肺炎克雷伯菌外排泵基因研究與耐藥性的關(guān)系*

諸宏偉，臧歡歡，劉培培，沈懷云，王 磊

蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科，安徽蚌埠 233004

細(xì)菌耐藥已成為公共衛(wèi)生問題，耐藥菌感染是感染性疾病療效欠佳、住院時(shí)間延長(zhǎng)、患者死亡的重要原因。肺炎克雷伯菌是常見的病原菌，占醫(yī)院感染的15%～20%，可引起各種肺外感染，包括泌尿系統(tǒng)感染、腸炎、腦膜炎、菌血癥等[1]。近年來因抗菌藥物濫用、不合理用藥等原因，肺炎克雷伯菌耐藥率呈逐年上升趨勢(shì)，已成為“超級(jí)耐藥”細(xì)菌，在全世界廣泛傳播，分離率僅次于大腸桿菌[2]。外排泵是細(xì)菌耐藥的重要途徑，進(jìn)行外排泵基因分析，有助于分析細(xì)菌的耐藥機(jī)制。本文嘗試分析肺炎克雷伯菌外排泵基因與耐藥性的關(guān)系，為細(xì)菌耐藥管理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 菌株來源于2016年1月至2018月12月在該院住院的兒科患兒，從糞便、痰液、血液、組織液等標(biāo)本中分離獲得，經(jīng)全自動(dòng)菌株鑒定藥敏分析儀進(jìn)行初篩，對(duì)看家基因GyrA、ParC進(jìn)行基因擴(kuò)增與測(cè)序，并對(duì)比鑒定，確定菌種，共獲得菌株144株。儀器設(shè)備：KB藥敏紙片，PCR引物，PCR反應(yīng)試劑盒，序列測(cè)定，梯度PCR儀，D3024臺(tái)式高速微量離心機(jī)，CHB-100恒溫金屬浴，JY-SPB電泳儀，全自動(dòng)菌株鑒定藥敏分析儀，凝膠成像系統(tǒng)，超凈工作臺(tái)恒溫水浴鍋，紫外透射儀等。材料：瓊脂糖，MH培養(yǎng)基，DNA marker DL-2000，PCR反應(yīng)用Eppendorf管，dNTP聚合酶。

1.2方法

1.2.1藥敏分析 規(guī)范操作，挑選單個(gè)菌落，置入菌種保存管-80 ℃冰箱保存，需要檢驗(yàn)時(shí)，復(fù)蘇細(xì)菌，挑選凍存菌接種在MH血瓊脂平板上，劃線后37 ℃過夜靜置培養(yǎng)。藥敏試驗(yàn)采用KB紙片擴(kuò)散法，質(zhì)控菌株：肺炎克雷伯菌 ATCC700603，大腸埃希菌 ATCC25922。參照美國(guó)2015年臨床和實(shí)驗(yàn)室診斷標(biāo)準(zhǔn)、WHONET5.6軟件藥敏數(shù)據(jù)分析，進(jìn)行藥敏性判斷。藥敏藥物主要包括氨芐青霉素、氨芐舒巴坦、頭孢唑林、頭孢曲松、頭孢他啶、氨曲南、頭孢吡肟、環(huán)丙沙星、呋喃妥因、慶大霉素、復(fù)方磺胺甲噁唑、亞胺培南、美羅培南、左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦。

1.2.2基因檢測(cè) 基因提取：煮沸法提取NDA，將菌種接種到麥康凱平板上，放入孵箱內(nèi)35 ℃過夜，分離培養(yǎng)得到單個(gè)細(xì)菌菌落，放入微量離心管裝載。吸取200 μL無(wú)菌雙蒸水放入微量離心管，以取菌環(huán)提取細(xì)胞的細(xì)菌菌落，放入離心管，均勻混合，密封離心管，將離心管放入100 ℃沸水煮沸100 min，將煮沸后的離心管放入離心機(jī)8 000 r/min離心30 s，取上清液置入另外一個(gè)微量離心管，-20 ℃保存，備用。

基因檢測(cè)：(1)設(shè)計(jì)引物，外排泵基因包括oqxA(引物序列P1:CTC GGC GCG ATG ATG CT，P2:CCA CTC TTC ACG GGA GAC GA，產(chǎn)物392 bp)、oqxB(引物序列P1:TTC TCC CCC GGC GGG AAG TAC，P2:CTC GGC CA1 TTT GGC GCG TA，產(chǎn)物512 bp)、AcrAB-TolC(引物序列P1:ATG CAA AAT TAT TCG CTT TCA GGC，P2:GAT ACA CAC CGC CTC CTC AAA，產(chǎn)物420 bp)、qepA(引物序列P1:GCC GAA CGC CGC TGC CGA CAG，P2:TGC TGC TGA CGC TGG CGC TC，產(chǎn)物512 bp)、tehA(引物序列P1：ATA GCC CAC CGC TTT GCC，P2:CGT TAC GCC AGC ACC CTC T，產(chǎn)物301 bp)、emrD(引物序列P1:CCT GGC GTA GCG GAG ATG，P2:GGC CGT AGA ATA GCT GTG AAA T，產(chǎn)物378 bp)、qacE△l-sull(引物序列P1:TAG CGA GGG CTT TAC TAC TAA GC；P2:ATT CAG AAT GCC GAA CAC CG，產(chǎn)物300 bp)。(2)配置工作液，取出引物進(jìn)行高速離心，根據(jù)引物標(biāo)注的量向離心管加入無(wú)菌蒸餾水，震蕩溶解，配置引物原液，-20 ℃冰箱保存，將配置好的引物原液按照1∶20比例稀釋后離心。(3)檢測(cè)基因，操作前計(jì)算反應(yīng)體系量，將EP管放在冰盒上，做好標(biāo)記。取EP管，計(jì)算反應(yīng)體系中的各個(gè)試劑量順序，加入EP管，加入T安全DNA聚合酶，瞬時(shí)離心，混合；吸取23 μL配置好的反應(yīng)液，加入到每個(gè)小的EP管，每個(gè)EP管加入2 μL DNA 模板液，加入1滴石蠟油。反應(yīng)完成后，8 000 r/min瞬時(shí)離心，放入DNA擴(kuò)增儀擴(kuò)增基因。(3)最后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，吸取1 μL上樣緩沖液,4 μL的擴(kuò)增產(chǎn)物混合，加入凝膠點(diǎn)樣孔，第一個(gè)點(diǎn)樣孔加入4 μL DNA標(biāo)記，最后一個(gè)加入無(wú)菌水，作為陰性對(duì)照。電泳儀電壓100 V，電泳40 min，然后用0.5 μg/L溴化乙錠染色，進(jìn)行自動(dòng)分析。

1.3觀察指標(biāo) 分析抗菌藥物耐藥情況、外排泵基因檢出情況、耐藥菌藥物品種數(shù)與外排泵基因陽(yáng)性個(gè)數(shù)的相關(guān)性等。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料以率表示，外排泵基因陽(yáng)性與陰性耐藥情況對(duì)比采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1耐藥情況 耐藥性分析結(jié)果顯示，肺炎克雷伯菌中對(duì)氨芐青霉素耐藥率最高，為85.4%(123例)，對(duì)亞胺培南、美羅培南的敏感性較高，分別為4.2%(6株)、7.6%(11株)。

2.2肺炎克雷伯菌的外排泵基因檢出情況 本研究一共檢測(cè)了7種類型外排泵基因，其中AcrAB-TolC 125例，占86.8%；emrD 120例，占83.3%；oqxA、oqxB均為114例，占79.2%；qacE1-sull 112例，占77.8%；tehA 98例，占68.1%；qepA未檢出。

2.3相關(guān)性分析 本研究檢出外排泵基因3～6個(gè)，檢出耐藥藥物品種1～10個(gè)，耐藥藥物品種數(shù)與外排泵基因存在正相關(guān)性(r=0.412，P<0.05)，其中qacE△1-sull的耐藥藥物品種數(shù)為5種，AcrAB-TolC、emrD、oqxA、oqxB、tehA耐藥藥物品種數(shù)為2種，明顯低于qacE△1-sull，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

肺炎克雷伯菌是人類呼吸道及腸道的常居菌，也是社區(qū)獲得性和醫(yī)院內(nèi)感染都相關(guān)的重要條件致病菌。近年來由該菌所致的院內(nèi)感染日漸增多，該菌對(duì)各種抗菌藥物的耐藥率及檢出的耐多藥肺炎克雷伯菌、耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌甚至泛耐藥肺炎克雷伯菌亦有增多趨勢(shì)，導(dǎo)致臨床醫(yī)生在治療該菌導(dǎo)致的感染時(shí)困難重重。2015年中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)顯示，在耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌中，以肺炎克雷伯菌最多，其對(duì)亞胺培南、美羅培南的耐藥率均超過10.0%，各醫(yī)院泛耐藥肺炎克雷伯菌的總檢出率達(dá)19.7%。

細(xì)菌耐藥一般為各種耐藥機(jī)制協(xié)同作用的結(jié)果，其中外排泵在細(xì)菌耐藥性方面發(fā)揮了重要作用。AcrAB-TolC是目前被廣泛研究的一種外排泵系統(tǒng)，AcrA是一種膜融合蛋白，橫跨細(xì)胞膜，將內(nèi)膜蛋白AcrB和外膜蛋白TolC連接在一起，使之形成一個(gè)貫穿細(xì)胞膜的密封通道，將藥物由胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)桨?。?nèi)膜蛋白AcrB負(fù)責(zé)攝取并轉(zhuǎn)運(yùn)特異的底物，外排多種抗菌藥物如內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類等，還能為整個(gè)AcrAB-TolC 泵提供能量。外膜蛋白TolC序列相對(duì)保守，可與不同的膜融合蛋白結(jié)合，形成多種外排泵的外膜通道。若TolC 基因缺失，則外排泵作用減弱，細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性隨之增加。若移除肺炎克雷伯菌的AcrAB-TolC泵，則細(xì)菌的適應(yīng)性、耐藥性及毒力都將改變。

本研究顯示，肺炎克雷伯菌的耐藥情況并不樂觀，盡管對(duì)亞胺培南、美羅培南的敏感性較高，但是對(duì)其他抗菌藥物都存在不同程度的耐藥。相關(guān)性分析顯示，肺炎克雷伯菌外排泵基因與耐藥性存在相關(guān)性，外排泵類型、數(shù)量都會(huì)增加耐藥風(fēng)險(xiǎn)，外排泵的基因攜帶數(shù)越多，則耐藥的藥物品種數(shù)也越多，qacE△1-sull對(duì)耐藥影響較大。外排泵基因類型較多，包括ABC超家族、MFS家族、RND家族、SMR家族、MATE家族等，不同類型的基因類型引起的耐藥機(jī)制不盡相同，目前已發(fā)現(xiàn)的外排泵基因超過30種[3-4]，本文簡(jiǎn)單分析了7種外排泵基，其中陽(yáng)性率最高為AcrAB-TolC，占86.8%，最低為qepA，未檢出。檢出的耐藥藥物品種為1～10個(gè)，qacE△1-sull的耐藥藥物品種數(shù)高于其他類型的基因。

外排泵基因的檢測(cè)在耐藥預(yù)測(cè)、合理用藥、耐藥機(jī)制分析方面有重要意義。外排泵抑制劑已進(jìn)入臨床研究階段，盡管尚無(wú)上市藥物，但是外排泵抑制劑具有重大的發(fā)展?jié)摿5-6]。近年來，局域外排泵基因、外排泵引起耐藥機(jī)制的研究越來越深入，有學(xué)者嘗試針對(duì)外排泵進(jìn)行新藥研發(fā)，如研發(fā)新的抗菌藥物劑型，對(duì)藥物從納米粒子、納米膠束、脂質(zhì)體等層面進(jìn)行改造，降低藥物外排泵引起的耐藥風(fēng)險(xiǎn)[7]。