銅綠假單胞菌轉(zhuǎn)錄因子PsrA全局調(diào)控研究進(jìn)展

李嬋嬋， 王 茹， 羅文英

（廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，廣東 湛江 524001）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是引起院內(nèi)感染主要的革蘭陰性桿菌，為人體最重要的條件致病菌之一，可引起機(jī)體多系統(tǒng)、多臟器和多部位的感染。2015年全國細(xì)菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)對全國1 338所醫(yī)院上報(bào)的非重復(fù)細(xì)菌調(diào)查發(fā)現(xiàn)：革蘭陰性菌中PA位居第三，僅次于大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌[1]。如此高的耐藥率，主要與它的生物膜形成有關(guān)。PA能產(chǎn)生多種致病物質(zhì)，主要是內(nèi)毒素、外毒素、蛋白分解酶和殺白組胞素，其致病特點(diǎn)是引起繼發(fā)感染，多發(fā)生在機(jī)體抵抗力降低時(shí)，如大面積燒傷、長期使用免疫抑制劑等。臨床上常見的有皮膚和皮下組織感染以及中耳炎、腦膜炎，呼吸道感染、尿道感染和血流感染等。

PA的生物膜、毒力及其生長受多個(gè)基因調(diào)控，信號通路復(fù)雜。有研究發(fā)現(xiàn)，TetR家族中細(xì)菌PsrA轉(zhuǎn)錄因子是其中重要的因素[2]，參與了PA侵襲、附著、蜂動(dòng)能力與毒力因素的調(diào)節(jié)。TetR家族是細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境的一種機(jī)制，主要通過TetR轉(zhuǎn)錄因子的抑制或激活調(diào)控基因表達(dá)，進(jìn)而控制自身對于不同外部條件的適應(yīng)[3]，大多數(shù)細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄因子PsrA含有2個(gè)結(jié)構(gòu)域：一個(gè)是接受信號的結(jié)構(gòu)域，另一個(gè)是DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域[4]。本文就PA轉(zhuǎn)錄因子PsrA的致病機(jī)制進(jìn)行綜述，以期為開發(fā)有針對性的藥物提供理論依據(jù)。

1 長鏈脂肪酸（long-chain fatty acid，LCFA）通過PsrA調(diào)控生物膜和毒力因子釋放

1.1 PA通過肺泡活性物質(zhì)獲取營養(yǎng)，利用外源LCFA作為碳源適應(yīng)肺部生長環(huán)境

1.1.1 PA對于LCFA的趨向性 PA對相應(yīng)長度的LCFA（如油酸）具有明顯的趨向性。PA的進(jìn)化系統(tǒng)十分復(fù)雜，有鞭毛的PA可以在液體中移動(dòng)，菌毛則可以幫助PA在固體表面（瓊脂或人體組織）上滑動(dòng)和蠕動(dòng)[5]。有鞭毛的PA可以利用Ⅳ型菌毛（type Ⅳ pili，T4P），通過菌毛附肢的延伸，附著在固體基質(zhì)上，通過回縮有效地幫助細(xì)菌穿過固體表面，T4P還參與各種功能，包括微菌落形成、生物膜啟動(dòng)和遠(yuǎn)程電子轉(zhuǎn)移。

有研究發(fā)現(xiàn)，鞭毛和T4P在相應(yīng)的液體或固體中運(yùn)動(dòng)，往往有其各自的趨向性（如氧張力、pH和特定的化學(xué)物質(zhì)），磷脂酰乙醇胺或磷脂酰膽堿是PA運(yùn)動(dòng)的趨化劑。在營養(yǎng)采集、生物膜和毒力形成過程中，PA都展現(xiàn)了T4P趨向LCFA的作用[5]。另一方面，在PA感染的人支氣管肺泡灌洗液的脫落細(xì)胞提取物中，各種獨(dú)立的分離物也同樣表現(xiàn)出對磷脂酰乙醇胺的誘導(dǎo)趨化性。

1.1.2 PA的外源性LCFA來源 肺泡活性物質(zhì)是PA重要的外源性LCFA來源。哺乳動(dòng)物的肺被肺表面活性劑包裹，該表面活性劑由大約10%的蛋白質(zhì)和90%的脂質(zhì)組成，其中大約80%的肺表面活性劑的脂質(zhì)為磷脂酰膽堿[6]。PA產(chǎn)生磷脂酶C和脂肪酶，可以將外源磷脂酰膽堿分解為3種成分：磷酸膽堿頭基、甘油和2個(gè)LCFA[7]。而肺部囊性纖維化過程中，PA通過獲取磷脂酰膽堿進(jìn)行代謝生長，達(dá)到很高的細(xì)胞密度，具體過程為：通過細(xì)菌磷脂酶C和脂肪酶對磷脂酰膽堿進(jìn)行酶切，釋放出磷酸膽堿的頭基、甘油分子和2個(gè)LCFA。目前已鑒定出5種潛在的脂肪酸降解的操縱子（相關(guān)fadBA-操縱子fadBA1～5）[8]。這一脂肪酸降解途徑是通過外膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白FadL和內(nèi)膜相關(guān)的CoA連接酶對LCFA進(jìn)行跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)。在攝取LCFA后，LCFA有2個(gè)去向：一是通過β-氧化途徑降解，并通過三羧酸循環(huán)成為能源/碳源；二是作為膜磷脂生物合成的前體[6]。在細(xì)菌磷脂酶C和脂肪酶對磷脂酰膽堿進(jìn)行的酶促裂解釋放的3種成分中，LCFA被高度還原，并產(chǎn)生最多的碳和能量。在PA龐大的毒力因子庫中，大多數(shù)僅在高細(xì)胞密度復(fù)制過程中表達(dá)，且受喹諾酮信號調(diào)控[6]。因此，肺泡活性物質(zhì)不僅可作為PA的趨化劑，還為PA生長提供碳源，與PA的生物膜、毒力因子生成有關(guān)。

1.2 LCFA通過PsrA調(diào)控fadBA5 β-氧化操縱子、RpoS和Ⅲ型分泌物exsCEBA-Operon的表達(dá)

1.2.1 PA PsrA響應(yīng)LCFA的信號調(diào)節(jié)fadBA5 β-氧化操縱子 有研究發(fā)現(xiàn)，在感染PA的急性肺炎小鼠模型中，鞘氨醇和磷脂酰膽堿都發(fā)揮了重要的作用，其中磷脂酰膽堿組分LCFA的降解可能通過3種不同的β-氧化途徑發(fā)生，涉及3個(gè)fadBA操縱子（fadAB1-PA1737和PA1736、fadAB4-PA4786和PA4785、fadBA5-PA3014和PA3013）[9]。其中，fadBA5操縱子對LCFA信號有反應(yīng)，在PsrA存在的條件下可被LCFA誘導(dǎo)，使LCFA與PsrA結(jié)合，進(jìn)而抑制fadBA5[10]。

為了使外源脂肪酸能在PA內(nèi)被降解，必須首先通過膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將其轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，然后通過脂肪?；o酶A合成酶在三磷酸腺苷和輔酶A的參與下活化脂肪酸?；罨闹舅峥蛇M(jìn)入β-氧化途徑。在不存在脂肪酸的情況下，轉(zhuǎn)錄因子FadR會(huì)抑制編碼β-氧化所需酶（FadL、FadD、FadE和FadBA）的基因[11]。

1.2.2 LCFA通過PsrA調(diào)控RpoS和Ⅲ型分泌物exsCEBA-Operon 在小鼠感染模型中，PA發(fā)揮感染、毒力作用最強(qiáng)的為Ⅲ型分泌系統(tǒng)（type Ⅲsecretion system，TTSS）。TTSS是一種專門的蛋白質(zhì)分泌裝置，由25個(gè)以上的基因編碼，在被激活時(shí)，TTSS分泌效應(yīng)分子進(jìn)入宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，導(dǎo)致靶細(xì)胞功能障礙或死亡[12]。

TTSS和效應(yīng)基因由轉(zhuǎn)錄因子ExsA結(jié)合其共有序列（TNAAAANA）大約50個(gè)堿基而被激活[13]。調(diào)控蛋白ExsD是一種抗激活劑、負(fù)調(diào)節(jié)劑，可與ExsA結(jié)合并阻止其激活TTSS基因轉(zhuǎn)錄。蛋白ExsC通過直接結(jié)合ExsD，阻斷ExsD與ExsA作用[13]。當(dāng)TTSS通道關(guān)閉時(shí)，ExsE與ExsC結(jié)合，但是有信號激活時(shí)，ExsE可被分泌到胞外，從而使ExsC可以自由地與ExsD相互作用并釋放ExsA，最后ExsA激活TTSS表達(dá)[13]。然而，除ExsD外，蛋白ExsA、ExsC和ExsE的基因都位于同一個(gè)操縱子exsCEBA中[14]。

exsCEBA啟動(dòng)子的活性決定了exsCEBA對TTSS具有重要的調(diào)控作用。而PsrA可以與exsCEBA啟動(dòng)子結(jié)合。有研究發(fā)現(xiàn)，PsrA是exsCEBA以及TTSS效應(yīng)子（如exoS）完整表達(dá)的必要條件[14]。DNA結(jié)合研究結(jié)果證實(shí)，LCFA抑制了PsrA與rpos和exsC啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，LCFA通過PsrA直接影響這2個(gè)基因的激活[14]，且這種影響在細(xì)菌培養(yǎng)的整個(gè)對數(shù)期均保持較高水平。存在LCFA的情況下，PsrA-LCFA復(fù)合物使PsrA脫離exsC和rpoS基因的啟動(dòng)子，exsC和rpoS表達(dá)下降。

大量的毒力決定因子（LasA/LasB蛋白酶、堿性蛋白酶、磷脂酶、脂肪酶、外毒素A、Ⅲ型切片外酶S/T/U/Y、鼠李糖脂、藻酸鹽和氰化氫合成等）與PA的TTSS有關(guān)[15]。而細(xì)菌獲得營養(yǎng)對細(xì)菌毒力因子的形成非常重要，因?yàn)榧?xì)菌的毒力表達(dá)和營養(yǎng)物獲得（如碳源）之間存在相互作用，獲得營養(yǎng)是毒力因子產(chǎn)生的前提。肺泡表面活性物質(zhì)作為一種外源LCFA來源，是細(xì)菌生長的重要營養(yǎng)物質(zhì)，在PA生長中起重要作用。PA通過PsrA的表達(dá)直接利用肺泡表面活性物質(zhì)影響毒力因子的生成。

2 PsrA調(diào)控PA耐藥性及生物膜的形成

2.1 PA通過PsrA對陽離子型抗菌肽（cationic intrinsically disordered antimicrobial peptide，CIDAMP）的誘導(dǎo)，參與內(nèi)在多黏菌素和抗菌肽抗性

2.1.1 CIDAMP的結(jié)構(gòu) 抗菌肽作為重要的先天免疫劑，存在于植物、昆蟲與哺乳動(dòng)物體內(nèi)。因此，抗菌肽被越來越多地用作前瞻性抗菌藥物的模板，也被稱為CIDAMP。它們的特征在于具有正凈電荷及適度長度，并具有良好的水溶性。陽離子型抗微生物肽會(huì)結(jié)合并穿透細(xì)菌細(xì)胞膜，通過物理破壞，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞膜裂解，最終導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞死亡，可替代常規(guī)抗菌藥物。這些CIDAMP的優(yōu)勢在于：（1）與人宿主的兩性離子哺乳動(dòng)物膜相比，它們對帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜具有高度選擇性；（2）由于肽通過物理作用破壞細(xì)胞而發(fā)揮功能，因此在靶向方面沒有特異性膜，一般不會(huì)引起細(xì)菌耐藥[16]。

有研究發(fā)現(xiàn)，有些氨基酸殘基會(huì)促進(jìn)有序蛋白變成結(jié)構(gòu)混亂的無序蛋白，即使在包含了促進(jìn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)無序化的氨基酸實(shí)驗(yàn)中，線性陽離子肽都是有效的殺菌劑，因此該離子肽效應(yīng)與氨基酸序列無關(guān)[16]。這些CIDAMP的抗菌活性取決于肽鏈長度、凈電荷、脂化作用和環(huán)境條件，影響病程發(fā)展的簡單氨基酸序列，或者幾乎天然存在的氨基酸序列都可以刺激產(chǎn)生大量的CIDAMP[17]。這些是針對PA、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和真菌等各種細(xì)菌病原體的潛在的新型抗菌藥物。

2.1.2 CIDAMP 具有正常皮膚的健康人很少發(fā)生PA感染，PA的潛在抗菌肽來源可能是內(nèi)分泌汗腺，這些汗腺產(chǎn)生了汗液特異性抗菌肽皮膚鐵蛋白[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，CIDAMP是高效的PA靶向肽抗菌藥物，并且對人體具有較低的細(xì)胞毒性。PA的psra基因是對陽離子抗微生物劑的抗性和毒力特征的重要調(diào)節(jié)劑，介導(dǎo)陽離子肽抗性和某些與毒力相關(guān)的過程，如生物膜形成、快速附著和成群運(yùn)動(dòng)[18]。

多黏菌素是治療耐藥性PA最后的選擇[19]，而psra轉(zhuǎn)錄可以調(diào)節(jié)抗菌肽的激活，對內(nèi)在的抗菌肽和多黏菌素B抗性形成都有貢獻(xiàn)。在psra突變體中，PA外膜的通透性改變，加強(qiáng)聚陽離子分子（如多黏菌素B和抗菌肽）透過外膜進(jìn)入胞內(nèi)。具體過程為：聚陽離子分子與膜上脂多糖的二價(jià)陽離子結(jié)合位點(diǎn)相互作用[20]，導(dǎo)致膜發(fā)生滲透損傷而攝入大量的聚陽離子分子，而多黏菌素B和抗菌肽被證實(shí)在psra突變體中滲透更高[18]。

2.2 PsrA通過調(diào)節(jié)LexA蛋白來介導(dǎo)1類整合子整合酶基因的表達(dá)

2.2.1 LexA蛋白與1類整合子 LexA是調(diào)節(jié)細(xì)菌應(yīng)激反應(yīng)途徑的阻遏蛋白，能在不同種類細(xì)菌之間轉(zhuǎn)錄調(diào)控，調(diào)控細(xì)菌對抗菌藥物的耐藥性。應(yīng)激情況下，LexA蛋白可被水解，使應(yīng)激反應(yīng)性基因被抑制。LexA失活的菌體對抗菌藥物的耐藥性顯著降低，并且對傳統(tǒng)的抗菌藥物也高度敏感[21]，RpoS和PsrA蛋白在LexA蛋白質(zhì)對整合酶轉(zhuǎn)錄的調(diào)控中起到調(diào)節(jié)作用。

PA在進(jìn)化過程中存在信息交流行為[22]，1類整合子能在細(xì)菌間快速傳播，被認(rèn)為是影響抗菌藥物抗性基因編碼的重要因素[23]。在整合子的快速傳播作用下，多重耐藥PA在臨床環(huán)境中有增加的趨勢，幾乎50%的多重耐藥PA攜帶整合子。根據(jù)intI基因序列的差異，整合子分為幾個(gè)不同的類別，第1～3類是重要的可移動(dòng)元件，主要通過質(zhì)粒或轉(zhuǎn)座子傳播。整合子中的基因讓PA獲得了β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、氯霉素、磺胺類、甲氧芐啶、紅霉素、喹諾酮類、磷霉素、季銨化合物防腐劑和其他臨床常用抗菌藥物的抗性。

2.2.2 細(xì)菌通過PsrA影響RpoS調(diào)節(jié)LexA蛋白與intI基因表達(dá) 細(xì)菌經(jīng)常暴露在不穩(wěn)定的環(huán)境中，通過各種基因表達(dá)使自身達(dá)到與環(huán)境相適應(yīng)的狀態(tài)。暴露于多種環(huán)境壓力下，還可能產(chǎn)生有毒化合物，這些化合物可能對細(xì)菌本身有害。因此，PA產(chǎn)生了一套適應(yīng)和克服外部和內(nèi)部有害影響的機(jī)制。在刺激性環(huán)境中，應(yīng)激系統(tǒng)會(huì)被激活，以維持基因組完整性，并維持PA較好的生長狀態(tài)。 LexA蛋白可通過對RNA聚合酶的變構(gòu)干擾來抑制細(xì)菌的應(yīng)激反應(yīng)。當(dāng)感染PA時(shí)，應(yīng)激系統(tǒng)被激活，LexA蛋白水解失活和intI1基因表達(dá)被激活。RpoS是這些應(yīng)激反應(yīng)的中心調(diào)節(jié)因子，主要監(jiān)管機(jī)構(gòu)是PsrA，而PsrA主要通過影響調(diào)節(jié)信號——喹諾酮信號來影響RpoS的形成[21]。

2.3 PA PsrA通過喹諾酮信號調(diào)控生物膜形成

細(xì)菌生物膜的細(xì)胞外聚合物質(zhì)可作為基質(zhì)將細(xì)菌細(xì)胞保持在一起。PA的細(xì)胞外聚合物生物膜是多糖、核酸和蛋白質(zhì)的混合物。生物膜發(fā)育不同階段的多糖合成位點(diǎn)（胞外多糖Psl）的產(chǎn)物肉眼可見，在附著過程中，胞外多糖Ps1以螺旋狀錨定在細(xì)胞表面，促進(jìn)細(xì)胞間的相互作用和基質(zhì)的形成，生成的基質(zhì)將細(xì)菌保留在生物膜中。在生物膜成熟過程中，胞外多糖Psl會(huì)積聚在微菌落的外圍，從而在微菌落中心形成無Psl基質(zhì)的空腔。在分散階段，活動(dòng)力強(qiáng)的細(xì)胞、死細(xì)胞和細(xì)胞外DNA被釋放到空腔中進(jìn)行播散[24]，進(jìn)而成為PA生物膜形成的機(jī)制——建立基質(zhì)，然后形成1個(gè)空腔，最后釋放細(xì)胞播散[25]。

PA擁有一個(gè)復(fù)雜的群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)由4個(gè)系統(tǒng)組成，控制著細(xì)菌的相互作用和毒力因素的表達(dá)，如毒力因子、成群的運(yùn)動(dòng)力和生物膜。其中喹諾酮信號系統(tǒng)生成PA喹諾酮信號（Pseudomonas aeruginosaquinolone signal，PQS），通過激活pqsABCDE操縱子形成正反饋回路，生成更多的PQS[26-27]。

PQS生物合成首先由一種鄰氨基苯甲酸輔酶—A PqsA連接酶開始[28]。PqsA通過CoA收集鄰氨基苯甲酸以形成茴香酰-CoA，丙二酰-CoA通過PqsD的作用，被PqsB和PqsC催化與辛?；o酶A結(jié)合形成2-庚基-4-喹諾酮[29-30]。最后單加氧酶PqsH催化2-庚基-4-喹諾酮形成PQS。有研究發(fā)現(xiàn)，PsrA通過脂肪酸β-氧化途徑，抑制PA0506的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而正向影響PQS產(chǎn)生，使得?；o酶A化合物向烯酰輔酶A化合物的轉(zhuǎn)化減少，從而允許部分辛酰輔酶A逃脫β-氧化途徑并形成PQS[31]。

PQS除作為QS信號分子發(fā)揮作用外，還可介導(dǎo)鐵吸收，與生物膜、細(xì)胞毒性、外膜囊泡有關(guān)[32]。PsrA在影響PQS形成的同時(shí)，也影響了PA生物膜的形成[33]。

3 結(jié)論與展望

PsrA不但與PA的生物膜形成有關(guān)，還與其耐藥性、細(xì)胞毒性、主動(dòng)免疫活動(dòng)有關(guān)。一般情況下，PsrA能以協(xié)作的方式發(fā)揮作用，使其立即參與免疫保護(hù)和營養(yǎng)獲取。PsrA的產(chǎn)生可能會(huì)改變細(xì)菌種群的整個(gè)結(jié)構(gòu)，從而提高其在多種環(huán)境中的適應(yīng)性，并建立起對環(huán)境壓力的抵抗力。此外，我們推測PsrA仍然存在未知的功能，因此有必要進(jìn)行更多的研究，以探索PsrA在開發(fā)現(xiàn)代生物技術(shù)和治療傳染病方面的潛在應(yīng)用。