3次。使用ECL超敏發(fā)光試劑盒檢測蛋白條帶，最后用Image J軟件分析條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參照β-actin的灰度比值表示蛋白相對表達水平。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠胚胎丟失率 與正常組比較，模型組小鼠胚胎丟失率顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，所有治療組小鼠胚胎丟失率均顯著下降(P<0.05)；與補腎安胎沖劑低劑量組比較，補腎安胎沖劑高、中劑量組胚胎丟失率顯著升高(P<0.05)；黃體酮組與補腎安胎沖劑高劑量組小鼠胚胎丟失率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組小鼠胚胎丟失率比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與黃體酮組比較，□P<0.05；與補腎安胎沖劑低劑量組比較，△P<0.05；與補腎安胎沖劑中劑量組比較，◇P<0.05

3.2 各組小鼠血清中VHL、HIF-1α含量比較 與正常組比較，模型組小鼠血清中VHL含量明顯上升(P<0.05)，HIF-1α含量明顯下降(P<0.05)；與模型組比較，所有治療組小鼠血清中VHL含量均明顯下降(P<0.05)，HIF-1α含量均明顯升高(P<0.05)；補腎安胎沖劑高劑量組小鼠血清中VHL含量低于低、中劑量組(P<0.05)，HIF-1α含量高于低、中劑量組(P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠血清中VHL、HIF-1α含量比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與黃體酮組比較，□P<0.05；與補腎安胎沖劑低劑量組比較，△P<0.05；與補腎安胎沖劑中劑量組比較，◇P<0.05

3.3 各組小鼠蛻膜VHL、HIF-1α mRNA表達水平比較 與正常組比較，模型組VHL mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)，HIF-1α mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，各藥物治療組VHL mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)，HIF-1α mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)；補腎安胎沖劑對VHL、HIF-1α mRNA表達的影響具有劑量依賴性，以補腎安胎沖劑高劑量作用最優(yōu)(P<0.05)。見表4。

3.4 免疫組織化學法檢測的各組小鼠蛻膜組織中VHL、HIF-1α蛋白表達水平比較 VHL、HIF-1α在各組妊娠小鼠蛻膜組織中皆有表達，主要表達于細胞的細胞漿中，除此之外在細胞核中也可見表達。見圖1。與正常組比較，模型組小鼠蛻膜組織中VHL蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，HIF-1α蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，各治療組小鼠蛻膜組織中VHL蛋白表達水平顯著下降(P<0.05)，HIF-1α蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；補腎安胎沖劑降低模型小鼠蛻膜組織中VHL蛋白和升高HIF-1α蛋白的作用具有明顯的劑量依賴性(P<0.05)。見表5。

表4 各組小鼠蛻膜VHL、HIF-1α mRNA相對表達水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與黃體酮組比較，□P<0.05；與補腎安胎沖劑低劑量組比較，△P<0.05；與補腎安胎沖劑中劑量組比較，◇P<0.05

表5 免疫組織化學法檢測的各組小鼠蛻膜組織中VHL、HIF-1α蛋白表達水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與黃體酮組比較，□P<0.05；與補腎安胎沖劑低劑量組比較，△P<0.05；與補腎安胎沖劑中劑量組比較，◇P<0.05

3.5 Western blot檢測的各組小鼠蛻膜組織中VHL、HIF-1α蛋白表達水平比較 與正常組比較，模型組小鼠蛻膜組織中VHL蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，HIF-1α蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，各治療組蛻膜組織中VHL蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，HIF-1α蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；補腎安胎沖劑降低模型小鼠蛻膜組織中VHL蛋白和升高HIF-1α蛋白的作用具有明顯的劑量依賴性(P<0.05)。見圖2、表6。

表6 Western blot檢測的各組小鼠蛻膜組織中VHL、HIF-1α蛋白表達水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與黃體酮組比較，□P<0.05；與補腎安胎沖劑低劑量組比較，△P<0.05；與補腎安胎沖劑中劑量組比較，◇P<0.05

注：A.正常組；B.模型組；C.黃體酮組；D.補腎安胎沖劑低劑量組；E.補腎安胎沖劑中劑量組；F.補腎安胎沖劑高劑量組；箭頭所示棕黃色或棕褐色顆粒是VHL、HIF-1α蛋白

圖1各組小鼠蛻膜組織中VHL、HIF-1α蛋白表達水平比較(免疫組織化學法，10×20倍)

注：A.正常組；B.模型組；C.黃體酮組；D.補腎安胎沖劑低劑量組；E.補腎安胎沖劑中劑量組；F.補腎安胎沖劑高劑量組

圖2Westernblot法檢測各組小鼠蛻膜組織中VHL、HIF-1α蛋白表達水平

4 討論

RSA屬于中醫(yī)“滑胎”范疇，是妊娠期的一種常見疾病，RSA主要是由“脾腎氣血兩虛”所致。目前對于RSA的治療，中醫(yī)主要通過補腎健脾法進行治療?！短ギa(chǎn)指南》指出：“凡孕婦脾胃旺而血氣充，則胎安而正?！逼庵魃?，氣能載胎，中氣升提有力，胎兒正常發(fā)育而不致墮胎?！陡登嘀髋啤分赋?“腎水足而胎安，腎水虧而胎動。”腎主固胎，腎氣盛則孕后胞脈固胎有力，使胎無下墜之慮，說明胎兒生長發(fā)育全賴母體之腎所系，脾胃化生之氣血所養(yǎng)，氣以載之，沖任以固之。補腎安胎沖劑是基于此理論的一種經(jīng)驗性復方，主要由菟絲子、桑寄生、續(xù)斷、黃芪、白術(shù)、黃芩等藥物組成，具有補腎健脾、養(yǎng)血安胎的作用。菟絲子能補腎，腎旺自能蔭胎；桑寄生能養(yǎng)血，強筋骨，使胎氣強壯；續(xù)斷亦為補腎要藥；黃芪、白術(shù)配伍，健脾益氣安胎；白術(shù)、黃芩為安胎圣藥，白術(shù)健脾除濕，黃芩滋陰清熱，合而用之養(yǎng)血健脾，清化濕熱，以安胎氣。

HIF-1是一種異源二聚體,主要由HIF-1α和HIF-1β兩個亞單位組成。HIF-1α作為唯一的活性亞基,能調(diào)節(jié)多種基因的表達，如參與紅細胞生成、血管形成等生物學效應(yīng)，同時還對胚胎及胎盤發(fā)育起重要作用[10]。有研究[11-12]表明，HIF-1α通過誘導或調(diào)控血管生成相關(guān)基因促進血管新生，如增加VEGF等細胞因子的分泌從而調(diào)控動物對缺血反應(yīng)的適應(yīng)。VHL是一種蛋白質(zhì)編碼基因，參與HIF的泛素化和降解[13]。有研究[14]表明，VHL的關(guān)鍵組成部分E3連接酶復合體可泛素化和降解HIF-1α，當VHL蛋白失活會抑制E3連接酶復合體，從而上調(diào)HIF-1α的表達水平，過量的HIF-1α會積聚于細胞內(nèi)，激活其靶基因轉(zhuǎn)錄，間接啟動VEGF、Notch和PI3K/AKT/mTOR等信號通路，激活缺血傳導途徑，促使腫瘤血管新生及腫瘤細胞的增殖。另有研究[15-16]表明，VHL/HIF-1α信號通路對胚胎的發(fā)育和機體組織的生長等均有重要的調(diào)控作用。因此，本研究進一步從微觀角度探討經(jīng)補腎安胎沖劑干預后，VHL、HIF-1α蛋白表達及這一信號通路在RSA過程中的作用。

CBA/J×DBA/2交配組合具有易患反復自然性流產(chǎn)的特點，可以用作研究反復自然性流產(chǎn)的動物模型[17]。因此，本研究采用CBA/J×DBA/2交配組合經(jīng)典反復流產(chǎn)小鼠模型，觀察補腎安胎沖劑對RSA小鼠胚胎丟失率、血清和蛻膜組織中VHL、HIF-1α表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組RSA小鼠胚胎丟失率高，血清中VHL含量升高，HIF-1α含量降低；蛻膜組織中VHL mRNA及蛋白表達水平升高，HIF-1α mRNA及其蛋白表達水平下降。經(jīng)藥物干預后，RSA小鼠胚胎丟失率降低；血清VHL含量和蛻膜組織中VHL mRNA及其蛋白表達水平明顯降低，血清HIF-1α含量和蛻膜組織中HIF-1α mRNA及其蛋白表達水平明顯增加，其中補腎安胎沖劑高劑量組效果最為顯著。因此可以推測，補腎安胎沖劑可能是通過VHL/HIF-1α信號通路誘導RSA小鼠胎盤血管的形成，降低胚胎丟失率，從而達到保胎的效果。因此，補腎安胎沖劑可以作為一種潛在的、有益的中藥復方制劑，用于RSA的預防和治療中。