我國(guó)不同產(chǎn)區(qū)核桃油組成成分與氧化穩(wěn)定性研究

周張濤，高 盼,2，章景志，何東平,2

（1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.大宗糧油精深加工教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（武漢輕工大學(xué)），湖北 武漢 430023；3.湖北圭萃園農(nóng)林股份有限公司，湖北 襄陽 441600）

核桃（Juglansregia L.）是四大堅(jiān)果（杏仁，核桃，栗子和腰果）之一，在全球被廣泛種植[1-2]。近年來，由于核桃中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)諸多慢性疾病具有改善作用，受到了人們的關(guān)注[3]。我國(guó)擁有悠久的核桃種植歷史，是世界上最大的核桃生產(chǎn)國(guó)，據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）統(tǒng)計(jì)，我國(guó)2018年核桃的年產(chǎn)量占全球總產(chǎn)量的48%。

核桃油具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，不僅含有豐富的油酸等單不飽和脂肪酸（MUFA），還含有極高的亞油酸和亞麻酸等多不飽和脂肪酸（PUFA），不飽和脂肪酸在血脂、血栓和免疫調(diào)節(jié)等方面顯示出極佳的作用[4]，能滿足人體所需。核桃油還富含植物甾醇，多酚和生育酚等微量伴隨物[5]。植物甾醇主要包括谷甾醇，菜油甾醇和豆甾醇，占植物甾醇總量的95%以上，在醫(yī)學(xué)、功能食品和化妝品中具有廣泛的應(yīng)用[6]。

我國(guó)核桃栽培的地理環(huán)境存在較大差異，導(dǎo)致核桃油品質(zhì)參差不齊。研究采集我國(guó)西南、西北和東部三大主要產(chǎn)區(qū)的16個(gè)核桃樣品，統(tǒng)一工藝壓榨制備成核桃油，并檢測(cè)其組成成分和氧化穩(wěn)定指數(shù)。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析核桃油組成成分與氧化穩(wěn)定指數(shù)之間的關(guān)聯(lián)，以評(píng)估核桃油中對(duì)核桃油品質(zhì)影響最大的生物活性成分。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

西南地區(qū)（云南省，貴州省和四川?。儆诘途暥壬絽^(qū)季風(fēng)氣候。年平均降雨量 1148.6～1239.2 mm，氣溫 13.8～18.1 ℃，無霜天 231.5～301.4 d，日照持續(xù)時(shí)間在1 306.1～1 483.3 h；西北地區(qū)（山西省，陜西省，甘肅省和寧夏回族自治區(qū)）位于西部平原，年降水量371.7～563.7 mm，氣溫 7.9～13.4 ℃，無霜天 183.8～202.8 d，日照時(shí)間2256.1～2636.3 h；東部地區(qū)（遼寧省，河北省，山東省，河南省，江蘇省，北京和天津）位于太行山脈腳下，年降水量和氣溫為493.6～592.5 mm和8.4～12.9 ℃，無霜天數(shù)為 169～195 d，日照持續(xù)時(shí)間為2 624.8～2 916.2 h。根據(jù)地理學(xué)、氣候、生態(tài)條件、種植區(qū)域和行政區(qū)域完整性的原則，選取具有代表性的樣品。分別從西南地區(qū)和西北地區(qū)各采集5種樣品，東部地區(qū)采集6種樣品，共16種核桃樣品。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品，生育酚標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞95%），5α-膽甾醇，菜油甾醇，豆甾醇和β-谷甾醇的標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma Aldrich Chemical有限公司；甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品：瑞典Larodan Fine Chemicals AB公司；Speax萃取柱：上海Speax Technologies公司；其他試劑：上海國(guó)藥集團(tuán)。

1.3 儀器與設(shè)備

螺桿壓榨機(jī)：德國(guó)IBG Monforts公司；7890A氣相色譜—質(zhì)譜，配火焰電離檢測(cè)器（FID），DB-17HT毛細(xì)管柱（0.15 μm，0.25 mm×15 m）：安捷倫有限公司；Trace TR-FAME毛細(xì)管柱（0.25 μm，60 m×0.25 mm）：賽默飛有限公司；LC-20AT高效液相色譜系統(tǒng)，配紫外檢測(cè)器（SPD-20A）：日本島津公司；Rancimat 743型：瑞士萬通中國(guó)有限公司；硅膠柱（5μm，4.6×250 mm）：江蘇漢邦公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品的采集與處理

核桃9月成熟后，同一時(shí)間采集16個(gè)核桃樣品，立即運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室，在 45 ℃的烤箱中干燥3 d后，人工剝殼，使用螺桿壓榨機(jī)榨油。制備的核桃油放入棕色玻璃瓶中，并置于4 ℃冰箱避光儲(chǔ)存。

(2)聘用兼職。通過各種途徑聘用從事本專業(yè)相關(guān)工作、具有豐富實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的工程技術(shù)人員、技術(shù)工人擔(dān)任兼職教師，專門化方向課程的教學(xué)可以由校企合作辦學(xué)的企業(yè)方工程技術(shù)人員承擔(dān)。

1.4.2 脂肪酸組成

GB5009168-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪酸的測(cè)定》中樣品前處理及色譜參考條件的方法略微調(diào)整。將0.25 mg油樣溶解在2.0 mL色譜級(jí)正己烷中，并與0.5 mL 2 mol/L 氫氧化鉀—甲醇溶液混合，靜置至分層，取上層清液，過膜以制備脂肪酸甲酯。檢測(cè)條件：氮?dú)猓ㄝd氣），1 mL/min；火焰電離檢測(cè)器（FID）溫度為250 ℃；比例1∶100; 初溫60 ℃保持3 min，以5 ℃/min升溫至175 ℃，保持5 min，再以2 ℃/min升溫至220 ℃，保持10 min；進(jìn)樣量1.0 μL。與脂肪酸的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照后，得到相對(duì)比例含量的脂肪酸組成。

1.4.3 甘油三酯組成

根據(jù)AOCS Ce 5-86方法，使用DB-17HT毛細(xì)管柱（0.15 μm，0.25 mm×15 m）分離核桃油中的甘油三酯。檢測(cè)條件：氮?dú)猓ㄝd氣），1 mL /min；噴油器溫度360 ℃；FID溫度為375 ℃；分配比例為 1∶100。初始柱溫為 250 ℃，以 5 ℃/min的速度升至340 ℃，然后在340 ℃保持32 min。樣品濃度為10 mg /mL，進(jìn)樣量為1.0 μL。通過碳的數(shù)量和不飽和度，并對(duì)比甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間，得到每種甘油三酯的相對(duì)比例含量。

1.4.4 生育酚

使用配備有紫外檢測(cè)器（SPD-20A）的高效液相色譜分析生育酚。稱1 g油用色譜級(jí)正己烷稀釋于10 mL容量瓶中。然后將20 μL的樣品注入到機(jī)器中，流動(dòng)相為己烷/異丙醇（98.5/1.5，v/v），流速為 1.0 mL/min。柱溫 30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為295 nm。通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)生育酚進(jìn)行鑒定和定量分析，含量以mg/kg表示。

1.4.5 總酚

使用固相萃取柱和福林酚法分析總酚含量。分別用6 mL甲醇和6 mL正己烷過Speax柱使其活化，準(zhǔn)確稱取1.5 g核桃油樣品，溶于6 mL正己烷中過柱，再分別用 3 mL正己烷清洗柱子兩次，加入 4 mL 正己烷-乙酸乙酯（9：1，v：v）過柱；最后加入甲醇洗脫并收集于 10 mL棕色容量瓶中，定容，移取5 mL置于另一個(gè)10 mL棕色容量瓶中，加入0.5 mL福林酚，反應(yīng)3 min，加入1 mL 10%的Na2CO3溶液，用水定容后避光靜置2 h，過膜，用分光光度計(jì)檢測(cè)樣品在765 nm波長(zhǎng)下的吸光度。

1.4.6 植物甾醇

使用配備有FID的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)植物甾醇進(jìn)行分析。將 200 mg的油與 0.5 mL的0.1 mg/mL的5α-膽甾烷和3 mL的2 mol/L 氫氧化鉀-乙醇溶液混合。將混合物在85 ℃下皂化1 h，冷卻后添加3次5 mL己烷和2 mL蒸餾水以提取不皂化物。然后將產(chǎn)物通過氮?dú)飧稍铮⒃?5 ℃下用 200 μLN,O-雙(三甲基硅)三氟乙酰胺(含三甲基氯硅烷)硅烷化30 min，冷卻。將1 μL制備的樣品注入氣相色譜儀，并通過 DB-5毛細(xì)管柱（0.25 μm，30 m×0.25 mm；安捷倫）進(jìn)行分離。初始柱溫設(shè)定為200 ℃，0.5 min后以10 ℃/min的速率升至300 ℃，并保持18 min。FID和進(jìn)樣器溫度均為280 ℃。氦氣（載氣）流速為1.2 mL/min，分流比為1∶100。另外，離子源和傳輸線溫度分別為280 ℃和250 ℃。電離模式為電子碰撞離子源，質(zhì)量范圍為 50～550 m/z。植物甾醇含量以mg/kg表示。

1.4.7 氧化穩(wěn)定指數(shù)

根據(jù) AOCS Cd12b-92方法，使用 Rancimat 743型測(cè)量氧化穩(wěn)定指數(shù)（OSI），并以小時(shí)為單位記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酸組成

表1列出了不同產(chǎn)區(qū)核桃油的脂肪酸組成范圍及平均值，從表中可以看出，核桃油的主要脂肪酸為 C16∶0（3.05%～8.27%），C18∶0（1.00%～3.53%），C18∶1（12.56%～26.04%），C18∶2（51.21%～ 68.97%）和 C18∶3（6.82%～15.01%）。不同產(chǎn)區(qū)核桃油的次要脂肪酸，如C12∶0、C14∶0、C17∶0、C20∶0和 C22∶1，沒有明顯的差異。我國(guó)不同產(chǎn)區(qū)的核桃油富含 66.33%～78.66%的PUFA，PUFA已經(jīng)被證實(shí)對(duì)人體的健康有益，證明我國(guó)核桃油是一種具有高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的食用油。

東部地區(qū)核桃油的油酸含量平均值為15.82%，西南地區(qū)和西北地區(qū)的平均值分別為 19.56%和19.98%。Poggettiet等[7]發(fā)現(xiàn)油酸含量和日溫度具有顯著的線性正相關(guān)。東部地區(qū)的平均氣溫低于其他地區(qū)，因此表現(xiàn)出這樣的趨勢(shì)。由此可知，影響我國(guó)不同產(chǎn)區(qū)核桃油脂肪酸組成的主要因素是核桃的種植氣候。與 Gharibzahedi等[8]研究的波斯核桃油脂肪酸組成對(duì)比后，發(fā)現(xiàn)我國(guó)不同產(chǎn)區(qū)核桃油的脂肪酸組成中的C16∶0和C18∶2含量較低。Bada等人[9]研究的西班牙15種核桃油脂肪酸組成比較，發(fā)現(xiàn)與我國(guó)不同產(chǎn)區(qū)核桃油的脂肪酸組成中C18∶2和C18∶3含量比較接近，且C16∶0的比例較高。

表1 我國(guó)不同產(chǎn)區(qū)核桃油的脂肪酸組成范圍及平均值 %

2.2 甘油三酯組成

表 2為我國(guó)不同產(chǎn)區(qū)核桃油的甘油三酯組成范圍及平均值，共檢測(cè)出13種甘油三酯：PLL，OLL，OLLn，LLL，LLLn，POP，PPL，POS，POO，POL + PLO，SOS，OOO和OOL。不同產(chǎn)區(qū)核桃油的主要甘油三酯PLL（5.96%～14.98%），OLL（9.65%～15.46%），OLLn（17.07%～24.18%），LLL（27.87%～39.47%）和 LLLn（6.42%～12.43%）含量總和超過 80%，此外，PLS，PLO，LLnLn和 LnLnLn的含量均小于 0.01%或未檢出，故未在表中列出。由于脂肪酸組成不同，東部地區(qū)的LLL較高（平均值35.44%）高于其他地區(qū)（平均值：西南地區(qū)31.68%和西北地區(qū)30.82%），但POL（平均值4.19%）和OOL（平均值2.91%）含量低于其他地區(qū)，我國(guó)不同產(chǎn)區(qū)核桃油相比較于西班牙核桃油[9]，其中 LLL含量 27.87%～39.47%和OLLn含量17.07%～24.18%，高于西班牙核桃油的LLL含量（24.67%～29.20%）和 OLLn含量（4.60%～5.65%）?？梢娭舅峤M成和含量、地理環(huán)境對(duì)甘油三酯的組成和含量具有重要影響。

2.3 總酚與生育酚含量

表 3列出了我國(guó)不同產(chǎn)區(qū)核桃油的總酚及生育酚含量范圍及平均值，共檢測(cè)到α，γ和δ三種形式的生育酚。α-生育酚的含量較低，三個(gè)產(chǎn)區(qū)的平均值為46.28 mg/kg。γ-和δ-生育酚的含量相差不大，三個(gè)產(chǎn)區(qū)的平均值分別為316.62 mg/kg，309.29 mg/kg。總酚含量和生育酚含量的平均值從高到低依次為西北地區(qū)，東部地區(qū)和西南地區(qū)。西班牙的核桃油[10]有四種形式生育酚：α，β，γ和 δ。相比較而言，我國(guó)三個(gè)產(chǎn)區(qū)核桃油的總酚含量平均值（758.89 mg/kg）,高于西班牙核桃油的總酚含量平均值（436.2 mg/kg）。原因可能如Lavedrine等人[11]所述，地理位置是影響核桃中生育酚含量的主要因素。

表2 我國(guó)不同產(chǎn)區(qū)核桃油的甘油三酯組成范圍及平均值 %

表3 我國(guó)不同產(chǎn)區(qū)核桃油的總酚及生育酚含量范圍及平均值 mg/kg

2.4 植物甾醇

表4為我國(guó)不同產(chǎn)區(qū)核桃油的植物甾醇含量范圍及平均值。植物甾醇通常作為油脂的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，是核桃油中非皂苷植物甾醇含量的主要部分，我國(guó)不同產(chǎn)區(qū)核桃油含量為540～1 594 mg/kg。核桃油中菜油甾醇，Δ5-燕麥甾醇和 β-谷甾醇含量較高，三種甾醇占到植物甾醇總含量的90%以上。據(jù)Amaral等人[12]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄牙的核桃油也有類似的結(jié)果，三種甾醇總量占到88%～92%。β-谷甾醇，西北地區(qū)的含量要明顯低于其他兩個(gè)地區(qū)，比Madawala[13]等人測(cè)定的瑞士核桃油（1 652 mg/kg）中的平均含量還低。此外在我國(guó)核桃油中還發(fā)現(xiàn)少量的豆甾醇，Δ5, 24-豆甾二烯醇和 Δ7-菜油甾醇。

表4 我國(guó)不同產(chǎn)區(qū)核桃油的植物甾醇含量范圍及平均值 mg/kg

2.5 氧化穩(wěn)定指數(shù)

表5顯示了不同產(chǎn)區(qū)核桃油的氧化穩(wěn)定指數(shù)范圍及平均值，不同產(chǎn)區(qū)核桃油的平均氧化穩(wěn)定指數(shù)間不存在顯著差異，且十分相近。東部地區(qū)的平均值為2.73 h，比其他兩個(gè)地區(qū)平均值2.59 h和2.41 h稍高。但相同地區(qū)不同核桃油之間的差異顯著，西南地區(qū)的值相差很大差值為 2.17 h，而西北地區(qū)的差值為1.46 h。根據(jù)Roszkowska[14]等人研究，氧化穩(wěn)定指數(shù)的差異與脂肪酸組成和微量伴隨物有關(guān)。故對(duì) OSI、脂肪酸組成、微量伴隨物之間進(jìn)行了多元線性回歸分析。

表5 我國(guó)不同產(chǎn)區(qū)核桃油的氧化穩(wěn)定指數(shù)范圍及平均值 h

表6顯示了亞油酸是脂肪酸組成中作用最顯著的自變量，表明亞油酸含量較高的油更易被氧化。亞油酸是核桃油中的主要脂肪酸，脂肪酸中存在的雙鍵是脂質(zhì)氧化的主要因素，因?yàn)樗鼈兛梢猿洚?dāng)自由基受體，脂質(zhì)氧化速率與脂肪酸不飽和度成正比。Vidrih等人[15]解釋了 OSI與 PUFA含量之間的負(fù)相關(guān)關(guān)系，OSI值隨著亞油酸和亞麻酸含量的降低而增加。而核桃油中PUFA的含量最高是亞油酸，與此相符。因此，核桃油中的亞油酸是氧化降解的原因之一。

表6 與氧化穩(wěn)定指數(shù)相關(guān)的多元線性回歸分析

在OSI與微量伴隨物α-生育酚之間有顯著關(guān)聯(lián)性。其抗氧化機(jī)理是α-生育酚可通過兩種方式抗氧化：一是用作氧清除劑，淬滅單線態(tài)氧，另一種用作自由基清除劑，從而在鏈引發(fā)和鏈增長(zhǎng)階段的循環(huán)中阻斷脂質(zhì)氧化。盡管α-生育酚在核桃油中含量不高，但在抗氧化中起著非常重要的作用。與此同時(shí)，總酚含量對(duì)氧化穩(wěn)定指數(shù)也有顯著影響。通常認(rèn)為總酚的抗氧化作用歸因于其自由基的清除，氧化還原活性金屬的螯合以及通過高度前氧化態(tài)的還原而使血紅蛋白失活，因?yàn)樗梢葬尫艢潆x子，從而破壞氧化鏈反應(yīng)的終止。綜上所述，α-生育酚和總酚含量是影響核桃油氧化穩(wěn)定指數(shù)的兩個(gè)最重要因素。

3 結(jié)論

本研究中 16種我國(guó)不同產(chǎn)區(qū)核桃油的亞油酸含量平均在63.07%，亞麻酸平均在9.36%，證明我國(guó)核桃油是良好的不飽和脂肪酸來源。由于核桃的產(chǎn)區(qū)不同，地理位置和氣候不同，導(dǎo)致油中脂肪酸組成和生育酚的含量存在顯著差異。根據(jù)氧化穩(wěn)定指數(shù)與脂肪酸組成、微量伴隨物之間的相關(guān)性分析，得出亞油酸（R= -0.891,P＜0.01）、α-生育酚（R= 0.713，P＜0.01）和總酚含量（R=0.393，P＜0.01）是影響核桃油氧化穩(wěn)定性的主要因素。