乙型肝炎患者胎盤(pán)組織中GSK-3β表達(dá)與HBV母嬰傳播的關(guān)系

宋文婷

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110001）

我國(guó)是乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）攜帶者的高發(fā)國(guó)家，其中母嬰傳播是慢性HBV 感染的主要原因，約占30%[1]。約90%圍生期感染HBV 者及約30%嬰幼兒時(shí)期HBV 感染者可發(fā)展成慢性感染，最終可進(jìn)展為肝硬化、肝癌，嚴(yán)重影響兒童正常生長(zhǎng)發(fā)育及威脅生命健康[2]。近幾年來(lái)臨床采取聯(lián)合注射乙型肝炎（以下簡(jiǎn)稱乙肝）免疫球蛋白及乙肝疫苗的方法在阻斷HBV 母嬰傳播方面獲得較大成功，但仍有近20%左右的嬰兒因出生時(shí)已宮內(nèi)感染HBV 而導(dǎo)致免疫失敗[3]。有研究顯示[4]，胎盤(pán)組織感染和宮內(nèi)感染關(guān)系密切。HBV 可通過(guò)感染胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞而逐步滲透，最終感染胎兒。糖原合成激酶3β（glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β）在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)中具有重要作用，其作為磷脂酰肌醇3-激酶/（絲氨酸/蘇氨酸）（PI3K/Akt）信號(hào)通路的下游蛋白，可通過(guò)正、負(fù)反饋調(diào)節(jié)控制PI3K/Akt 生物活性，有研究表明[5]，乙肝病毒X 蛋白高表達(dá)可通過(guò)調(diào)控GSK-3β 表達(dá)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移。但目前關(guān)于胎盤(pán)組織中GSK-3β 表達(dá)與母嬰傳播關(guān)系的報(bào)道尚少，本研究檢測(cè)乙肝孕婦與正常孕婦胎盤(pán)組織中GSK-3β 表達(dá)情況，并分析其與HBV 母嬰傳播的關(guān)系，為臨床預(yù)防提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年4月—2018年1月在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院定期產(chǎn)檢及分娩的乙肝孕婦189 例（研究組），另選取正常孕婦106 例（對(duì)照組）。其中研究組年齡23 ～37 歲，平均（29.45±3.17）歲；孕32 ～40 周，平均（36.87±2.11）周；單胎。對(duì)照組年齡22 ～38 歲，平均（29.39±3.21）歲；孕30 ～41 周，平均（36.94±2.25）周；單胎。兩組年齡及孕周比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①研究組符合乙肝診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，孕期無(wú)抗病毒治療史。對(duì)照組正常妊娠；②兩組孕婦孕周＞28 周，且孕28 周前經(jīng)B超檢查胎兒發(fā)育正常；③配偶為非乙肝；④均簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①血清甲、丙、戊型等肝炎病毒及人類(lèi)免疫缺陷病毒陽(yáng)性者；②伴有梅毒、單純皰疹病毒感染陽(yáng)性者；③伴有脂肪肝、藥物性肝炎、免疫性肝炎者；④有先兆流產(chǎn)史者；⑤伴有妊娠期糖尿病、高血壓、腎病等其他內(nèi)科疾病者。研究獲本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 HBV-DNA 定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海申友生物技術(shù)有限公司，GSK-3β 兔抗人多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling 公司，羊抗兔二抗抗體及DAB 顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，顯微鏡購(gòu)自北京上光儀器有限公司。

1.2.2 外周血HBV-DNA 定量檢測(cè) 產(chǎn)前抽取研究組孕婦肘靜脈血5 ml，離心分離血清，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）對(duì)HBV-DNA 進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作。

1.2.3 胎 盤(pán) 組 織GSK-3β 表 達(dá) 檢 測(cè) 于 孕 婦胎盤(pán)娩出后30 min 內(nèi)留取全層胎盤(pán)組織大小約1.0 cm×1.0 cm×1.5 cm，置入10%甲醛溶液中浸泡固定后石蠟包埋，并4 μm 切片備用，采用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)胎盤(pán)組織GSK-3β 表達(dá)情況；另通過(guò)攝像機(jī)將所測(cè)目標(biāo)的各種信息轉(zhuǎn)換成數(shù)字圖像，并傳遞至計(jì)算機(jī)系統(tǒng)（全自動(dòng)彩色圖像分析系統(tǒng)），標(biāo)定組織片的空白處射光的吸光度值，在監(jiān)視器上使用不同的分割方法及編輯功能計(jì)算GSK-3β 陽(yáng)性細(xì)胞平均吸光度值（每張切片觀察10 個(gè)視野）。

1.2.4 新生兒血清乙肝5 項(xiàng)（乙肝兩對(duì)半）檢測(cè) 于新生兒出生后24 h 內(nèi)采集股靜脈血4 ml，離心分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清乙肝病毒表面抗原（HBsAg）、乙肝病毒表面抗體（HBsAb）、乙肝病毒e 抗原（HBeAg）、乙肝病毒e 抗體（HBeAb）、乙肝病毒核心抗體（HBcAb）表達(dá)情況，試劑盒購(gòu)自廣東中山生物有限公司，結(jié)果運(yùn)用陽(yáng)性（+）、陰性（-）表示；此外，并采用qRT-PCR 法對(duì)HBV-DNA 進(jìn)行檢測(cè)（試劑盒及操作步驟同上）。

1.3 觀察指標(biāo)及方法

1.3.1 研究組與對(duì)照組胎盤(pán)組織GSK-3β 表達(dá)及吸光度值 胎盤(pán)組織中以細(xì)胞核或胞內(nèi)有棕黃色顆粒定為GSK-3β 陽(yáng)性表達(dá)，將＜10%細(xì)胞核或胞內(nèi)染色歸入為陰性（-），≥10%細(xì)胞核或胞內(nèi)染色歸入為陽(yáng)性（+），并分析GSK-3β 吸光度值。

1.3.2 研究組不同HBV-DNA 滴度胎盤(pán)組織GSK-3β 表達(dá)及吸光度值 將HBV-DNA 滴度分為＞1×102copy/ml 與≤1×102copy/ml 兩類(lèi)，比較胎盤(pán)組織GSK-3β 表達(dá)及吸光度值。

1.3.3 研究組新生兒HBV 感染發(fā)生情況 新生兒外周血HBsAg 陽(yáng)性和/或HBV-DNA 陽(yáng)性定為HBV 感染存在，并根據(jù)感染情況將研究組所有新生兒分為感染組與未感染組，檢測(cè)感染組與未感染組母體胎盤(pán)組織GSK-3β 表達(dá)及吸光度值。

1.3.4 胎盤(pán)組織GSK-3β 表達(dá)與研究組新生兒HBV感染的關(guān)系 采用Logistic 多元逐步回歸模型進(jìn)行分析，將孕婦年齡、血清HBV-DNA 載量、血清HBeAg表達(dá)及胎盤(pán)組織GSK-3β 表達(dá)設(shè)為自變量，其中孕婦年齡＜35 歲、血清HBV-DNA 載量≤1×102copy/ml、血清HBeAg 陰性及胎盤(pán)組織GSK-3β 陰性表達(dá)均賦值為0，將孕婦年齡≥35 歲、血清HBV-DNA 載量＞1×102copy/ml、孕婦血清HBeAg 陽(yáng)性及胎盤(pán)組織GSK-3β 陽(yáng)性表達(dá)均賦值為1；另將新生兒HBV 感染設(shè)為因變量，未發(fā)生感染賦值為0，發(fā)生感染賦值為1，進(jìn)行多因素分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，采用Logistic多元逐步回歸模型分析胎盤(pán)組織GSK-3β 表達(dá)與新生兒HBV 感染的關(guān)系，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組胎盤(pán)組織GSK-3β 陽(yáng)性表達(dá)及吸光度值比較

研究組胎盤(pán)組織中GSK-3β 陽(yáng)性表達(dá)及GSK-3β 吸光度值與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），研究組高于對(duì)照組。見(jiàn)表1。

2.2 研究組不同HBV-DNA 滴度胎盤(pán)組織GSK-3β 陽(yáng)性表達(dá)及吸光度值比較

HBV-DNA 滴度＞1×102copy/ml 孕婦胎盤(pán)組織中GSK-3β 陽(yáng)性表達(dá)及GSK-3β 吸光度值與HBV-DNA滴度≤1×102copy/ml 孕婦比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），HBV-DNA 滴度＞1×102copy/ml 孕婦高于HBVDNA ≤1×102copy/ml 孕婦。見(jiàn)表2。

2.3 研究組新生兒HBV 感染發(fā)生情況

研究組189 例新生兒中有19 例發(fā)生HBV 感染，新生兒HBV 感染率為10.05%（19/189），余170 例新生兒未發(fā)生HBV 感染。

表1 兩組胎盤(pán)組織GSK-3β 陽(yáng)性表達(dá)及吸光度值比較

2.4 感染組與未感染組母體胎盤(pán)組織GSK-3β陽(yáng)性表達(dá)及吸光度值比較

感染組母體胎盤(pán)組織中GSK-3β 陽(yáng)性表達(dá)及GSK-3β 吸光度值與未感染組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），感染組高于未感染組。見(jiàn)表3。

表2 研究組不同HBV-DNA 滴度胎盤(pán)組織GSK-3β 陽(yáng)性表達(dá)及吸光度值比較

2.5 胎盤(pán)組織GSK-3β 表達(dá)與新生兒HBV 感染的關(guān)系

經(jīng)Logistic 多元逐步回歸模型分析，乙肝孕婦血清HBV-DNA 載 量＞1×102copy/ml、血 清HBeAg 陽(yáng)性及胎盤(pán)組織GSK-3β 陽(yáng)性表達(dá)均為新生兒HBV 感染的危險(xiǎn)因素（=1.956、1.978 和1.931，P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表3 感染組與未感染組母體胎盤(pán)組織GSK-3β 陽(yáng)性表達(dá)及吸光度值比較

表4 新生兒HBV 感染影響因素的Logistic 回歸分析參數(shù)

3 討論

孕齡婦女HBV 感染率同一般人群相當(dāng)，孕婦感染HBV 后可將HBV 傳播給胎兒，嚴(yán)重影響嬰兒健康[7]。宮內(nèi)感染是HBV 母嬰傳播的重要途徑，其主要通過(guò)胎盤(pán)組織感染胎兒。在妊娠早期，母體抵抗力相對(duì)較強(qiáng)，HBV 很少通過(guò)胎盤(pán)組織感染胎兒，而妊娠晚期隨著胎盤(pán)面積的增大，胎盤(pán)的通透性漸漸增強(qiáng)，則胎兒HBV感染概率增加[8]。因此，需積極尋求有效控制HBV 宮內(nèi)感染的方法。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，研究組胎盤(pán)組織中GSK-3β陽(yáng)性表達(dá)及GSK-3β 吸光度值較對(duì)照組高，HBVDNA 滴度＞1×102copy/ml 孕婦胎盤(pán)組織GSK-3β 陽(yáng)性表達(dá)及GSK-3β 吸光度值較HBV-DNA 滴度≤1×102copy/ml孕婦高，提示乙肝患者胎盤(pán)組織中GSK-3β表達(dá)升高，且隨著血清HBV-DNA 滴度的升高，GSK-3β 表達(dá)呈升高趨勢(shì)。GSK-3β 普遍存在于真核生物中，屬絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，具有調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝及細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，其位于經(jīng)典PI3K/Akt 信號(hào)通路的下游[9]。有研究顯示[10]，HBV X 蛋白可促進(jìn)肝細(xì)胞株L02 細(xì)胞中GSK-3β 活性升高。另有研究顯示[11]，HBV 感染胎盤(pán)組織中GSK-3β 陽(yáng)性表達(dá)高于正常胎盤(pán)組織，與本研究結(jié)果相符。另有相關(guān)研究顯示[12-13]，HBsAg 可通過(guò)多種方式激活PI3K/Akt 信號(hào)通路，且GSK-3β 在HBV 感染胎盤(pán)細(xì)胞中高度活化。孕晚期胎盤(pán)的通透性增強(qiáng)，HBV 較易通過(guò)胎盤(pán)，胎盤(pán)組織中HBsAg 呈現(xiàn)陽(yáng)性，因HBsAg 可上調(diào)GSK-3β 活性，且促進(jìn)GSK-3β 表達(dá)，則乙肝孕婦晚期胎盤(pán)組織中GSK-3β 表達(dá)較正常妊娠者升高[14]；另HBV-DNA 滴度越高，HBV 復(fù)制越活躍，則胎盤(pán)組織中HBsAg 活性越強(qiáng)，促使GSK-3β 表達(dá)升高[15]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，研究組189 例新生兒中有19例發(fā)生HBV 感染，新生兒HBV 感染率為10.05%，提示乙肝孕婦發(fā)生新生兒HBV 感染的概率較高，臨床醫(yī)療人員需加大重視，積極給予有效預(yù)防措施。另本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，感染組胎盤(pán)組織中GSK-3β 陽(yáng)性表達(dá)率及GSK-3β 吸光度值較未感染組高，且經(jīng)Logistic 多元逐步回歸模型分析，乙肝孕婦胎盤(pán)血清HBV-DNA 載 量＞1×102copy/ml、血 清HBeAg 陽(yáng) 性及胎盤(pán)組織GSK-3β 陽(yáng)性表達(dá)均是新生兒HBV 感染的危險(xiǎn)因素，提示乙肝孕婦血清HBV-DNA 高載量、HBeAg 陽(yáng)性及胎盤(pán)組織GSK-3β 陽(yáng)性表達(dá)均可增加新生兒HBV 感染發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。母親HBV 感染標(biāo)志物HBeAg 及HBV-DNA 反應(yīng)病毒高度復(fù)制，其與外周血病毒量呈正相關(guān)，因絨毛膜間隙充滿母體血液，則母體血中HBV 病毒可直接接觸胎盤(pán)細(xì)胞，增加宮內(nèi)感染發(fā)生概率。有研究報(bào)道[16]，HBV 感染孕婦胎盤(pán)的合體滋養(yǎng)層細(xì)胞結(jié)節(jié)增多，并具有絨毛水腫、血管充血擴(kuò)張、纖維素樣壞死灶增加等病理改變。另有研究顯示[17]，HBV 感染胎盤(pán)后，胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡可能是阻止HBV 感染宮內(nèi)胎兒的保護(hù)性機(jī)制。GSK-3β 可通過(guò)自分泌旁分泌環(huán)而激活PI3K/Akt 通路，進(jìn)而促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖及抑制凋亡[18]。根據(jù)上述研究分析，HBV 感染孕婦胎盤(pán)組織GSK-3β 高表達(dá)，對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡的抑制作用增強(qiáng)，則滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡減少，為HBV 復(fù)制及增殖提供場(chǎng)所，導(dǎo)致宮內(nèi)感染的發(fā)生，增加新生兒HBV 感染風(fēng)險(xiǎn)[19-20]。

綜上所述，乙肝患者胎盤(pán)組織GSK-3β 表達(dá)升高，且孕婦外周血HBV-DNA 滴度越高，GSK-3β 活性越強(qiáng)，GSK-3β 高表達(dá)可提高HBV 母嬰傳播概率，臨床工作中可將GSK-3β 作為治療HBV 宮內(nèi)感染的潛在靶點(diǎn)，是否可在不影響胎兒發(fā)育的前提下通過(guò)降低GSK-3β 活性而阻斷HBV 垂直傳播具有研究?jī)r(jià)值。