3-溴丙酮酸調(diào)控JAK/STAT信號通路抗人卵巢癌細胞株A2780增殖的實驗研究

郭云鴻，王瑞芳，田曉予

(河南科技大學第一附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，河南 洛陽471002)

卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤，也是婦科惡性腫瘤患者死亡的主要病因。據(jù)統(tǒng)計[1]，在婦科惡性腫瘤患者中，卵巢癌的發(fā)病率僅次于子宮頸癌與子宮體癌，但是其死亡率卻位居首位，且近年來隨著女性社會生活壓力的增加該病的發(fā)病率呈逐漸增長趨勢，對我國婦女的身心健康與生命均造成了極大的危害。手術(shù)、放化療均是目前臨床上常用的卵巢癌治療方法，但是臨床療效及遠期預后仍有待改善[2，3]。3-溴丙酮酸屬于己糖激酶抑制劑，在既往的報道中已經(jīng)證實能夠抑制包括卵巢癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤細胞的體外生長和增殖[4]。有研究顯示[5]，將荷卵巢癌腫瘤兔模型采用肝動脈注射3-溴丙酮酸治療發(fā)現(xiàn)腫瘤體積明顯變小，甚至有部分腫瘤直徑<1 mm的動物模型腫瘤病灶消失，證實3-溴丙酮酸具有抗卵巢癌作用。但是目前關(guān)于該藥物對卵巢癌的增殖抑制作用機制研究尚少。Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導子及轉(zhuǎn)錄激活子(JAK/STAT)是經(jīng)典的惡性腫瘤增殖信號傳導調(diào)控通路[6]，但是3-溴丙酮酸是否能夠調(diào)控人卵巢癌該信號通路并以此抑制惡性腫瘤細胞的增殖仍需要進一步探討。為證實該推測，本研究特進行體外實驗，以期為3-溴丙酮酸的臨床應用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞 人卵巢癌細胞株A2780，購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.1.2藥物、主要試劑和儀器 3-溴丙酮酸購自上海晶都生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜(DMSO)、二甲基噻唑(MTT)購自美國Sigma公司；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基均購自美國Hyclone公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)購自上海一研生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄、實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)試劑、二喹啉甲酸(BCA)蛋白分析試劑盒均購自賽默飛世爾中國有限公司；兔抗人JAK2、STAT3單克隆抗體(一抗)、山羊抗兔JAK2、STAT3多克隆抗體(二抗)均購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)、分組及干預 用RPMI1640(含濃度為10%胎牛血清)的培養(yǎng)液對人卵巢癌細胞株A2780培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：37℃、5 % 二氧化碳培養(yǎng)箱。觀察細胞生長情況，直至處于對數(shù)期時進行分裝，分裝參數(shù)為：1.5×106個細胞/孔，設(shè)置低、中、高劑量組和對照組，每組各包含5個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)待細胞貼壁生長后，3劑量組分別加入25、50、100 μmol/L濃度的3-溴丙酮酸，對照組加入等量PBS，繼續(xù)在37℃、5 % 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。

1.2.2細胞形態(tài)學變化 用透射電鏡在400倍下分別觀察培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后的細胞形態(tài)學變化。

1.2.3增殖抑制率變化 利用MTT法檢測3劑量組細胞培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后的增殖抑制率。收集上述各時刻細胞，每孔分別加入20 μl MTT溶液，繼續(xù)在37℃、5 % 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，將培養(yǎng)液撇去，每孔分別加入150 μl DMSO溶液，輕輕吹打，至溶液澄清且無結(jié)晶后利用試劑盒測定570 nm處波長的光密度值(OD)，細胞增殖抑制率=(OD對照組-OD劑量組)/OD對照組×100.00%。

1.2.4細胞周期分布 利用流式細胞儀檢測各組細胞培養(yǎng)72 h的細胞周期分布情況。按照1×106個/ml細胞濃度接種于100 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h。終止培養(yǎng)，收集原培養(yǎng)液，利用PBS緩沖液沖洗，置入離心管中。按照1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，撇去上清液，預冷后再次離心分離，去除PBS緩沖液和細胞碎片。再次預冷，加入3.5 ml無水乙醇并混合均勻，固定30 min。離心分離，吸出乙醇，加入PBS緩沖液清洗，離心分離去除殘留細胞的乙醇。吸去離心管中的PBS，加入PBS緩沖液和RNA酶，孵育30 min(37℃)。避光染色，過濾并標記EP管。開機并利用細胞分選系統(tǒng)檢測細胞周期分布情況。

1.2.5JAK2 mRNA、STAT3 mRNA表達檢測 利用RT-PCR檢測。收集各組培養(yǎng)72 h后的細胞，利用試劑盒提取沉淀細胞中的核糖核酸(RNA)，反轉(zhuǎn)錄擴增，并對互補的脫氧核糖核酸進行定量檢測，實施PCR擴增反應，反應體系包含：12.5 μl 2×qPCR Mix+2 μl 7.5 μM引物+2.5 μl互補的脫氧核糖核酸+8 μl ddH2O。其中JAK2 上游引物：5′-TCTGAGTACGTCTGTAGCGCTATCAGT-3′；下游引物：5′-ATCGGTGTAAGCTCGCTATGTACTCAG-3′；STAT3上游引物：5′-ACTCGATCGTCGGACGACAACGTCTA-3′；下游引物：5′-CTGGATGTCCTATCGACGGTCGTCATA-3′；β-actin：上游引物：5′-AGTCTATTATTACCCGATGGCCTATGAC-3′；下游引物：5′-TGTACACGTAGTAAATCGTCTGTAGTAC-3′。反應條件：95℃預變性300 s，95℃變性60 s，60℃退火40 s，55℃延伸120 s，溶解曲線75℃-95℃每20 s升溫1℃，以β-actin為內(nèi)參，目的基因相對表達強度為2-△△CT。

1.2.6JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達檢測 收集培養(yǎng)72 h后的各組細胞并利用試劑盒提取總蛋白，采用BCA進行定量。每孔上樣量為20 μl，進行電泳分離，裝配三明治后進行轉(zhuǎn)膜處理，時間為1.5 h。然后利用脫脂奶粉搖床封閉24 h，溫度為4℃。加入一抗(放大倍數(shù)：1∶1000)后室溫下?lián)u床孵育，時間為2 h，洗滌后滴加二抗(放大倍數(shù)：1∶10000)，室溫下?lián)u床孵育，時間為1 h，在暗室中顯色，并對灰度值進行分析。以所檢測蛋白的灰度值與內(nèi)參灰度值的比值描述蛋白相對表達量，其中內(nèi)參為β-actin。

1.3 觀察指標

①對比各組細胞形態(tài)學變化；②對比各組培養(yǎng)24 h、48 h和72 h增殖抑制率變化；③對比培養(yǎng)72 h后各組細胞周期分布結(jié)果；④對比培養(yǎng)72 h后各組JAK2 mRNA、STAT3 mRNA表達；⑤對比培養(yǎng)72 h后各組JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 各組細胞形態(tài)學變化

在透射電鏡下檢查發(fā)現(xiàn)對照組各時刻均表現(xiàn)出細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)規(guī)則、染色質(zhì)均勻分布、細胞膜完整的形態(tài)，低中高劑量組出現(xiàn)典型的核固縮、染色質(zhì)無規(guī)律分布、邊界不清或染色質(zhì)集中于核膜且呈新月狀，細胞膜不完整等。其中高劑量組形態(tài)學異常最為顯著，中劑量組形態(tài)學明顯異常，低劑量組稍有異常，且均呈時間依賴性。

2.2 各組培養(yǎng)24 h、48 h、72 h增殖抑制率變化對比

各組培養(yǎng)24 h、48 h、72 h增殖抑制率對比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且均呈時間依賴性和劑量依賴性，本組內(nèi)每2個時刻、各時刻每2組間增殖抑制率對比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組培養(yǎng)24 h、48 h、72 h增殖抑制率變化對比

注：與培養(yǎng)24 h比較，aP<0.05；與培養(yǎng)48 h比較，bP<0.05；與低劑量組比較，cP<0.05；與中劑量組比較，dP<0.05。

2.3 培養(yǎng)72 h后各組細胞周期分布結(jié)果對比

培養(yǎng)72 h后各組細胞G0/G1期、G2/M期結(jié)果對比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中對照組G0/G1期最高，低劑量組次之，中劑量組更低，高劑量組最低，高劑量組G2/M期最高，中劑量組次之，低劑量組更低，對照組最低，每2組間對比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；各組細胞S期對比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 培養(yǎng)72 h后各組細胞周期分布結(jié)果對比

注：與對照組比較，aP<0.05；與低劑量組比較，bP<0.05；與中劑量組比較，cP<0.05。

2.4 培養(yǎng)72 h后各組JAK2 mRNA、STAT3 mRNA表達對比

培養(yǎng)72 h后各組JAK2 mRNA、STAT3 mRNA表達對比差異均無統(tǒng)計學意義(P<0.05)，每2組間JAK2 mRNA、STAT3 mRNA表達對比差異均無統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 培養(yǎng)72 h后各組JAK2 mRNA、STAT3 mRNA表達對比

2.5 培養(yǎng)72 h后各組JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達對比

培養(yǎng)72 h后各組p-JAK2、p-STAT3蛋白表達、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3對比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中對照組p-JAK2、p-STAT3蛋白表達、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3均最高，低劑量組均次之，中劑量組均更低，高劑量組均最低，每2組間對比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4和圖1。

表4 培養(yǎng)72 h后各組JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達對比

注：與對照組比較，aP<0.05；與低劑量組比較，bP<0.05；與中劑量組比較，cP<0.05。

圖1 各組JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達檢測結(jié)果

3 討論

卵巢癌的發(fā)生與年齡、遺傳因素、內(nèi)分泌紊亂、環(huán)境和精神壓力等因素均存在緊密的關(guān)系，卵巢癌的擴散、轉(zhuǎn)移和復發(fā)的基礎(chǔ)均是惡性腫瘤細胞增殖，而惡性腫瘤細胞增殖還會影響卵巢癌患者的臨床療效，甚至導致不良預后，危及其生命安全[7,8]。因此采取有效的手段控制卵巢癌細胞增殖是抗卵巢癌治療的重要任務。手術(shù)能夠及時切除病灶，但是對于晚期卵巢癌患者并不適用。放化療也是目前卵巢癌患者常用的治療手段，但是綜合療效也不佳，并且在抗腫瘤的同時還會造成副作用，安全性不甚理想，故而臨床醫(yī)生應當積極探討理想的卵巢癌治療藥物以控制細胞增殖，增強療效并改善預后。

本次研究發(fā)現(xiàn)，對照組細胞學形態(tài)隨著時間的延長無明顯變化，均較佳，而3劑量組細胞形態(tài)學均有異常改變，呈現(xiàn)劑量依賴性和時間依賴性，可知高劑量3-溴丙酮酸能夠促使人卵巢癌細胞株A2780發(fā)生形態(tài)學變化，為抑制惡性腫瘤細胞的增殖奠定基礎(chǔ)。此外，本研究中3劑量組增殖抑制率均隨著時間的延長而升高，且高劑量組均最高，中劑量組均稍低，低劑量組均最低，證實3-溴丙酮酸能夠有效抑制人卵巢癌細胞株A2780的增殖，且高劑量的效果最佳。另外關(guān)于細胞分期的對比結(jié)果顯示，對照組G0/G1期的構(gòu)成比均最高，低劑量組均次之，中劑量組均稍低，高劑量組均最低，而G2/M期構(gòu)成比結(jié)果完全相反，提示3-溴丙酮酸能夠?qū)盒阅[瘤細胞阻滯于G2/M期，從而發(fā)揮抑制人卵巢癌細胞株A2780增殖的作用，且呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。3-溴丙酮酸屬于一種強烷化劑，能夠抑制己糖激酶II的活性，從而控制惡性腫瘤細胞內(nèi)的糖酵解，誘導細胞正常生長和增殖所需的能量供應減少，從而導致惡性腫瘤細胞無法正常增殖，增殖抑制率得到提升[9-11]。有研究表明[12]，在缺氧情況下，惡性腫瘤細胞的糖酵解增強，對普通化療藥物的敏感性變差，甚至會產(chǎn)生耐藥性，而3-溴丙酮酸的應用能夠減少三磷酸腺苷的產(chǎn)生，控制能量供應，抑制多耐藥惡性腫瘤細胞的增殖，因此該藥物的確具有抗惡性腫瘤細胞增殖的積極作用。

此外，本次研究中各組JAK2 mRNA、STAT3 mRNA表達對比和每2組間表達對比差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，關(guān)于p-JAK2、p-STAT3蛋白表達、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3的對比結(jié)果顯示，對照組上述指標水平均最高，低劑量組均次之，中劑量組均更低，高劑量組均最低，可知3-溴丙酮酸能夠通過JAK/STAT信號通路下調(diào)p-JAK2、p-STAT3蛋白表達，降低p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3水平，且劑量越高對上述基因和蛋白的表達水平控制效果越佳。JAK2屬于酪氨酸激酶中Janus家族的一個重要成員，能夠介導惡性腫瘤細胞的增殖調(diào)控因子、造血和免疫功能的多個細胞因子的生物學活性，在惡性腫瘤細胞中其基因和蛋白表達水平均較高，能夠正反饋調(diào)控其下游STAT3基因和蛋白的表達，共同參與惡性腫瘤細胞增殖的調(diào)控[13,14]。JAK/STAT信號通路是近年來發(fā)現(xiàn)參與細胞增殖、分化等多種生物學行為的信號轉(zhuǎn)導通路，由細胞因子產(chǎn)生刺激，影響惡性腫瘤患者的療效和預后[15]。3-溴丙酮酸對人卵巢癌細胞株A2780增殖的抑制作用已得到證實[16]，但是對JAK/STAT信號通路的調(diào)控作用仍未得到證實。目前關(guān)于3-溴丙酮酸抑制惡性腫瘤細胞增殖的報道主要顯示是通過引起糖酵解，減少能量供應發(fā)揮作用的[17-19]。結(jié)合本研究結(jié)果和上述分析，推測3-溴丙酮酸很可能能夠通過調(diào)控JAK/STAT信號通路抑制p-JAK2、p-STAT3蛋白表達，下調(diào)p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3從而參與促進糖酵解，減少能量供應，誘導細胞增殖受抑制的，但是具體作用機制仍有待進一步研究證實。

綜上所述，3-溴丙酮酸能夠有效促使人卵巢癌細胞株A2780細胞形態(tài)學改變，抑制增殖，且呈明顯的劑量依賴性，推測該藥物很可能能夠通過調(diào)控JAK/STAT信號通路抑制p-JAK2、p-STAT3蛋白表達，下調(diào)p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3發(fā)揮抑制惡性腫瘤細胞增殖的作用，但是需作為進一步的研究方向。