依達(dá)拉奉對(duì)心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用及機(jī)制研究

李開智，楊森林，姜暉，郭亞強(qiáng)，江曉娜，李佳芮

（1.唐山市第二醫(yī)院 藥劑科，河北 唐山 063000；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第982醫(yī)院 心內(nèi)科，河北 唐山 063000；3.唐山市工人醫(yī)院 藥學(xué)部，河北 唐山 063000；4.武安市第一人民醫(yī)院 藥劑科，河北 邯鄲 056300；5.唐山市曹妃甸區(qū)醫(yī)院藥劑科，河北 唐山 063299；6.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第982 醫(yī)院藥械科，河北 唐山 063000）

心肌梗死（myocardial infarction, MI）等缺血性心臟病導(dǎo)致的心力衰竭是一類嚴(yán)重危害人類健康的心臟疾病。根據(jù)我國心血管病報(bào)告，MI 病死率近年來呈快速上升的趨勢(shì)，是目前威脅人類生命的主要疾病之一，給家庭和社會(huì)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，并且已成為重大的公共衛(wèi)生問題[1]。冠狀動(dòng)脈封閉導(dǎo)致的左心室供血不足，引起嚴(yán)重的持續(xù)性心肌細(xì)胞缺氧、缺血，最終導(dǎo)致MI 的發(fā)生。目前研究證實(shí)，心肌細(xì)胞凋亡是早期缺血性心肌細(xì)胞損傷的主要方式，大量心肌細(xì)胞凋亡壞死、心肌實(shí)質(zhì)和間質(zhì)膠原重構(gòu)引起心肌肥厚、擴(kuò)張，使心臟功能嚴(yán)重受損，極大程度影響患者的臨床預(yù)后[2]。MI 發(fā)生后心肌線粒體功能受損、多形核白細(xì)胞活化并聚集、次黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶生成增多、Ca2+超載等多種因素導(dǎo)致活性氧生成過多，心肌處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，是造成心肌細(xì)胞壞死與凋亡的重要環(huán)節(jié)。如何減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而減輕心肌細(xì)胞壞死與凋亡對(duì)于緩解心室病理性重塑、提升心功能、抑制心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展意義重大。磷脂酰肌醇3-激酶/（絲氨酸/蘇氨酸）蛋白激酶（PI3K/Akt）信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)最重要的生存通路，可調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過程，能夠明顯抑制細(xì)胞凋亡[3]，PI3K/Akt 信號(hào)途徑對(duì)缺血缺氧誘發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡可產(chǎn)生心肌保護(hù)作用[4]。依達(dá)拉奉屬于新型自由基清除劑，可有效清除活性氧及有細(xì)胞毒性的羥自由基，在臨床上常用于改善急性腦梗死所致的神經(jīng)癥狀、日?；顒?dòng)能力和功能障礙。依達(dá)拉奉是否通過抗氧化應(yīng)激對(duì)MI 產(chǎn)生保護(hù)作用，這種保護(hù)作用是否與PI3K/Akt 信號(hào)通路有關(guān)鮮有報(bào)道。本研究探討依達(dá)拉奉對(duì)MI 大鼠心肌細(xì)胞壞死與凋亡的抑制作用及作用機(jī)制，以期為MI 新的治療方法提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

選用清潔級(jí)SD 大鼠50 只，雌雄各半，8 周齡，體重（250±20）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK（京）2012-0001。各組大鼠分籠飼養(yǎng)，給予標(biāo)準(zhǔn)大鼠顆粒飼料，自由飲用純凈水。飼養(yǎng)環(huán)境溫度（25±2）℃，相對(duì)濕度（50±10）%，通風(fēng)換氣8～12次/h，12 h晝夜循環(huán)照明。實(shí)驗(yàn)開始前所有大鼠均適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，手術(shù)前12 h禁食、不禁水。實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物的處置符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 主要藥物、試劑及儀器

依達(dá)拉奉（國藥集團(tuán)國瑞藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字 H20080056），TUNEL 試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD），丙二醛（Malondialdehyde, MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px），肌酸激酶同工酶（MB isoenzyme of creatine kinase, CK-MB），乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH），肌鈣蛋白T（cardiac troponin, cTnT）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗、RIPA 裂解液及BCA 蛋白濃度定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)公司），Masson 試劑盒（北京華越洋生物科技公司），Trizol 試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Super Real Pre Mix Plus（SYBR Green）試劑[天根生化科技（北京）有限公司]，PI3K、Akt 及p-Akt、B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2, Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）和β-Actin 一抗（美國Cell Signaling Technology 公司）。PI3K、Akt、Bcl-2、Bax 和β-actin 引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

表1 PRC 引物序列

超高分辨小動(dòng)物彩色多普勒超聲成像系統(tǒng)（美國Visual Sonics 公司），EXL808 全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek 公 司），ABI step one 熒光定量PCR 儀，（美國ABI 公司），Gene Genius 全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)（美國Syngene 公司）；Western blotting 電泳儀（美國Bio- Rad公司），F(xiàn)luor Chem Q蛋白印跡成像和定量分析系統(tǒng)（美國Alpha 公司）。

1.3 動(dòng)物分組及給藥

50 只SD 大鼠隨機(jī)選擇10 只作為假手術(shù)對(duì)照組，其余40 只進(jìn)行MI 模型復(fù)制，模型復(fù)制后隨機(jī)分為4 組，分別為模型對(duì)照組、依達(dá)拉奉小劑量組、中劑量組和大劑量組，每組10 只。術(shù)后2 h 時(shí)依達(dá)拉奉小劑量組、中劑量組和大劑量組大鼠分別腹腔注射依達(dá)拉奉1、3和6 mg/kg，假手術(shù)組和模型對(duì)照組大鼠均腹腔注射等體積生理鹽水。首次給藥1 次/d，連續(xù)14 d。

1.4 MI 模型的復(fù)制

所有大鼠模型復(fù)制前1 天晚上開始禁食，采用冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎法復(fù)制大鼠MI 模型[3]。腹腔注射5%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）進(jìn)行麻醉，背位固定，氣管插管后連接小動(dòng)物呼吸機(jī)進(jìn)行輔助呼吸（潮氣量為1 ml，呼吸比為2 ∶1，60 次/min）。左胸前區(qū)常規(guī)去毛備皮、消毒，在第3 肋間開胸，于肺動(dòng)脈圓錐與左心耳交界下緣約1 ～2 mm 處結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈，止血、清理胸腔，迅速逐層縫合胸壁，關(guān)胸。假手術(shù)對(duì)照組大鼠手術(shù)過程同上，但不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈。術(shù)后將大鼠置于單籠飼養(yǎng)，維持輔助呼吸至自主呼吸恢復(fù)，腹腔注射青霉素10 萬u，連續(xù)3 d，預(yù)防傷口感染。心肌梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)為心電圖示2 個(gè)以上肢體導(dǎo)聯(lián)或胸導(dǎo)聯(lián)ST 段弓背向上抬高[4]。術(shù)后連續(xù)3 d腹腔注射20 萬u 青霉素預(yù)防感染。

1.5 超聲左心室結(jié)構(gòu)和功能檢測(cè)

末次給藥后1 h 時(shí)各組大鼠腹腔注射5%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）進(jìn)行麻醉，背位固定，胸前區(qū)備皮。大鼠生理狀態(tài)穩(wěn)定后采用高分辨小動(dòng)物超聲儀探頭對(duì)大鼠心臟功能進(jìn)行檢測(cè)，指標(biāo)包括左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）和左室短軸率（LVFS），計(jì)數(shù)左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）。每項(xiàng)超聲測(cè)定指標(biāo)取連續(xù)3 個(gè)心動(dòng)周期測(cè)量值的平均值。

1.6 血清心肌酶和抗氧化標(biāo)志物檢測(cè)

心功能檢測(cè)后腹主動(dòng)脈取血10 ml 于普通采血管中，室溫下靜置30 min，待血液完全凝固后低溫3 000 r/min 離心15 min，分離得血清，按照試劑盒說明書檢測(cè)血清心肌酶和抗氧化標(biāo)志物。血清心肌酶包括cTnT、CK-MB、LDH，抗氧化標(biāo)志物包括SOD、MDA、GSH-Px。其中SOD 采用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)，MDA 應(yīng)用硫代巴比妥酸反應(yīng)法檢測(cè)，cTnT、CK-MB、LDH 和GSH-Px 采用雙抗體夾心法檢測(cè)。

1.7 大鼠心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)

腹主動(dòng)脈取血后打開胸腔迅速取出心臟，將血液擠干凈，用磷酸鹽緩沖液沖洗干凈，在左室梗死與非梗死交界區(qū)心肌組織取下，部分組織采用4%多聚甲醛固定，其余組織分為兩部分用液氮保存。所取組織固定24 h，梯度乙醇脫水，包埋，常規(guī)石蠟切片（厚4 μm），TUNEL 染色，清洗后封片。高倍顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞凋亡情況，細(xì)胞呈棕褐色或棕黃色顆粒且具備凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征判定為凋亡細(xì)胞，計(jì)算凋亡指數(shù)（apototic index, AI）=（熒光細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.8 大鼠心肌PI3K、Akt、mTOR 和Bcl-2 mRNA和蛋白檢測(cè)

取左室梗死與非梗死交界區(qū)心肌組織適量，液氮下研磨，加入Trizol 裂解液提取RNA，酶標(biāo)儀測(cè)定總RNA 濃度及純度。將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行定量PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50 μl：10×PCR Buffer 5 μl，10 μmol/L dNTP 1 μ1，模板1 μl，正反向引物各1 μl，0.5 μl 2 u/μ1 Taq DNA 聚合酶（含Mg2+），加入ddH2O 至50 μl。PCR 反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性10 min，94℃變性15 s， 58℃退火45 s，72℃延伸60 s，共35 個(gè)循環(huán)，72℃再延伸5 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，Quantity One 軟件分析目標(biāo)基因PI3K、Akt、Bcl-2和Bax與內(nèi)參基因β-actin吸光度，以目標(biāo)蛋白吸光度與β-actin 吸光度的比值作用目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

取左室梗死與非梗死交界區(qū)心肌組織適量，切成米粒大小，加入RIPA 裂解液和蛋白酶抑制劑，用快速組織細(xì)胞破碎儀粉碎組織，低溫12 000 r/min 離心10 min，分離得總蛋白，用BCA 法進(jìn)行蛋白定量。用10%SDS-PAGE 凝膠分離蛋白，轉(zhuǎn)膜。用5%脫脂奶粉（磷酸化抗體用4% BSA）封閉2 h，分別加入PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、Bcl-2 和β-actin 一抗，4℃下孵育過夜。PBST 溶液洗膜3 次，加入IgG-HRP，室溫避光孵育1 h，PBST 溶液洗膜3 次。加ECL 發(fā)光液曝光、顯影、定影。用掃描儀掃描曝光膠片，用Image J軟件分析條帶灰度值。以β-actin 為內(nèi)參照，計(jì)算目標(biāo)蛋白PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR 和Bcl-2 的相對(duì)表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 依達(dá)拉奉對(duì)MI 大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響

如表2 所示，各組大鼠術(shù)后14 d 的LVEDD、LVESD、LVFS 和LVEF 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型對(duì)照組大鼠LVEDD 和LVESD 較假手術(shù)對(duì)照組大鼠升高（P＜0.05），LVFS 和LVEF 較假手術(shù)對(duì)照組大鼠降低（P＜0.05）；依達(dá)拉奉小劑量組LVEDD、LVESD、LVFS 和LVEF 與模型對(duì)照組大鼠比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；依達(dá)拉奉中劑量組大鼠LVEDD 和LVESD 較 小 劑 量 組 大 鼠 降 低（P＜0.05），LVFS 和LVEF 較小劑量組大鼠升高（P＜0.05）；依達(dá)拉奉大劑量組大鼠LVEDD 和LVESD 較中劑量組大鼠降低（P＜0.05），LVFS 和LVEF 較中劑量組大鼠升高（P＜0.05）。

表2 術(shù)后14 d 各組大鼠左心室結(jié)構(gòu)和功能的比較 （n =10，±s）

表2 術(shù)后14 d 各組大鼠左心室結(jié)構(gòu)和功能的比較 （n =10，±s）

注：①與假手術(shù)對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與模型對(duì)照組比較，P ＜0.05；③與依達(dá)拉奉小劑量組比較，P ＜0.05；④與依達(dá)拉奉中劑量組比較，P ＜0.05。

組別 LVEDD/mm LVESD/mm LVFS/% LVEF/%假手術(shù)對(duì)照組 5.5±0.9 2.5±0.3 53.5±5.9 86.4±6.6模型對(duì)照組 8.5±0.7① 6.2±0.5① 21.9±3.5① 35.7±4.7①依達(dá)拉奉小劑量組 8.0±0.7 5.7±0.5 24.3±4.3 39.2±5.2依達(dá)拉奉中劑量組 7.1±0.6②③ 5.2±0.4②③ 29.9±4.5②③ 47.4±5.7②③依達(dá)拉奉大劑量組 6.3±0.6②③④ 4.3±0.5②③④ 35.0±5.3②③④ 63.5±6.4②③④F 值 29.721 97.110 69.445 130.653 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 依達(dá)拉奉對(duì)MI 大鼠血清CK-MB、LDH 和cTnT 水平的影響

各組大鼠術(shù)后14 d 血清CK-MB、LDH 和cTnT水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型對(duì)照組大鼠血清CK-MB、LDH 和cTnT 水平較假手術(shù)對(duì)照組大鼠升高（P＜0.05）；依達(dá)拉奉小劑量組大鼠血清CK-MB、LDH 和cTnT 水平較模型對(duì)照組大鼠降低（P＜0.05）；依達(dá)拉奉中劑量組大鼠血清CK-MB、LDH 和cTnT 水平較小劑量組大鼠降低（P＜0.05）；依達(dá)拉奉大劑量組大鼠血清CK-MB、LDH 和cTnT 水平較中劑量組大鼠降低（P＜0.05）。見表3。

表3 術(shù)后14 d 各組大鼠血清心肌酶水平的比較 （n =10，±s）

表3 術(shù)后14 d 各組大鼠血清心肌酶水平的比較 （n =10，±s）

注：①與假手術(shù)對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與模型對(duì)照組比較，P ＜0.05；③與依達(dá)拉奉小劑量組比較，P ＜0.05；④與依達(dá)拉奉中劑量組比較，P ＜0.05。

組別 CK-MB/（u/L） LDH/（IU/L） cTnT/（pg/L）假手術(shù)對(duì)照組 715.6±45.4 932.7±112.5 675.5±117.1模型對(duì)照組 1 284.4±97.5① 2 421.4±215.7① 2 182.3±186.5①依達(dá)拉奉小劑量組 1 164.3±101.3② 2 115.4±226.4② 1 984.7±193.2②依達(dá)拉奉中劑量組 1 057.7±93.6②③ 1 845.3±184.7②③ 1 735.1±184.5②③依達(dá)拉奉大劑量組 914.3±89.6②③④ 1 594.4±159.5②③④ 1 473.6±165.4②③④F 值 63.351 94.158 116.788 P 值 0.000 0.000 0.000

2.3 依達(dá)拉奉對(duì)MI 大鼠血清抗氧化標(biāo)志物的影響

各組大鼠術(shù)后14 d 血清SOD、MDA 和GSH-Px水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型對(duì)照組大鼠血清SOD 和GSH-Px 水平較假手術(shù)對(duì)照組大鼠降低（P＜0.05），MDA 水平較假手術(shù)對(duì)照組大鼠升高（P＜0.05）；依達(dá)拉奉小劑量組大鼠血清SOD 和GSH-Px水平較模型對(duì)照組大鼠升高（P＜0.05），MDA 水平較模型對(duì)照組大鼠降低（P＜0.05）；依達(dá)拉奉中劑量組大鼠血清SOD 和GSH-Px 水平較小劑量組大鼠升高（P＜0.05），MDA 水平較小劑量組大鼠降低（P＜0.05）；依達(dá)拉奉大劑量組大鼠血清SOD 和GSH-Px 水平較中劑量組大鼠升高（P＜0.05），MDA 水平較中劑量組大鼠降低（P＜0.05）。見表4。

2.4 依達(dá)拉奉對(duì)MI 大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

各組大鼠術(shù)后14 d 心肌AI 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=83.794，P=0.000）；模型對(duì)照組大鼠心肌AI（39.47±4.29）%較假手術(shù)對(duì)照組大鼠（8.16±0.75）%升高（P＜0.05）；依達(dá)拉奉小劑量組大鼠心肌AI（34.29±4.84）%較模型對(duì)照組大鼠降低（P＜0.05）；依達(dá)拉奉中劑量組大鼠心肌AI（28.62±5.17）%較小劑量組大鼠降低（P＜0.05）；依達(dá)拉奉大劑量組大鼠心肌AI（21.36±4.45）%較中劑量組大鼠降低（P＜0.05）。見圖1、2。

2.5 依達(dá)拉奉對(duì)MI 大鼠心肌PI3K、Akt、Bcl-2和Bax mRNA 表達(dá)的影響

各組大鼠術(shù)后14d 心肌PI3K、Akt、Bcl-2 和Bax mRNA 表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型對(duì)照組大鼠心肌PI3K、Akt 和Bcl-2 mRNA 表達(dá)較假手術(shù)組大鼠降低（P＜0.05），Bax mRNA 表達(dá)較假手術(shù)對(duì)照組大鼠升高（P＜0.05）；依達(dá)拉奉中劑量組大鼠心肌PI3K、Akt 和Bcl-2 mRNA 表達(dá)較小劑量組大鼠升高（P＜0.05），Bax mRNA 表達(dá)較小劑量組大鼠降低（P＜0.05）；依達(dá)拉奉大劑量組大鼠心肌PI3K、Akt 和Bcl-2 mRNA 表達(dá)較中劑量組大鼠升高（P＜0.05），Bax mRNA 表達(dá)較中劑量組大鼠降低（P＜0.05）。見表5。

表4 術(shù)后14 d 各組大鼠血清抗氧化標(biāo)志物水平的比較（n =10，±s）

表4 術(shù)后14 d 各組大鼠血清抗氧化標(biāo)志物水平的比較（n =10，±s）

注：①與假手術(shù)對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與模型對(duì)照組比較，P ＜0.05；③與依達(dá)拉奉小劑量組比較，P ＜0.05；④與依達(dá)拉奉中劑量組比較，P ＜0.05。

組別 SOD/（u/ml）MDA/（nmol/ml）GSH-Px/（u/ml）假手術(shù)對(duì)照組 367.3±27.3 3.3±0.5 786.4±42.5模型對(duì)照組 147.9±23.8① 17.6±2.2① 421.4±35.3①依達(dá)拉奉小劑量組 189.3±24.4② 15.3±1.8② 469.4±37.9②依達(dá)拉奉中劑量組 215.4±26.5②③ 11.8±1.7②③ 516.7±41.9②③依達(dá)拉奉大劑量組 248.3±28.9②③④ 9.5±1.5②③④ 574.3±43.8②③④F 值 100.630 114.124 123.353 P 值 0.000 0.000 0.000

圖1 依達(dá)拉奉對(duì)MI 大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響（n =10，±s）

2.6 依達(dá)拉奉對(duì)MI 大鼠心肌PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)的影響

如表6 所示，各組大鼠術(shù)后14d 心肌PI3K、Akt、Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型對(duì)照組大鼠心肌PI3K、Akt、p-Akt 和Bcl-2 蛋白表達(dá)較假手術(shù)對(duì)照組大鼠降低（P＜0.05），Bax 蛋白表達(dá)較假手術(shù)對(duì)照組大鼠升高（P＜0.05）；依達(dá)拉奉中劑量組大鼠心肌PI3K、Akt、p-Akt 和Bcl-2蛋白表達(dá)較小劑量組大鼠升高（P＜0.05），Bax 蛋白表達(dá)較小劑量組大鼠降低（P＜0.05）；依達(dá)拉奉大劑量組大鼠心肌PI3K、Akt、p-Akt 和Bcl-2 蛋白表達(dá)較中劑量組大鼠升高（P＜0.05），Bax 蛋白表達(dá)較中劑量組大鼠降低（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況 （×200）

表5 術(shù)后14 d 各組大鼠心肌PI3K、Akt、Bcl-2 和Bax mRNA 表達(dá)的比較 （n =10，±s）

表5 術(shù)后14 d 各組大鼠心肌PI3K、Akt、Bcl-2 和Bax mRNA 表達(dá)的比較 （n =10，±s）

注：①與假手術(shù)對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與模型對(duì)照組比較，P ＜0.05；③與依達(dá)拉奉小劑量組比較，P ＜0.05；④與依達(dá)拉奉中劑量組比較，P ＜0.05。

組別 PI3K Akt Bcl-2 Bax假手術(shù)對(duì)照組 6.7±0.5 3.7±0.4 1.6±0.2 0.8±0.1模型對(duì)照組 3.5±0.4① 1.6±0.2① 0.8±0.2① 2.5±0.2①依達(dá)拉奉小劑量組 3.7±0.4 1.6±0.3 0.9±0.1 2.4±0.2依達(dá)拉奉中劑量組 4.3±0.5②③ 1.9±0.2②③ 1.2±0.1②③ 2.2±0.1②③依達(dá)拉奉大劑量組 5.1±0.6②③④ 2.7±0.3②③④ 1.4±0.2②③④ 1.8±0.2②③④F 值 71.525 86.702 32.941 170.714 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

表6 術(shù)后14 d 各組大鼠心肌PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)的比較 （n=10，±s）

表6 術(shù)后14 d 各組大鼠心肌PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)的比較 （n=10，±s）

注：①與假手術(shù)對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與模型對(duì)照組比較，P ＜0.05；③與依達(dá)拉奉小劑量組比較，P ＜0.05；④與依達(dá)拉奉中劑量組比較，P ＜0.05。

組別 PI3K Akt p-Akt Bcl-2 Bax假手術(shù)對(duì)照組 3.5±0.2 1.5±0.1 0.9±0.1 0.9±0.1 0.4±0.1模型對(duì)照組 1.8±0.2① 0.9±0.1① 0.6±0.1① 0.4±0.1① 1.1±0.1①依達(dá)拉奉小劑量組 1.8±0.2 0.9±0.1 0.6±0.1 0.4±0.1 1.1±0.1依達(dá)拉奉中劑量組 2.1±0.2②③ 1.0±0.1②③ 0.7±0.1②③ 0.5±0.1②③ 0.9±0.1②③依達(dá)拉奉大劑量組 2.6±0.2②③④ 1.3±0.2②③④ 0.8±0.1②③④ 0.6±0.1②③④ 0.8±0.1②③④F 值 128.25 45.000 10.625 43.000 83.000 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

3 討論

MI 是指心臟在缺血、缺氧后引起的心肌細(xì)胞的壞死，是導(dǎo)致心血管疾病患者死亡最主要的原因之一[5]。隨著人們生活方式的改變及人口老齡化，MI 發(fā)病率和致死率的逐年攀升[6]，已嚴(yán)重威脅全球人民的身體健康。MI 引起氧化應(yīng)激損傷、心肌細(xì)胞凋亡、心肌組織嚴(yán)重受損及心室重構(gòu)，最終發(fā)展為心力衰竭[7]。因此，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而減輕心肌細(xì)胞壞死與凋亡是防治心肌梗死后心室重構(gòu)的重要途徑。依達(dá)拉奉通過抑制脂質(zhì)的過氧化，可避免血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[8-9]。本研究探討MI 大鼠心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用并探討其作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本研究結(jié)果顯示，依達(dá)拉奉可劑量依賴性降低MI 大鼠LVESD 和LVEDD、升高LVEF 和LVFS，降低血清cTnT、CK-MB 和LDH 水平，因此依達(dá)拉奉可對(duì)MI 具有保護(hù)作用，并且對(duì)心臟功能具有的改善作用。

細(xì)胞凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡，是由細(xì)胞內(nèi)外因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而引起細(xì)胞死亡的一種方式，表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、細(xì)胞膜完整并發(fā)泡、染色質(zhì)固縮、凋亡小體形成。MI 后由于缺血、缺氧，心肌細(xì)胞啟動(dòng)細(xì)胞凋亡相關(guān)機(jī)制，形成凋亡復(fù)合體，通過多種蛋白酶的活化誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在MI 向心力衰竭的轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，依達(dá)拉奉可劑量依賴性降低MI 大鼠心肌細(xì)胞的AI，說明依達(dá)拉奉可降低MI 大鼠心肌細(xì)胞的凋亡。

氧化應(yīng)激是指機(jī)體受到各種有害刺激后機(jī)體內(nèi)氧化活性物質(zhì)產(chǎn)生過多和/或抗氧化能力減弱，氧自由基的清除不足，破壞機(jī)體氧化/還原的正常平衡，進(jìn)而造成細(xì)胞、組織氧化損傷的病理過程。機(jī)體內(nèi)SOD、GSH-Px 和MDA 水平可反映出機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)[10]。MI 后氧自由基生成增多，體內(nèi)的重要抗氧化酶SOD、GSH-Px 活性下降，破壞心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)、損傷心肌細(xì)胞膜，導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死[11。本研究結(jié)果顯示，依達(dá)拉奉可劑量依賴性升高SOD、GSH-Px 水平，而降低MDA 水平，從而改善MI 大鼠心肌的抗氧化能力。

PI3K/Akt 信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)最重要的生存通路，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過程，抑制細(xì)胞凋亡[12]。PI3K 可直接激活A(yù)kt 發(fā)生磷酸化，p-Akt 能夠進(jìn)一步通過抑制促凋亡蛋白的形成[13]，從而對(duì)缺血缺氧誘發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡可產(chǎn)生心肌保護(hù)作用[14]。此外PI3K/Akt 信號(hào)可通過調(diào)控下游的Bcl-2、Bax 等多種靶蛋白而調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)過程[15]。Bcl-2 和Bax 分別是Bcl-2 家族的抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白，互相作用而調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞凋亡情況。Bax 發(fā)生活化后可誘導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素C 從而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，而Bcl-2 和Bax可結(jié)合形成二聚體而抑制細(xì)胞凋亡[16]。已有多項(xiàng)研究證實(shí)可通過上調(diào)Bcl-2 和下調(diào)Bax 以降低心肌細(xì)胞的凋亡[17]。本研究結(jié)果顯示，依達(dá)拉奉可劑量依賴性升高PI3K、Akt 和Bcl-2 mRNA 的表達(dá)，降低Bax mRNA 的表達(dá)；依達(dá)拉奉可劑量依賴性升高PI3K、Akt、p-Akt 和Bcl-2 蛋白的表達(dá)，降低Bax 蛋白的表達(dá)，說明依達(dá)拉奉可調(diào)控PI3K/Akt 信號(hào)通路，這也可能是其抑制MI 大鼠心肌細(xì)胞凋亡的原因。

綜上所述，依達(dá)拉奉對(duì)MI 大鼠具有保護(hù)作用，可改善MI 大鼠的心臟結(jié)構(gòu)和心臟功能，降低心肌細(xì)胞的凋亡，改善心肌抗氧化能力，并且與調(diào)控PI3K/Akt 信號(hào)通路有關(guān)。