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    靶向IRF2的miR-1290對非小細胞肺癌細胞增殖、侵襲的調控作用及其機制研究

    2020-02-11 07:30:06張仲妍
    中國癌癥雜志 2020年1期
    關鍵詞:明顯增加熒光素酶質粒

    董 磊,張仲妍

    1.武漢市紅十字會醫(yī)院腫瘤科,湖北 武漢 430000;

    2.重慶大學附屬腫瘤醫(yī)院中醫(yī)腫瘤科,重慶 400030

    非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是最常見的肺癌類型,約占所有肺癌的80%,惡性程度高,易發(fā)生轉移和擴散,5年生存率很低[1]。目前,NSCLC患者主要采用手術聯(lián)合放化療,以期延長患者的生存時間,提高生活質量[2]。研究NSCLC細胞發(fā)生增殖和轉移的機制,對于臨床治療具有重要意義。miRNA是一組具有調控作用的非編碼小RNA,可以調控細胞的多種生物學過程[3]。miR-1290是近年來發(fā)現(xiàn)的一種與腫瘤有關的miRNA,在多種惡性腫瘤中均存在異常高表達[4-5]。臨床研究顯示,miR-1290可以調節(jié)干擾素調節(jié)因子-2(interferon regulatory factor-2,IRF2)的表達,調節(jié)NSCLC細胞的惡性生物學行為[6],但其作用具體機制目前尚不清楚。因此,本研究分析miR-1290靶向IRF2調節(jié)NSCLC細胞生物學行為的作用機制,旨在為NSCLC的分子靶向治療提供一定的參考依據。

    1 材料和方法

    1.1 材料與儀器

    全自動酶標儀購自美國Thermo Scientific公司;7500實時熒光定量聚合酶鏈反應(realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)系統(tǒng)購自美國Applied Biosystems公司;A549細胞均購自上海酶研生物科技有限公司;空質粒pGL3購自上海信裕生物科技有限公司;包含IRF23’-UTR序列的熒光素酶報告基因質粒(3’-UTR IRF2-WT)和含有IRF23’-UTR突變序列的熒光素酶報告基因質粒(3’-UTR IRF2-MUT)均由賽默飛世爾科技(中國)有限公司構建并鑒定;PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成;熒光素酶檢測試劑盒購自南京賽泓瑞生物科技有限公司;RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;LipofectamineTM2000轉染試劑購自上海恒斐生物科技有限公司;細胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)購自武漢艾美捷科技有限公司;Transwell小室購自上海研卉生物科技有限公司;RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑均購自北京索萊寶科技有限公司;β-actin、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、E-鈣黏著蛋白(E-cadherin)、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2和Ki-67抗體均購自美國Santa Cruz公司。

    1.2 細胞培養(yǎng)與轉染

    將A549細胞接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將其分為NC組、miR-1290 mimic組和miR-1290 inhibitor組。轉染前24 h接種細胞,將空白質粒轉染到NC組細胞,miR-1290 mimic轉染到miR-1290組細胞,miR-1290 inhibitor轉染到miR-1290 inhibitor組細胞,按照轉染試劑操作步驟進行轉染。采用RTFQ-PCR和蛋白質印跡法(Western blot)檢測各組細胞miR-1290和IRF2的表達。

    1.3 miR-1290和IRF2的靶向關系驗證

    采用熒光素酶活性實驗進一步驗證miR-1290和IRF2的靶向關系,根據miRNA靶點預測軟件預測,選擇可以與miR-1290的結合的IRF2 mRNA的3’-UTR序列,體外合成含該位點的DNA片段(WT)和含該位點突變體(MUT)的DNA片段,克隆到雙熒光素酶啟動子載體pGL3。將該質粒轉染到miR-1290組和NC組細胞,培養(yǎng)48 h后,采用熒光素酶檢測試劑盒測定熒光素酶活性。

    1.4 細胞培養(yǎng)與轉染

    取對數(shù)生長期A549細胞,將其分為NC組、miR-1290組、IRF2組和miR-1290+IRF2組。轉染前24 h接種細胞,將空白質粒轉染到NC組細胞,miR-1290 mimic轉染到miR-1290組和miR-1290+IRF2組細胞;將IRF2構建到pLV-DNA載體過表達后轉染到IRF2組和miR-1290+IRF2組細胞,按照轉染試劑操作步驟進行轉染。

    1.5 轉染后miR-1290和IRF2的表達水平

    采用RTFQ-PCR測定各組細胞中miR-1290和IRF2的表達水平,TRIzol法提取細胞總RNA,經反轉錄合成cDNA,進行RTFQ-PCR,miR-1290上游引物:5’-GGCTCTGAGTGGTTGAGC-3’,下游:5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’;IRF2上游引物:5’-TGAACTGCATACTACGCTCAAG A-3’,下游引物:5’-CGGATTCGTCACAATG TGTTC-3’。反應引物、體系和條件參照參考文獻[7],以GAPDH作為內參。采用Western blot檢測IRF2的表達,使用細胞裂解液提取總蛋白,將提取的總蛋白樣品經過聚丙烯酰胺凝膠電泳轉印至聚偏二氟乙烯膜,加兔抗人IRF2多克隆抗體(1∶1000)和β-actin蛋白單抗(1∶300),4 ℃下溫育過夜,最后加二抗37 ℃下溫育2 h,電化學發(fā)光法顯色。采用凝膠成像分析軟件分析蛋白條帶灰度值。

    1.6 CCK-8檢測各組細胞的增殖活性

    取各組對數(shù)生長期的A549細胞,將單個細胞懸液接種于96孔板中,每孔體積200 μL,含103個細胞,于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),分別于0、24、48、72、96 h進行CCK-8檢測,加入10 μL CCK-8試劑,采用酶標儀檢測波長為450 nm處各孔的吸光度(D)值。

    1.7 Transwell實驗檢測各組細胞的侵襲力

    取100μL稀釋好的基質膠均勻覆蓋于Transwell小室底部。取各組對數(shù)生長期的A549細胞,用0.2%的胰蛋白酶進行消化后,調整細胞密度為2×105個/mL。取100 μL稀釋好的細胞懸液加于上室,于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的條件下培養(yǎng)48 h后,取出Transwell小室,采用甲醇固定,結晶紫進行染色,顯微鏡下觀察膜下室面表面的細胞,并計數(shù)5個視野,取平均值。

    1.8 劃痕實驗檢測各組細胞的遷移力

    取各組對數(shù)生長期的A549細胞接種于96孔板中,于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的條件下培養(yǎng),待細胞長滿單層后,棄去培養(yǎng)基,采用滅菌的移液器吸嘴在皿底垂直劃一直線,采用PBS洗滌3次,于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的條件下常規(guī)培養(yǎng)。顯微鏡下觀察劃痕處細胞的生長情況,測量劃痕寬度,計算細胞遷移率。

    1.9 Western blot檢測VEGF、E-cadherin、MMP-2蛋白水平及Ki-67增殖指數(shù)

    取各組對數(shù)生長期的A549細胞,采用細胞裂解液提取總蛋白,二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法進行蛋白定量,取50 ng蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,電轉膜至聚偏二氟乙烯膜,室溫封閉2 h,采用洗膜緩沖液(TRISbuffered saline Tween,TBST)洗膜并加一抗,4 ℃溫育過夜,TBST洗膜加二抗,室溫下溫育2 h。再用電化學發(fā)光顯示,選用β-actin作為內參,采用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析對比條帶強弱。

    1.10 統(tǒng)計學處理

    采用SPSS 17.0軟件對所得數(shù)據進行分析,計量資料均以表示,對計量資料首先進行正態(tài)性檢驗,各組均滿足正態(tài)性且兩組間方差齊,采用單因素方差分析比較兩組間差異性,若組間比較有差異,采用SNK-q檢驗比較兩組間差異,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 miR-1290與IRF2的靶向關系

    將miR-1290 mimic和miR-1290 inhibitor分別轉染到miR-1290細胞后,采用RTFQ-PCR和Western blot檢測各組細胞miR-1290和IRF2的表達,結果顯示:與NC組相比,miR-1290 mimic組的miR-1290 mRNA水平明顯增加[(8.13±0.05)vs(1.00±0.00),P<0.05],IRF2蛋白和mRNA水平明顯下降[(0.17±0.02)vs(0.28±0.02);(0.32±0.02)vs(1.00±0.00),P<0.05],miR-1290 inhibitor組的miR-1290 mRNA水平明顯下降[(0.17±0.02)vs(1.00±0.00),P<0.05],IRF2蛋白和mRNA水平明顯增加[(0.65±0.05)vs(0.28±0.02);(2.87±0.08)vs(1.00±0.00),P<0.05,圖1,表1]。

    圖1 miR-1290與IRF2的靶向關系Fig.1 Targeted relationship between miR-1290 and IRF2

    表1 miR-1290與IRF2的靶向關系Tab.1 Targeted relationship between miR-1290 and IRF2

    2.2 熒光素酶活性實驗驗證miR-1290與IRF2的靶向關系

    體外合成含miR-1290結合IRF2 mRNA 3’-UTR序列位點的DNA片段(WT)和含該位點突變體(MUT)的DNA片段,克隆到雙熒光素酶啟動子載體pGL3,分別轉染到miR-1290組和NC組細胞,采用熒光素酶檢測試劑盒測定熒光素酶活性,結果顯示,與轉染野生型熒光素酶質粒組相比,共轉染野生型熒光素酶質粒和miR-1290 mimic組細胞的熒光素酶活性顯著降低[(0.38±0.04)vs(1.00±0.04),P<0.05],miR-1290可以靶向負調控IRF2(圖2)。

    圖2 熒光素酶實驗檢測各組細胞的熒光素酶活性Fig.2 Luciferase activity of cells in each group was detected by luciferase experiment

    2.3 RTFQ-PCR和Western blot檢測各組A549細胞轉染后miR-1290和IRF2的表達水平

    將空白質粒轉染到NC組細胞,miR-1290 mimic轉染到miR-1290組和miR-1290+IRF2組細胞;將IRF2構建到pLV-DNA載體過表達后轉染到IRF2組和miR-1290+IRF2組細胞后,采用RTFQPCR和Western blot檢測各組細胞miR-1290和IRF2的表達,結果顯示:與NC組相比,miR-1290組miR-1290 mRNA水平明顯增加[(8.11±0.06)vs(1.00±0.00),P<0.05],IRF2蛋白和mRNA水平明顯下降[(0.15±0.02)vs(0.27±0.02);(0.33±0.03)vs(1.00±0.00),P<0.05],IRF2組IRF2蛋白和mRNA水平明顯增加[(1.23±0.05)vs(0.27±0.02);(7.65±0.05)vs(1.00±0.00),P<0.05];與IRF2組相比,miR-1290+IRF2組miR-1290 mRNA水平明顯增加[(8.09±0.06)vs(1.02±0.03),P<0.05],IRF2蛋白和mRNA水平明顯下降[(0.24±0.05)vs(1.23±0.05);(0.93±0.06)vs(7.65±0.05),P<0.05,圖3,表2]。

    圖3 轉染后A549細胞IRF2蛋白的表達Fig.3 Expression of IRF2 protein in transfected A549 cells

    表2 各組A549細胞的轉染后miR-1290和IRF2的水平Tab.2 miR-1290 and IRF2 levels of A549 cells in each group after transfection

    2.4 CCK-8檢測各組A549細胞的增殖情況

    采用CCK-8檢測各組對數(shù)生長期A549細胞的增殖情況,結果顯示,與NC組相比,miR-1290組細胞在培養(yǎng)24、48、72和96 h時數(shù)量明顯增加(P<0.05),IRF2組細胞在培養(yǎng)24、48、72和96 h時數(shù)量明顯下降(P<0.05),miR-1290+IRF2組細胞在培養(yǎng)24、48、72和96 h時數(shù)量均無明顯變化(P>0.05);與IRF2組相比,miR-1290+IRF2組細胞在培養(yǎng)24、48、72和96 h時數(shù)量明顯增加(P<0.05);與miR-1290組相比,miR-1290+IRF2組細胞在培養(yǎng)24、48、72和96 h時數(shù)量差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05,表3)。

    表3 各組A549細胞的增殖情況Tab.3 Proliferation of A549 cells in each group

    2.5 Transwell和劃痕實驗檢測各組A549細胞的侵襲和遷移能力

    采用Transwell實驗檢測各組對數(shù)生長期A549細胞的侵襲力,劃痕實驗檢測各組對數(shù)生長期A549細胞的遷移力,結果顯示,與NC組相比,miR-1290組細胞侵襲細胞數(shù)和細胞遷移率明顯增加[(183.45±22.37)vs(127.26±17.95);(65.43±8.61)vs(44.37±6.58),P<0.05],IRF2組細胞侵襲細胞數(shù)和細胞遷移率明顯下降[(73.35±11.36)vs(127.26±17.95);(28.25±5.24)vs(44.37±6.58),P<0.05],miR-1290+IRF2組細胞侵襲細胞數(shù)和細胞遷移率無明顯差異(P>0.05);與IRF2組相比,miR-1290+IRF2組細胞侵襲細胞數(shù)和細胞遷移率明顯增加[(131.48±18.51)vs(73.35±11.36);(47.40±7.23)vs(28.25±5.24),P<0.05];與miR-1290組相比,miR-1290+IRF2組細胞侵襲細胞數(shù)和細胞遷移率明顯下降[(131.48±18.51)vs(183.45±22.37);(47.40±7.23)vs(65.43±8.61),P<0.05,圖4,表4]。

    圖4 各組A549細胞的侵襲和遷移力Fig.4 Invasion and migration of A549 cells in each group

    表4 各組A549細胞的侵襲和遷移力Tab.4 Invasion and migration of A549 cells in each group

    2.6 Western blot檢測各組A549細胞VEGF、E-cadherin、MMP-2蛋白水平及Ki-67增殖指數(shù)

    采用Wester n blot檢測各組對數(shù)生長期A549細胞V EGF、E-cad her in、MMP-2蛋白水平及Ki-67增殖指數(shù),結果顯示,與NC組相比,miR-1290組細胞VEGF、MMP-2和Ki-67明顯增加[(0.75±0.07)vs(0.47±0.04);(0.67±0.06)vs(0.38±0.03);(0.72±0.06)vs(0.40±0.04),P<0.05],E-cadherin水平明顯下降[(0.21±0.03)vs(0.32±0.03),P<0.05],IRF2組細胞VEGF、MMP-2和Ki-67明顯下降[(0.26±0.03)vs(0.47±0.04);(0.23±0.03)vs(0.38±0.03);(0.25±0.03)vs(0.40±0.04),P<0.05],E-cadherin水平明顯增加[(0.61±0.05)vs(0.32±0.03),P<0.05],miR-1290+IRF2組細胞VEGF、MMP-2、Ki-67和E-cadherin無明顯差異(P>0.05)。與IRF2組相比,miR-1290+IRF2組細胞VEGF、MMP-2和Ki-67明顯增加[(0.51±0.05)vs(0.26±0.03);(0.41±0.04)vs(0.23±0.03);(0.44±0.04)vs(0.25±0.03),P<0.05],E-cadherin水平明顯下降[(0.30±0.03)vs(0.61±0.05),P<0.05];與miR-1290組相比,miR-1290+IRF2組細胞VEGF、MMP-2和Ki-67明顯下降[(0.51±0.05)vs(0.75±0.07);(0.41±0.04)vs(0.67±0.06);(0.44±0.04)vs(0.72±0.06),P<0.05],E-cadherin水平明顯增加[(0.30±0.03)vs(0.21±0.03),P<0.05,圖5,表5]。

    圖5 各組A549細胞VEGF、E-cadherin、MMP-2、Ki-67的水平Fig.5 Levels of VEGF,E-cadherin,MMP-2 and Ki-67 of A549 cells in each group

    表5 各組A549細胞VEGF、E-cadherin、MMP-2、Ki-67的水平Tab.5 Levels of VEGF,E-cadherin,MMP-2 and Ki-67 of A549 cells in each group

    3 討論

    miR-1290是一種新發(fā)現(xiàn)的miRNA,在肺癌、胃癌、結直腸癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中均存在異常表達[8]。Mo等[9]的研究顯示,miR-1290在NSCLC患者血清中水平升高,且miR-1290高表達是影響NSCLC患者預后生存的獨立因素,提示miR-1290與NSCLC的惡性發(fā)展密切相關。Kim等[10]的研究顯示,miR-1290在A549細胞中表達明顯上調,差異表達的miR-1290可能通過下調Bcl-2的表達,抑制NSCLC細胞的凋亡。因此,本研究以NSCLC細胞A549為研究對象,分析miR-1290作用于NSCLC細胞的具體機制。本研究發(fā)現(xiàn),轉染miR-1290mimic后,A549細胞中miR-1290的表達顯著上調,IRF2的表達顯著下調,轉染miR-1290 inhibitor后,miR-1290的表達顯著下調,IRF2的表達顯著上調,證實轉染成功,提示miR-1290可以負調控IRF2。本研究采用熒光素酶實驗進一步驗證發(fā)現(xiàn),miR-1290可以靶向負調控IRF2的表達。IRF2是IRF家族的一員,可以結合干擾素基因啟動子,在免疫反應和促進細胞增殖方面發(fā)揮重要作用[11]。臨床研究顯示[12],IRF2參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展,可以抑制胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移,與本研究結果基本相符,提示miR-1290可能通過靶向負調控IRF2的表達,促進NSCLC細胞的惡性生物學行為,有望作為NSCLC分子靶向治療的新靶點。

    本研究結果顯示,IRF2過表達可以顯著下調Ki-67的表達,抑制A549細胞的增殖活性,miR-1290過表達可以靶向抑制IRF2的表達,使Ki-67增殖指數(shù)升高,促進A549細胞的增殖活性。Yan等[13]的研究顯示,miR-1290可以靶向調節(jié)LHX6的表達促進膠質瘤細胞的增殖、侵襲和遷移,提示miR-1290可以靶向負調控IRF2的表達,促進A549細胞的增殖。本研究結果顯示,IRF2過表達可以顯著抑制A549細胞的侵襲和遷移能力,miR-1290過表達可以靶向抑制IRF2的表達,促進A549細胞的侵襲和遷移。Liang等[14]的研究表明,IRF2可以促進肺癌細胞的凋亡,抑制其增殖和遷移,與本研究的結果基本相符,提示miR-1290可能通過靶向負調控IRF2的表達,抑制A549細胞的增殖和遷移。陳蓉等[15]的研究顯示,miR-1290可能通過與IRF2結合,促進A549細胞的增殖和侵襲,與本研究結果基本相符,提示miR-1290可能通過靶向抑制ADAM9的表達,抑制A549細胞的增殖、侵襲和遷移。

    在本研究中,IRF2過表達可以下調A549細胞的VEGF和MMP-2,上調E-cadherin水平,miR-1290過表達可以靶向抑制ADAM9的表達,上調VEGF和MMP-2,下調E-cadherin水平。VEGF是一種高度特異性的促血管生成因子,可以促進腫瘤血管的新生,在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用,研究顯示[16],VEGF高表達可以調控NSCLC細胞的惡性生物學行為,加快NSCLC的惡性發(fā)展,提示miR-1290可能通過靶向負調控IRF2的表達,上調VEGF的表達,促進A549細胞的增殖、侵襲和遷移。MMP-2是MMP家族的一員,可以降解和重塑細胞外基質,參與調控多種腫瘤細胞的侵襲和遷移[17]。E-cadherin是一種鈣依賴性的跨膜蛋白,可以調節(jié)細胞間的黏附作用,一旦其表達下調或缺失,可導致細胞間黏附作用下降,使癌細胞易發(fā)生脫落,促進其侵襲和轉移[18]。Butkiewicz等[19]的研究顯示,MMP-2、E-cadherin和VEGF可以作用于NSCLC細胞,促進其侵襲和遷移。Yi等[20]的研究顯示,miR-18a可以靶向IRF2調節(jié)胃癌細胞的惡性生物學行為,提示miR-1290可能通過靶向抑制IRF2的表達,調節(jié)MMP-2、E-cadherin和VEGF蛋白水平,促進A549細胞的惡性生物學行為。

    綜上所述,miR-1290可能通過靶向負調控IRF2的表達,上調VEGF、MMP-2,下調E-cadherin水平,使Ki-67增殖指數(shù)升高,促進A549細胞的增殖、侵襲和遷移,有望作為臨床治療的新靶點。

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