中性粒細(xì)胞胞外陷阱在潰瘍性結(jié)腸炎中的研究進(jìn)展

羅 婷， 潘秀軍

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200092）

一般認(rèn)為中性粒細(xì)胞通過(guò)趨化、吞噬、脫顆粒等一系列作用抵御病原微生物入侵，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞還存在另一種特殊形式的免疫應(yīng)答，即通過(guò)產(chǎn)生中性粒細(xì)胞胞外陷阱（neutrophil extracellular trap，NET）參與機(jī)體的免疫防御[1]。最初對(duì)NET的研究主要集中在感染性疾病，后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，NET與自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展也密切相關(guān)。潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種常見(jiàn)的自身免疫性疾病，中性粒細(xì)胞在UC的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用[2]，但NET作為中性粒細(xì)胞發(fā)揮免疫功能的一種特殊結(jié)構(gòu)，在UC發(fā)病中的作用機(jī)制尚不明確，近年來(lái)逐漸引相關(guān)研究人員的關(guān)注。我們對(duì)NET在UC發(fā)病中的研究進(jìn)展作一綜述，以期對(duì)UC的診斷及治療提供進(jìn)一步的理論支持。

1 UC

UC是一種以腸道慢性炎癥性病變?yōu)橹饕卣鞯淖陨砻庖咝约膊?，典型的UC患者表現(xiàn)為便血、腹痛及腹瀉，目前內(nèi)鏡檢查是診斷UC的金標(biāo)準(zhǔn)[3]。UC的發(fā)病率在全球呈逐年上升趨勢(shì)，其病因涉及遺傳、環(huán)境和免疫等多種因素[4]，但具體的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確。已有研究結(jié)果表明，中性粒細(xì)胞在UC結(jié)腸黏膜中大量浸潤(rùn)，隨著活性氧的產(chǎn)生和絲氨酸蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶和髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）等一系列物質(zhì)的釋放，細(xì)胞進(jìn)入隱窩腔內(nèi)形成特征性的隱窩膿腫[5]。臨床上將中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)作為UC的組織病理學(xué)標(biāo)志，反映UC的黏膜破壞情況，腸黏膜組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞減少或消失可提示UC治療有效，因此可根據(jù)中性粒細(xì)胞黏膜浸潤(rùn)的變化情況進(jìn)行療效評(píng)估。然而，中性粒細(xì)胞在UC腸道黏膜中的確切作用機(jī)制仍不明確，NET作為中性粒細(xì)胞發(fā)揮作用的一種新形式，引起了研究者的關(guān)注[6-8]。

2 NET及其形成

1996年，TAKEI等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞存在一種特殊的死亡形式，這種形式有別于傳統(tǒng)的凋亡和壞死，在此過(guò)程中，中性粒細(xì)胞會(huì)經(jīng)歷一系列的形態(tài)變化，釋放出DNA和胞內(nèi)顆粒蛋白等物質(zhì)并最終死亡，但產(chǎn)生這一現(xiàn)象的具體機(jī)制尚不明確。2004年，BRINKMANN等[1]詳細(xì)報(bào)道了這一過(guò)程，并首次將釋放出的特殊結(jié)構(gòu)命名為NET，這是一種具有殺菌效應(yīng)的含有DNA和顆粒蛋白的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞能被佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）等多種因素激活，啟動(dòng)NET，即染色質(zhì)解聚，分葉核特性逐漸消失，嗜天青顆粒中的彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）被釋放并移位至胞核，作用于組蛋白使其降解，隨后顆粒膜和核膜逐漸崩解，顆粒中的MPO等其他多種蛋白質(zhì)進(jìn)入核內(nèi)，與解聚的染色質(zhì)混合，最終細(xì)胞膜破裂，混合了組蛋白、NE和MPO等多種胞內(nèi)蛋白質(zhì)的DNA網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)被釋放至胞外空間[10]。為了區(qū)別于細(xì)胞凋亡及壞死，這一過(guò)程被命名為NET[11]。目前的報(bào)道認(rèn)為NET存在3種形式[12]：（1）自殺式NET[13]，這一過(guò)程是經(jīng)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）及PKC-Raf-MERK-ERK通路實(shí)現(xiàn)的，一般需要2～4 h；（2）存活式NET[14]，此類NET釋放不伴有細(xì)胞膜的破裂，由相關(guān)刺激識(shí)別Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）和補(bǔ)體3（complement 3，C3）的補(bǔ)體受體誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞活化形成NET，以囊泡形式經(jīng)細(xì)胞膜釋放，而活化的中性粒細(xì)胞最終成為細(xì)胞膜完整的無(wú)核胞質(zhì)體，這種無(wú)核胞質(zhì)體仍然能夠吞噬病原體，被稱為存活式NET，通常需要5～60 min；（3）源于線粒體DNA的存活式NET，通過(guò)這種方式產(chǎn)生的NET，其結(jié)構(gòu)中的DNA來(lái)源于中性粒細(xì)胞線粒體，而前二者組分中的DNA均來(lái)自于細(xì)胞核，一般僅需15 min左右。

3 NET與UC

傳統(tǒng)理論認(rèn)為，中性粒細(xì)胞是通過(guò)趨化、吞噬和脫顆粒等一系列作用抵御病原微生物的入侵，而NET作為中性粒細(xì)胞固有免疫應(yīng)答的一種特殊形式，通過(guò)限制病原微生物活動(dòng)殺滅病原微生物，在抗微生物感染中發(fā)揮了積極作用。早期對(duì)NET的研究主要集中在感染性疾病，隨著研究的深入，越來(lái)越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)，NET也參與了其他一些非感染性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、UC等多種自身免疫性炎癥性疾病的發(fā)病過(guò)程[12]。然而有別于在感染性疾病中積極的抗感染作用，NET在非感染性疾病中可能發(fā)揮了消極作用，反而促進(jìn)了炎癥的發(fā)生和發(fā)展。因此，正確認(rèn)識(shí)NET在非感染性疾病中的作用對(duì)于闡明疾病的發(fā)生機(jī)制及對(duì)治療靶點(diǎn)的尋求具有重要意義。近年來(lái)，NET在UC發(fā)病中的研究也逐漸引起了相關(guān)人員的關(guān)注，并已取得了一些初步結(jié)果。

3.1 UC結(jié)腸黏膜中存在與NET相關(guān)的炎癥反應(yīng)

2011年，SAVCHENKO等[15]發(fā)現(xiàn)在UC患者結(jié)腸炎性黏膜中存在NET，并在NET的形成過(guò)程中伴隨著炎性蛋白正五聚蛋白（pentraxin，PTX）3的釋放。PTX3是PTX家族的成員之一，屬進(jìn)化中高度保守的模式識(shí)別蛋白家族[16]。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)和長(zhǎng)度的不同，PTX被分為2個(gè)組：一組是短PTX，主要包括C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）和血清淀粉樣物質(zhì)P組分（serum amyloid P-component，SAP），由肝臟產(chǎn)生；另一組為長(zhǎng)PTX，PTX3是最早被報(bào)道的長(zhǎng)PTX，被認(rèn)為是一種急性期蛋白，在健康人群中含量很低，當(dāng)受到白細(xì)胞介素-8（interleukin 8，IL-8）、TNF-α等炎癥因子刺激時(shí)，中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞釋放PTX3增加[17]。在UC患者中，PTX3主要來(lái)源于中性粒細(xì)胞，并且伴隨NET的形成而釋放，反映了腸黏膜炎癥的存在[15]。該研究還進(jìn)一步分析了NET、PTX3與UC炎癥程度的相關(guān)性，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)，按照Matts'分類標(biāo)準(zhǔn)將UC患者炎癥等級(jí)分為5級(jí)[18]，比較了不同等級(jí)患者結(jié)腸黏膜PTX3和NET的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著炎癥程度的增加，PTX3表達(dá)增強(qiáng)，同時(shí)伴隨NET形成增加，NET的形成、PTX3的釋放與UC的炎癥程度呈正相關(guān)。另外，NET形成還伴隨著促炎因子如S100蛋白質(zhì)類及天青殺素的釋放，進(jìn)一步加重了組織的炎癥反應(yīng)[15]。

隨后，有學(xué)者在不同的人群中采用不同的研究方法，均證實(shí)了UC中NET的存在。2015年BENNIKE等[19]針對(duì)UC成年患者開(kāi)展了一項(xiàng)蛋白質(zhì)組學(xué)研究，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)10例成年UC患者和10名健康對(duì)照者的結(jié)腸黏膜組織進(jìn)行蛋白質(zhì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有46種蛋白質(zhì)在2個(gè)組研究對(duì)象中存在表達(dá)差異，其中11種蛋白質(zhì)與中性粒細(xì)胞和NET相關(guān)，包括乳鐵蛋白、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、MPO、S100-A9蛋白、S100-A12蛋白和組織蛋白酶G等。同時(shí)，通過(guò)DNA染色的方式觀察到了UC患者腸道黏膜組織中的NET。值得一提的是，該項(xiàng)研究收集的UC患者腸道黏膜組織樣本均來(lái)自于肉眼所見(jiàn)形態(tài)學(xué)正常的腸黏膜，表明在UC患者中表觀正常的腸黏膜組織也已存在與NET相關(guān)的炎癥反應(yīng)，推測(cè)NET可能在發(fā)病的早期即存在，且參與了早期炎癥反應(yīng)。GOTTLIEB等[20]對(duì)6例兒童UC患者和2名兒童健康對(duì)照者的結(jié)腸黏膜組織進(jìn)行免疫熒光分析，對(duì)NET主要組分的DNA、組蛋白、彈性蛋白酶和MPO作多重?zé)晒馊旧筮M(jìn)行圖像采集，在所有患者結(jié)腸黏膜組織中均觀察到NET，而健康對(duì)照者均未表達(dá)。DINALLO等[21]的最新研究分別采用蛋白免疫印跡法和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)了23例UC患者和12例結(jié)腸癌患者的腸黏膜組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)UC患者腸黏膜組織中的NET相關(guān)蛋白NE、MPO和組蛋白H3等的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組，也證實(shí)了NET在UC患者中表達(dá)上調(diào)，而高表達(dá)的NET又能促進(jìn)UC患者黏膜固有層單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α和白細(xì)胞介素-1β（interleukin 1 beta ，IL-1β），進(jìn)一步加劇了炎癥狀態(tài)。

綜上所述，成人及兒童UC患者的腸道組織中均證實(shí)了NET的存在，推測(cè)NET可能參與了疾病早期的炎癥反應(yīng)，并且高表達(dá)的NET又能促進(jìn)炎癥因子的釋放，加劇炎癥反應(yīng)。

3.2 UC中NET的生成與降解失衡導(dǎo)致其高表達(dá)

一般情況下，機(jī)體內(nèi)NET的生成與降解之間維持著動(dòng)態(tài)平衡，如果NET的生成增加或降解減少將導(dǎo)致其高表達(dá)，而過(guò)量的NET長(zhǎng)時(shí)間存在于體內(nèi)會(huì)引起組織損傷。

3.2.1 UC患者NET生成增加 在感染性疾病中，NET由多種病原微生物刺激形成[12]，而在自身免疫性疾病等非感染性炎癥性疾病中，IL-8、TNF-α、LPS、IL-17A和抗蛋白酶3型中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體（proteinase 3-antineutrophil cytoplasmic antibody，PR3-ANCA）[21-24]等多種因子可刺激NET形成。

TNF-α是一種促炎介質(zhì)，在UC患者中高表達(dá)，并且與UC患者腸黏膜炎癥程度呈正相關(guān)[25]。DINALLO等[21]不僅證實(shí)了UC患者腸黏膜組織中NET高表達(dá)，也證明了UC患者體內(nèi)的中性粒細(xì)胞可在TNF-α的刺激下形成NET，而經(jīng)抗TNF-α治療后的UC患者中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NET的能力明顯降低。目前，使用生物制劑英夫利昔單抗治療UC是一項(xiàng)較為成熟的方案，而英夫利昔的作用成分正是一種針對(duì)TNF-α的特異性抗體，根據(jù)DINALLO等[21]的研究結(jié)果推測(cè)，英夫利昔可能不僅能通過(guò)拮抗TNF-α達(dá)到治療目的，而且能使TNF-α刺激NET的形成減少，從而阻斷了NET促進(jìn)黏膜固有層單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)一步產(chǎn)生TNF-α和IL-1β等這一炎癥的放大過(guò)程，達(dá)到明顯減輕炎癥反應(yīng)的治療效果。

IL-8是一種趨化因子，在炎癥部位中性粒細(xì)胞的活化和聚集中發(fā)揮重要作用[23]，有學(xué)者推測(cè)IL-8可能參與到了NET的形成過(guò)程，這一推測(cè)由BRINKMANN等[1]最先證實(shí)，即中性粒細(xì)胞在IL-8刺激過(guò)后能夠形成NET。隨后又有報(bào)道顯示，胎盤來(lái)源的IL-8可在體外刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NET[26]，而這一過(guò)程可被抗IL-8中和抗體所阻斷，說(shuō)明IL-8這一炎癥因子在NET形成過(guò)程中發(fā)揮了積極的作用。在UC中IL-8高表達(dá)[27]，從而推測(cè)高表達(dá)的IL-8促進(jìn)了UC患者NET的形成，但目前抗IL-8治療的相關(guān)研究仍未取得預(yù)期的效果。

一項(xiàng)抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體（antineutrophil cytoplasmic antibody，ANCA）相關(guān)性血管炎的研究表明[24]，由ANCA介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞激活可誘導(dǎo)NET形成，NET的形成有賴于中性粒細(xì)胞的激活，抗蛋白酶3型中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體（antiproteinase 3 antineutrophil cytoplasmic antibody，抗-PR3 ANCA）或抗髓過(guò)氧化物酶型中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體（anti-myeloperoxidase antineutrophil cytoplasmic antibody，抗-MPO ANCA）自身抗體可通過(guò)結(jié)合中性粒細(xì)胞表面的PR3或MPO抗原激活中性粒細(xì)胞，促進(jìn)NET的形成。有研究證實(shí)，一部分UC患者血清中存在著抗-PR3 ANCA，是臨床輔助診斷炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）的一種血清學(xué)標(biāo)志物[28]，然而抗-PR3 ANCA在UC患者NET的形成中究竟發(fā)揮了怎樣的作用，也是值得關(guān)注的一個(gè)研究節(jié)點(diǎn)。

3.2.2 UC患者NET降解受損 DNA酶I（dexoyribonuclease I，DNase I）是機(jī)體內(nèi)降解NET的主要酶，這一酶的缺陷將直接導(dǎo)致NET的降解受損[29]。如在SLE中，NET的生成與降解失衡導(dǎo)致了大量NET的堆積，一方面，MPO、抗菌肽LL-37等NET蛋白質(zhì)組分出現(xiàn)在細(xì)胞外空間并持續(xù)存在，刺激宿主免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，進(jìn)而產(chǎn)生相應(yīng)的自身抗體，造成組織損傷；另一方面，SLE患者基因突變導(dǎo)致DNase I活性降低，NET降解受損，使得NET組分抗原持續(xù)暴露，加劇了免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)機(jī)體持續(xù)產(chǎn)生自身抗體，進(jìn)一步加重了疾病的進(jìn)展。有研究表明，在IBD患者體內(nèi)DNase I的活性顯著低于健康對(duì)照組，且與英夫利昔單抗的治療效果無(wú)關(guān)，表明IBD患者DNase I活性降低是一種固有缺陷，可能類似于SLE，由于遺傳突變成為易感個(gè)體，直接影響了IBD的發(fā)生與發(fā)展[30]。由此可以推測(cè)，由于IBD患者體內(nèi)存在DNase I活性缺陷，導(dǎo)致對(duì)NET降解能力下降，NET的大量堆積進(jìn)一步促進(jìn)患者結(jié)腸黏膜單個(gè)核細(xì)胞釋放多種炎癥因子，加劇了組織的炎癥反應(yīng)。此外，患者體內(nèi)的NET組分與相應(yīng)的多種自身抗體結(jié)合，可能是阻礙DNase I對(duì)NET降解的原因之一。因此，尋找NET降解的影響因素，阻斷NET堆積引發(fā)的嚴(yán)重炎癥反應(yīng)，對(duì)UC潛在治療靶點(diǎn)的探索具有積極作用。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，UC的發(fā)病機(jī)制可能是遺傳易感個(gè)體在外界環(huán)境作用下發(fā)生了異常免疫反應(yīng)，產(chǎn)生自身抗體并釋放炎癥因子，而UC患者高表達(dá)的IL-8、TNF-α等炎癥因子和自身抗體抗-PR3 ANCA可促進(jìn)中性粒細(xì)胞形成NET。一方面過(guò)量的NET組分持續(xù)暴露誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生更多的自身抗體加重免疫損傷；另一方面，NET又能刺激腸道黏膜固有層的單個(gè)核細(xì)胞釋放更多的炎癥因子，加劇機(jī)體的炎癥狀態(tài)。此外，UC患者體內(nèi)DNase I活性降低可能影響了體內(nèi)NET的正常降解，導(dǎo)致NET進(jìn)一步堆積，促進(jìn)病情的發(fā)展。

目前，NET在UC中的研究均為小樣本，得出的多為表達(dá)差異性結(jié)果，尚有待更多大樣本研究來(lái)驗(yàn)證并揭示NET在UC發(fā)病中的確切作用機(jī)制。在接下來(lái)的研究中應(yīng)一方面考慮阻斷使NET形成增加的影響因素，另一方面嘗試修復(fù)DNase I活性以期恢復(fù)體內(nèi)正常的NET降解過(guò)程，通過(guò)體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)加以論證，從而為UC治療潛在靶點(diǎn)的探索提供理論支持。