• 
    

    
    

      99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

      放射治療對肺癌患者NKG2D、HMGB1及DC細胞活性的影響*

      2020-02-11 02:58:14白璐張晶晶高東奇劉承一于曉磊李文鑫李青山
      中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志 2020年1期
      關鍵詞:放射治療緩沖液存活率

      白璐,張晶晶,高東奇,劉承一,于曉磊,李文鑫,李青山

      (承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院 腫瘤科,河北 承德 067000)

      放療在直接殺傷腫瘤細胞的同時能夠激活機體免疫系統(tǒng),通過調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境激活免疫細胞釋放免疫細胞因子,從而激活免疫功能,產(chǎn)生旁觀者效應或遠位效應[1-4]。隨著放療對免疫系統(tǒng)影響的研究不斷深入,放療作為佐劑激活免疫系統(tǒng)越來越受到重視[5]。國內(nèi)外大量研究已證實放療可以促進免疫功能,但目前確切機制尚不甚清楚。研究發(fā)現(xiàn),免疫細胞及免疫細胞因子在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演著正反雙重角色,一方面,腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞因子可以招募免疫細胞進入腫瘤病灶清除腫瘤細胞;另一方面,免疫細胞因子能夠促進腫瘤細胞的生長和遠處轉移[6]。

      為全面評價機體的免疫功能,該研究聯(lián)合監(jiān)測包括樹突狀細胞(dendritic cell, DC)在內(nèi)的外周血細胞因子自然殺傷組2 成員(natural killer group 2D, NKG2D)、高遷移率蛋白1(high mobility group box 1, HMGB1),探索放療對肺癌患者免疫功能的影響。

      1 資料與方法

      1.1 一般資料

      選取2017年6月—2018年1月承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤科的肺癌患者進行篩查,納入經(jīng)組織病理學及影像學檢查明確為不可手術的肺癌患者30 例。納入標準:①經(jīng)病理組織學或細胞學證實的肺癌患者,年齡<70 歲;②放療總劑量60 Gy/2 Gy/30 f,預計生存期>3 個月;③為首次胸部放療患者,未行同期放化療及免疫調(diào)節(jié)劑治療;④卡氏體力狀況評分標準>70分,能夠進行外周血單采的患者;⑤心、肝、腎功能正常;⑥白細胞計數(shù)(WBC)4.0×109/L ~10.0×109/L,血小板(PLT)100×109/L ~400×109/L,血紅蛋白(Hb)90 ~120 g/L。排除標準:①未經(jīng)病理學或細胞學證實的患者;②放療過程中途退出的患者;③同步放化療或放療過程中運用免疫調(diào)節(jié)劑治療的患者;④既往有胸部放療史患者。

      1.2 方法

      1.2.1 放療前評估 放療前對患者進行評估:①活檢病理結果;②實驗室檢查包括完善血常規(guī)、肝、腎功能及心電圖檢查;③影像學檢查包括胸部CT、腹部CT。

      1.2.2 放療 所有患者采用仰臥位,雙手抱肘置于額上,采用熱塑料固定體位,CT 模擬定位,層厚5 mm,掃描范圍為下頜至肝下緣,定位CT 影像傳輸至Monaco 計劃系統(tǒng),勾畫大體腫瘤體積、臨床靶區(qū)及計劃靶區(qū)體積。同時勾畫鄰近危及器官,包括心臟、脊髓、食管等。應用醫(yī)科達直線加速器調(diào)強放射治療(IMRT),1 次/d,200 cGy/次,每周放療5 d,放療2、4 及6 周即為放療2 000、4 000 及6 000 cGy 時,所有患者照射總劑量為6 000 cGy。

      1.2.3 收集靜脈血及檢測指標 分別于放療前1 周、放療后2、4 及6 周空腹抽取患者靜脈血5 ml,置入-80℃冰箱保存。主要檢測指標:①NKG2D 及HMGB1 的動態(tài)變化;②DC 細胞存活率。

      1.2.4 檢測方法 ELISA 檢測HMGB1、NKG2D(北京康泰合元生物技術有限公司)。①ELISA 特點:敏感性高、特異性強。實驗的基本原理:采用抗原與抗體的特異反應將待測物與酶連接,然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應,進行定量檢測。②藥盒組份:96 孔板、96 孔板覆膜、標準品、標準品稀釋液、檢測溶液A、檢測溶液A 稀釋液、檢測溶液B、檢測溶液B 稀釋液、TMB 底物、終止液及洗滌液。③樣品采集與處理:采集血清標本,將收集到的全血標本放置室溫2 h,然后1 000 r/min 離心20 min,取上清液,將上清液放置-80℃液氮中冷凍保存,避免反復凍融。④操作步驟:加樣,設標準孔、待測樣品孔、空白孔;設標準孔,依次加入100 μl 不同濃度的標準品,空白孔加100 μl 標準品稀釋液,余孔加待測樣品100 μl;酶標板加上覆膜,37℃溫育1 h;棄去液體,甩干,不用洗滌;每孔加檢測溶液A 工作液100 μl(臨用前配制),酶標板覆膜,37℃溫育1 h;棄去孔內(nèi)液體;每孔用350 μl洗滌液洗滌1 ~2 min,在吸水紙上輕拍酶標板來移除孔內(nèi)所有液體;重復洗板3 次;最后1 次洗滌后,吸取或倒出剩余液體孵育30 min;棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板5 次;每孔加TMB 液底物溶液90 μl,酶標板覆膜,37℃避光顯色(不要超過30 min,當標準孔的前3或4 孔有明顯的梯度藍色,后3 或4 孔梯度不明顯時,即可終止);每孔加終止溶液終止反應,液體顏色由藍色轉為黃色;在確保酶標板底無水滴及孔內(nèi)無氣泡后,立即用酶標儀在450 nm 波長處測量各孔的光密度(OD)值。⑤結果計算:所有OD 值都應減去空白值后再進行計算。以標準品4 000.0、2 000.0、1 000.0、500.0、250.0、125.0、62.5 及0.0 pg/ml 為橫坐標,OD值為縱坐標,在坐標紙上作圖,畫出標準曲線。根據(jù)樣品OD 值在曲線圖上查出相應濃度含量,再乘以稀釋倍數(shù)10 即可。

      1.2.5 免疫磁珠法檢測DC 細胞 ①從血液中純化出外周血單核細胞,磁珠標記非DC 計數(shù),收集1×108個,1 500 r/min 離心10 min,棄上清液,加入300 μl 緩沖液重懸細胞加入100μl FcR Blocking Reagent 和100 μl Non-DC Depletion Cocktail 充分混合,2 ~8 ℃孵育15 min,加入5 ~10 ml 緩沖液洗滌細胞,1 500 r/min離心10 min,棄上清液,加入500 μl 緩沖液重懸細胞;②磁珠分選:去除非DC 細胞,將LD 柱放置在磁力架上,用2 ml 緩沖液潤洗柱子,將細胞懸液加入柱子,收集流出液,用1 ml 緩沖液洗柱子2 次,收集流出液。流出液即為初步分離的DC 組分;③磁珠標記初步分離的DC,1 500 r/min 離心10 min 上步所得的細胞下懸液,棄上清液。用400 μl 緩沖液重懸細胞,加入100 μl DC Enrichment Cocktail。充分混合后2 ~8℃孵育15 min,加入5 ~10 ml 緩沖液洗滌細胞,1 500 r/min 離心10 min 用500 μl 緩沖液重懸細胞;④磁珠分選:篩選DC,將MS 柱放在磁力架上用2 ml 緩沖液潤洗柱子,將細胞懸液加入柱子,收集含有未標記細胞的流出液用500 μl 緩沖液洗3 次,收集含有未標記細胞的流出液,與上一步的流出液合并,將柱子放入合適的收集管中,向柱子中加入500 μl 緩沖液,立刻將活塞推入柱子,收集流出液,流出液中即為磁珠分選的DC。收集分選后的DC,收集后用臺盼藍染色,藍色代表死細胞,透明代表活細胞,用200 倍顯微鏡觀察細胞個數(shù),活細胞數(shù)/總細胞數(shù)之比為DC 細胞存活率。

      1.3 統(tǒng)計學方法

      數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件,計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,多時間點的比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗,采用Pearson 相關性分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

      2 結果

      2.1 放療前后肺癌患者血清中活DC 細胞數(shù)的變化

      放療前1 周肺癌患者血清中活DC 細胞數(shù)為(155.70±62.35)個/μl,放療2、4 和6 周后分別為(185.90±92.93)、(218.17±80.03) 和(126.93±61.00)個/μl,放療前后比較,差異有統(tǒng)計學意義(F=6.833,P=0.002)。

      2.2 放療前后肺癌患者血清中HMGB1、NKG2D含量的變化

      肺癌患者血清HMGB1 和NKG2D 含量放療前后比較,采用單因素方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),于放療2、4 和6 周時逐漸下降。見表1和圖1、2。

      2.3 放療前后肺癌患者血清中DC 細胞存活率的變化

      DC 細胞存活率比較,采用單因素方差分析,差異無統(tǒng)計學意義(F=0.839,P=0.476)。見表2 和圖3。

      2.4 DC 與HMGB1、NKG2D 的相關性

      DC 與HMGB1、NKG2D 無相關性(P>0.05)。見表3。

      表1 HMGB1 和NKG2D 不同時間點的變化 (n=30,±s)

      表1 HMGB1 和NKG2D 不同時間點的變化 (n=30,±s)

      注:?與放療前1 周比較,P <0.05。

      指標 放療前1 周 放療2 周 放療4 周 放療6 周 F 值 P 值HMGB1 91.59±5.86 72.96±4.94? 59.66±3.16? 49.02±4.51? 480.740 0.000 NKG2D 196.57±18.67 168.71±9.68? 130.04±19.17? 78.81±9.54? 348.750 0.000

      圖1 不同時段HMGB1 的含量變化 (n=30,±s)

      圖2 不同時段NKG2D 的含量變化 (n=30,±s)

      表2 DC 細胞存活率的變化 (n=30,±s)

      表2 DC 細胞存活率的變化 (n=30,±s)

      DC 細胞存活率放療前1 周 0.93±0.02放療2 周 0.94±0.02 DC 細胞存活率放療4 周 0.94±0.02放療6 周 0.93±0.03

      圖3 不同時段DC 細胞存活率的變化

      表3 免疫相關因子與DC 的相關性 (n=30,±s)

      表3 免疫相關因子與DC 的相關性 (n=30,±s)

      指標 r 值 P 值HMGB1 -0.204 0.281 NKG2D 0.105 0.580

      3 討論

      HMGB1 是真核細胞核內(nèi)的一種非組蛋白DNA結合蛋白,參與內(nèi)源性信號的傳遞,是細胞壞死的一種危險信號[7-8]。研究顯示,HMGB1 在胰腺癌組織中呈強陽性表達,在癌旁組織微弱表達,而在正常胰腺組織無表達,且該研究還發(fā)現(xiàn)HMGB1 的表達加速腫瘤的生長[9]。WATANABE 等[10]研究表明HMGB1 過表達后可抑制腫瘤細胞凋亡,其可能是一種抗細胞凋亡的癌蛋白。凋亡細胞釋放的HMGB1 并不是發(fā)揮促炎功能,而是能誘導機體的免疫耐受。HMGB1 是構成腫瘤微環(huán)境重要組成部分,微環(huán)境改變導致免疫抑制,促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[11-12]。而該實驗研究顯示,HMGB1 在放療過程呈下降趨勢,說明放射治療促進HMGB1 大量釋放的同時也在大量消耗,與YANG 等[13]研究結果相符,具體消耗機制為:①放療導致腫瘤細胞死亡釋放HMGB1,其與TLR4 結合,促進MHC-1對腫瘤抗原的加工和遞呈。②放療促進HMGB1 釋放,HMGB1 進而促進APC 活化和成熟,最終促進T 細胞活化。③HMGB1 能夠誘導DC 成熟。HMGB1 具有放射治療抵抗作用,促進腫瘤細胞生長,該研究說明常規(guī)放射治療可以降低HMGB1 的放射治療抵抗作用,從而抑制腫瘤生長。

      NKG2D 于1991年首次從NKG2 的cDNA 序列進行分析時分離得到。其主要表達于活化的NK 細胞,在T 細胞、巨噬細胞、DC 也有表達,靶細胞表面NKG2D的配體與淋巴細胞表面NKG2D 的結合可以激活淋巴細胞殺傷表達NKG2D 配體的腫瘤細胞,因此,NKG2D 在腫瘤免疫中發(fā)揮了重要作用。程妮等[14]研究證實,肺癌患者與健康人群比較,患者外周血中CD8+NKT 細胞受體NKG2D 的表達下降,隨著TNM 分期的增加,NKG2D 的表達率逐漸降低。NK 細胞對放射線敏感,大量研究證實放射治療抑制NK 細胞活性[15],該實驗檢測放療前后肺癌患者外周血中NKG2D 表達濃度,通過分析獲得常規(guī)放射治療對NKG2D 的表達為抑制作用,考慮為放療抑制NK 細胞活性,進而抑制其釋放NKG2D,與SEGOVIS 等[16]研究結果相符。

      除免疫因子外,本研究還對免疫細胞進行檢測。DC 為體內(nèi)最強大的專職抗原提呈細胞,在抗腫瘤免疫中處于核心地位[17-18],大多數(shù)腫瘤患者存在DC 數(shù)量減少及功能缺陷的特點,提示DC 與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移及浸潤密切相關,研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)細胞因子可影響DC 的發(fā)生及成熟[19-20],包括IL-10、IL-12 等,本研究意在討論放療對DC 的影響,以及DC 與細胞因子HMGB1、NKG2D 的相關性,實驗結果顯示放射治療前后DC 細胞存活率差異無統(tǒng)計學意義,說明放射治療對DC 細胞存活率無明顯影響。該研究還提示,通過檢測DC 細胞數(shù)和相關免疫細胞因子HMGB1、NKG2D 在放射治療前后不同時間段的表達水平,可能獲得放射治療聯(lián)合免疫治療產(chǎn)生協(xié)同效應的最佳時間區(qū)間的可靠指標。通過對DC 及相關免疫細胞因子HMGB1、NKG2D進行Pearson 相關性分析得出DC 與上述免疫細胞因子無相關,需進一步研究其原理。因免疫微環(huán)境是一個復雜多變的環(huán)境,無數(shù)的免疫細胞和細胞因子進行著復雜的信號交流活動,需要進一步探究其具體信號轉導機制。

      隨著免疫治療研究的不斷深入,傳統(tǒng)治療手段與免疫治療聯(lián)合將會給腫瘤患者帶來希望。目前,放射治療聯(lián)合免疫治療新方案的實施迫切需要明確的研究方向,包括最佳放射治療劑量、放射治療過程中免疫治療加入的時間點、放射治療分割劑量及兩者聯(lián)合治療的機制。對上述問題有更多的明晰,就能更有效地以放射治療作為免疫治療的佐劑,突破腫瘤治療的難題。

      猜你喜歡
      放射治療緩沖液存活率
      廣東放射治療輻射安全現(xiàn)狀
      核安全(2022年3期)2022-06-29 09:17:56
      園林綠化施工中如何提高植樹存活率
      新型醋酸纖維素薄膜電泳緩沖液的研究
      損耗率高達30%,保命就是保收益!這條70萬噸的魚要如何破存活率困局?
      水產(chǎn)小白養(yǎng)蛙2年,10畝塘預計年產(chǎn)3.5萬斤,畝純利15000元!存活率90%,他是怎樣做到的?
      卵磷脂/果膠鋅凝膠球在3種緩沖液中的釋放行為
      中成藥(2018年6期)2018-07-11 03:01:12
      咽及喉部鱗癌放射治療技術研究進展
      胸腺瘤放射治療研究進展
      顱咽管瘤放射治療進展
      Alice臺風對東海鮐魚魚卵仔魚的輸運和存活率的影響
      芮城县| 玉溪市| 南京市| 阜阳市| 策勒县| 凤翔县| 新营市| 盘锦市| 嘉荫县| 荣成市| 潞城市| 南投市| 临城县| 盐亭县| 确山县| 三门峡市| 鲁甸县| 常德市| 金溪县| 竹溪县| 绍兴市| 延庆县| 德令哈市| 宣汉县| 会昌县| 新建县| 崇礼县| 宜良县| 龙海市| 蓝山县| 壶关县| 尉氏县| 沙田区| 子长县| 上饶市| 凉山| 鄱阳县| 武穴市| 叶城县| 黑河市| 宜昌市|