長鏈非編碼RNAs調控骨穩(wěn)態(tài)研究進展

范琳媛，李紅凌

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院 婦科，北京 100026；2.中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院 組織工程中心，北京 100005)

骨骼具有機械支持、肌肉附著、儲存鈣磷等礦物質功能，這些功能的維持需要骨組織處于骨形成和骨吸收的動態(tài)平衡，即維持骨穩(wěn)態(tài)(bone homeostasis)。當骨形成與骨吸收之間代謝平衡失調，單位結構內骨量下降，骨質疏松癥等骨代謝相關疾病發(fā)生。近年來，隨著對長鏈非編碼RNAs(long noncod-ing RNAs,lncRNAs)功能的認識，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAs不僅可以順式調節(jié)臨近基因轉錄，還能遠距離影響靶基因的表達，在骨基質合成、骨吸收和骨修復等過程發(fā)揮作用。本文就參與骨形成和骨吸收過程的lncRNAs及其調控機制展開綜述。

1 長鏈非編碼RNAs生物學特征

lncRNAs是一類轉錄本長度超過200 nt的RNA分子，幾乎不具有編碼蛋白功能。哺乳動物中4%～9%基因組序列轉錄成lncRNAs，而只有不到2%基因組轉錄為編碼基因mRNAs。根據(jù)lncRNAs在基因組中與鄰近基因位置關系，lncRNAs一般分為順式lncRNAs(sense)、反式lncRNAs(antisense)、雙向lncRNAs(bidirectional)、內含子lncRNAs(intronic)、基因間lncRNAs(intergenic)[1]。lncRNAs一般具有polyA、具有保守的二級結構和特定的細胞定位，在不同的分化過程具有動態(tài)表達，lncRNAs在不同組織中的表達量不同，相同的組織在不同的狀態(tài)時表達量也不同。LncRNAs功能多樣，調控機制復雜，可以在表觀遺傳、轉錄及轉錄后等多水平進行基因調控。隨著基因組學的進步，越來越多的報道lncRNAs在調節(jié)核染色質結構和基因表達，生命發(fā)育及疾病發(fā)生發(fā)展中起重要調控作用[2]。

2 骨穩(wěn)態(tài)維持

正常生理狀態(tài)下，骨形成和骨吸收處于一種動態(tài)平衡，骨組織保持一種骨穩(wěn)態(tài)。隨著年齡增加或女性絕經(jīng)等因素，骨吸收高于骨形成，骨生成和骨吸收平衡被打破，導致骨密度降低，骨質出現(xiàn)疏松。骨的形成起始于骨髓間充質干細胞的聚集，逐漸形成骨窩，隨后骨髓間充干細胞分化為成骨細胞或成軟骨細胞，成骨細胞或成軟骨細胞分別通過膜內成骨和軟骨內成骨的方式形成新的骨組織。而負責骨吸收的細胞，主要是破骨細胞，破骨細胞主要來源于造血干細胞，與單核細胞、巨噬細胞有一定的相關性[3]。

骨髓間充質干細胞、成骨細胞、破骨細胞和骨細胞是骨重塑和骨穩(wěn)態(tài)維持重要的幾種細胞，骨形成和骨吸收過程主要受特異性轉錄調控因子和表觀遺傳因子的調控。從骨髓間充質干細胞向骨細胞形成過程是一個程序性的分化過程，成骨關鍵轉錄因子SOX9、RUNX2和OSX/SP7依次激活，并受Wnt /β-catenin、TGF-β/BMP、MAPK/p38和Notch等通路調控[4]。而破骨細胞經(jīng)過核因子κB受體激活因子(RANK)激活后，改變自身的形態(tài)，細胞骨架蛋白發(fā)生重排，并與骨表面形成緊密連接，通過分泌裂解酶抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和pro-cathepsin K組織蛋白酶K(pro-Catk)，侵蝕其結合的骨組織[5]。而以上兩個過程均受表觀遺傳調控如DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA調控的影響，且越來越多的報道，lncRNAs在DNA 甲基化和組蛋白修飾等過程也起重要調控作用，并在骨形成和骨吸收過程發(fā)揮重要作用[6]。

3 LncRNAs在骨穩(wěn)態(tài)中調控作用

3.1 LncRNAs在骨形成中調控作用

骨形成主要是由間充質干細胞分化而成的成軟骨細胞和成骨細胞介導，并受特異性轉錄調控基因和表觀遺傳因子調控。LncRNAs廣泛參與表觀遺傳因子和多種基因表達調節(jié)，在生命發(fā)育及疾病發(fā)生發(fā)展起重要作用。多項研究報道，lncRNAs 在成骨分化、成軟骨分化等骨形成過程起重要調控作用。

3.1.1 LncRNAs正向調節(jié)骨形成過程

3.1.1.1 H19促進成骨分化：LncRNA H19在哺乳動物中保守性較高，與細胞增殖分化密切相關[7]，其在成骨分化過程也具有重要調控作用[8]。H19可以促進間充質干細胞成骨分化，H19作為miR-675的前體，剪接產(chǎn)生成熟的miR-675-3p 和miR-675-5p，miR-675與H19在成骨分化過程表達上調，二者均可以促進體外成骨分化和體內異位骨形成，H19不僅可以抑制TGF-β表達，還可以下調TGF-β對Smad3的磷酸化水平，進而抑制HDAC4/5與成骨關鍵基因RUNX2、OCN啟動子區(qū)的結合，發(fā)揮抑制成骨分化作用[9]。H19 還可以作為內源競爭性RNA，通過吸附miR-141和miR-22而阻止miR-141和miR-22與Wnt/beta-catenin的結合，從而促進成骨分化。最近在研究機械張力對人源骨髓間充質干細胞成骨分化過程發(fā)現(xiàn)，H19 可以競爭性結合miR-138，從而干擾miR-138與靶基因PTK2的調控，促進下游FAK表達上調，進一步促進機械張力對骨髓間充質干細胞成骨分化的誘導和骨形成[10]。目前對于H19 在成骨方向的研究很多，H19有望成為骨調控研究領域的重要lncRNA分子。

3.1.1.2 MALAT1促進成骨分化和基質礦化：LncRNA MALAT1與多種腫瘤發(fā)生相關[11]。MALAT1可以促進瓣膜間質細胞的成骨分化和鈣化，MALAT1通過吸附miR-204來上調靶基因Smad4表達，激活的Smad4上調ALP、OCN表達，進而促進成骨分化和胞外基質的礦化[12]。并且有研究表明MALAT1還可以靶向miR-14，從而調節(jié)成骨關鍵轉錄因子Osx表達[13]。

3.1.1.3 DANCR促進成軟骨分化：SOX4可以上調lncRNA DANCR，促進滑膜來源的間充質干細胞增殖和成軟骨分化[14]。DANCR直接結合于myc，增強myc基因的mRNA穩(wěn)定，從而促進細胞增殖。而DANCR對成軟骨分化的促進作用，是通過促進Smad3和STST3 mRNA穩(wěn)定性來實現(xiàn)的。且研究還發(fā)現(xiàn)DANCR可以下調miR-1305表達，從而調節(jié)Smad4表達，激活TGF-β信號通路，促進成軟骨分化和骨形成[15]。

3.1.2 LncRNAs反向調節(jié)骨形成過程

3.1.2.1 MEG3抑制成骨分化：多發(fā)性骨髓瘤患者的骨髓間充質干細胞成骨分化過程中，下調lncRNA MEG3可以抑制成骨關鍵因子RUNX2、OSX、OCN 的表達，并抑制BMP4的轉錄。MEG3可將轉錄抑制因子SOX2從BMP4啟動子區(qū)游離，從而激活BMP4的表達[16]。MEG3通過吸附miR-140-5p 發(fā)揮促進成骨分化，抑制成脂分化過程[17]。而有報道在絕經(jīng)后骨質疏松患者中，MEG3可以上調miR-133a-3p的表達，進而抑制骨髓中間充質干細胞的成骨分化[18]。

3.1.2.2 MIAT抑制體內外骨形成：lncRNA MIAT首次發(fā)現(xiàn)與心肌梗死發(fā)病相關，在人脂肪來源的間充質干細胞成骨分化過程表達下調，敲降MIAT可以在體內水平促進成骨分化，體外促進骨形成。炎性因子TNF-α可以促進骨吸收，誘導骨質疏松的發(fā)生，而下調MIAT表達可以逆轉TNF-α引起的成骨抑制和骨吸收作用[19]。對全髖關節(jié)置換術中ONFH患者股骨頭標本的檢測，發(fā)現(xiàn)壞死組織中MIAT的RNA水平遠遠高于正常股骨組織，抑制內源性MIAT可以促進小鼠骨髓間充質干細胞的成骨分化和骨形成[20]。

3.1.2.3 miR31HG調節(jié)炎性微環(huán)境下骨形成：miR31HG與細胞增殖、分化和腫瘤發(fā)生相關[21]。miR31HG在間充質干細胞成骨分化過程表達下調，敲降miR31HG表達不僅可以促進骨形成，還可以逆轉炎性因子TNF-α和IL-17誘導的成骨抑制。NF-κB的P65 亞基可以結合于miR31HG的啟動子區(qū)域，促進miR31HG的表達，而miR31HG可以直接結合IκBα，促進其磷酸化，進而參與NF-κB信號通路的激活。miR31HG-NF-κB二者互相調控，形成回路從而調節(jié)炎性微環(huán)境下骨形成[22]。

3.2 LncRNAs調控骨吸收過程

在骨骼系統(tǒng)不斷更新的過程中，來自單核/巨噬細胞造血系的破骨細胞調節(jié)骨吸收過程。采用100 ng/mL RANKL和50 ng/mL M-CSF刺激活化RAW 264.7細胞，進行破骨誘導，lncRNA芯片數(shù)據(jù)分析顯示，在前破骨細胞階段，有4 348個lncRNAs表達發(fā)生變化，其中1 643個lncRNAs上調，2 705個lncRNAs表達下降。在成熟的活化破骨細胞中，分別有1 896和2 706個lncRNAs表達上調或下降，并通過GO分析和KEGG分析了差異表達的lncRNAs的主要通路，但并未對差異lncRNAs的具體功能進行分析[23]。目前，關于lncRNAs調控破骨細胞和骨吸收功能的研究并不是很多，或許與破骨細胞分化模型較難重復有關，而進行文章數(shù)據(jù)的深入挖掘，或許可以發(fā)現(xiàn)更多有意義lncRNAs。

3.2.1 LncRNA Jak3促進破骨過程:分析單水合尿酸鈉(MSU)誘導RAW264.7細胞在破骨細胞分化過程中l(wèi)ncRNA和mRNA的共表達情況發(fā)現(xiàn)，在破骨細胞譜系314對lncRNA-mRNA中22對與炎性反應相關，而Jak3和Jak3共表達模式在破骨細胞中顯著上調。其中，Jak3通過正向調控破骨細胞因子Nfatc1的表達，參與MSU誘導的破骨細胞分化，并在痛風患者的單核細胞中Jak3水平升高。進一步機制研究發(fā)現(xiàn)，Jak3介導的NFATC1激活上調了組織蛋白酶K (Ctsk)的表達，Jak3在通過Jak3/NFATC1/Ctsk軸向分化破骨細胞中起著關鍵的功能作用[24]。

3.2.2 LncRNA-AK077216促進破骨細胞分化:通過芯片檢測和qPCR驗證發(fā)現(xiàn)，lncRNA-AK077216 (lnc-AK077216)的表達在破骨細胞發(fā)生過程中顯著上調。NFATc1是破骨細胞發(fā)生過程中必不可少的轉錄因子，而lnc-AK077216通過抑制NIP45的表達，促進NFATc1的表達，從而發(fā)揮促進破骨細胞分化的功能。此外，在卵巢去勢后小鼠骨髓組織中檢測到lnc-AK077216和Nfatc1表達上調，而Nip45表達下調，lnc-AK077216可以調控NFATc1的表達，促進破骨細胞的形成和功能，為破骨細胞的形成提供了新的機制[25]。

4 問題與展望

LncRNAs在基因組中數(shù)量龐大，它們在多種調控水平參與胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生、細胞增殖及分化等生物過程。LncRNAs不僅存在于各種組織中，已在全血、血清、尿液和細胞外囊泡中檢測到，這增加了它們作為疾病的生物標志物的潛力，例如迄今發(fā)現(xiàn)的人類前列腺癌最特異的生物標志物之一IncRNA PCA3?？紤]到IncRNAs的大小和細胞位置，試圖敲除或過度表達這些lncRNAs作為治療疾病的手段面臨著一定挑戰(zhàn)，但最近的進展為該領域帶來了新的改進。目前有多種方法可以改變lncRNAs的表達，包括使用病毒或非病毒載體、基于RNA或基因組編輯方法。如殼聚糖用于非病毒基因的傳遞既高效又無毒，基于鎖核酸(locked nucleic acid,LNA)的gapmers以及多聚體或多靶點寡核苷酸可以實現(xiàn)更高的干擾效率和更低的給藥劑量，并且通過CRISPR-Cas9復合物也可以控制lncRNA的表達。

盡管目前發(fā)現(xiàn)有許多l(xiāng)ncRNAs表達與骨形成和骨吸收過程密切相關，但lncRNAs如何調控干細胞向成骨細胞和軟骨細胞譜系分化的研究尚處于起步階段，更深入的調控機制需要大量研究去探索。并且目前關于lncRNAs在破骨細胞分化和骨吸收方面的研究還很少，也未見lncRNAs應用于骨代謝疾病的診斷和治療的報道。

隨著基因組學與生物信息學的發(fā)展，許多關于lncRNAs的數(shù)據(jù)庫不斷出現(xiàn)，為lncRNAs的研究提供更多可參考資源?？梢灶A測，在未來幾年，這一領域的研究興趣將顯著增加，并提供有關參與骨骼發(fā)育和骨穩(wěn)態(tài)調控的新知識。這些發(fā)現(xiàn)將對了解骨質疏松等骨代謝疾病，以及確定治療這些疾病的新治療策略產(chǎn)生深遠的影響。