COL1A1 敲除抑制卵巢癌細胞 ES-2 增殖*

錢若文軒，楊柳青，石子晴，陳子彥，胡漢寅，鄒尚樸，朱恒延，潘巍巍

(嘉興學院醫(yī)學院生物教研室， 浙江 嘉興 314001)

I型膠原蛋白α1鏈(collagen type I alpha 1 chain, COL1A1)，由COL1A1基因編碼，它可以構(gòu)成膠原纖維，同時也作為骨髓的有效成分，參與細胞增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移和血管生成，并且與多種類型腫瘤有關(guān)[1-3]。研究表明，在以I型膠原蛋白為支架材料進行人卵巢癌細胞HO-8910 PM體外三維培養(yǎng)時，細胞在I型膠原蛋白基質(zhì)大部分存活，并且能夠募集成簇，正常生長，通過觀察I型膠原蛋白基質(zhì)中細胞的形態(tài)、活力和增殖情況，表明I型膠原蛋白所形成的黏性交叉網(wǎng)絡狀結(jié)構(gòu)能夠充分支持卵巢癌細胞的生長[4]。Ⅰ型膠原蛋白基因缺乏可促進乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移[5]，在腦腫瘤中Ⅰ型膠原蛋白是腫瘤微環(huán)境的重要成分[6]。Want3a/β-catenin通路中MRTF-A沉默可降低乙?；M蛋白H3K9和RNA聚合酶在COL1A1啟動子上結(jié)合，減少COL1A1的表達，而轉(zhuǎn)錄因子osterix能夠直接與COL1A1的啟動子相結(jié)合，上調(diào)COL1A1表達量[7]。

在本研究中，我們通過CRISRP/Cas9技術(shù)構(gòu)建COL1A1基因敲除的人卵巢癌ES-2細胞，通過細胞增殖、克隆形成和細胞遷移研究COL1A1缺失在卵巢癌中的作用，為進一步篩選卵巢癌治療的分子靶標提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

TaKaRa 高保真酶、5×Buffer、T4 DNA連接酶、氨芐青霉素、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和qPCR試劑盒均購自大連寶生物公司；T4多聚核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase,T4 PNK)和BbsI購自NEB；DL10000 DNA Marker、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、 DNA膠回收純化試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購自Axygen BioSciences； Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen； DH5α感受態(tài)細胞由本實驗室保存； Polybrene購自Sigma； PolyJetTM轉(zhuǎn)染試劑購自SignaGen； FBS購自Gibco；DMEM/FI2 和RPIM-1640細胞培養(yǎng)液、PBS、胰蛋白酶和青鏈霉素購自HyClone；TRIzol均購自Invitrogen； β-actin抗體購自Cell Signaling Technology; COL1A1抗體購自Santa Cruz;各種II抗購自 Jackson Labs。PX459質(zhì)粒由美國加州大學圣地亞哥分校管坤良教授贈送。

2 動物和細胞

ES-2卵巢癌細胞由購自中科院上海細胞所。 ES-2細胞使用DMEM/F12細胞培養(yǎng)液(含有10% FBS和1%青鏈霉素)，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞1 ∶ 3的比例傳代，每1～2 d換液以供后繼實驗使用。6～8周齡BALB/c 雌性裸鼠，SPF級，體重20～30 g，10只購自浙江省實驗動物中心(合格證編號為20130016009052)，裸鼠飼養(yǎng)在嘉興學院醫(yī)學院實驗動物中心，SPF級。

3 主要方法

3.1脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和COL1A1敲除的卵巢癌細胞篩選COL1A1基因的sgRNA序列連接參照文獻[8]。COL1A1-1: GACGGGACAGCACTCGCCCT;COL1A1-2: GCAGGAGATTACCTCGACGC。1×105個卵巢癌ES-2細胞接種于6孔板，使用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑將構(gòu)建好的PX459空載體、PX459-COL1A1-1和 PX459-COL1A1-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到ES-2細胞。轉(zhuǎn)染 8 h后給細胞換成正常培養(yǎng)液。24 h后給細胞加嘌呤霉素(2 mg/L)篩選 3 d， 獲得穩(wěn)定敲除COL1A1基因的細胞系。

3.2細胞計數(shù) 血細胞計數(shù)板計數(shù)，每孔分別取1×105個對照細胞(WT)與COL1A1基因敲除的卵巢癌細胞ES-2(COL1A1 KO)接種于6孔板過夜培養(yǎng)，換成新鮮培養(yǎng)液或無血清培養(yǎng)液連續(xù)3 d計數(shù)，每天計數(shù)前用倒置熒光顯微鏡拍照。

3.3TRIzol法提取細胞總RNA和定量PCR 卵巢癌細胞用TRIzol法提取細胞總RNA，過程詳見試劑說明，使用核酸定量分析儀測 RNA濃度。逆轉(zhuǎn)錄過程如下：65 ℃保溫5 min，冰上迅速冷卻，98 ℃ 10 s，65 ℃ 15 s，72 ℃ 60 s，45個循環(huán)。將cDNA以1 ∶5比例用DEPC水稀釋，對照組cDNA和實驗組cDNA用以實時熒光定量PCR檢測，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1. The sequences of the primers

MMP-13: matrix metalloproteinase-13; TIMP-1: tissue inhibitor of metalloproteinase-1; BMP2: bone morphogenetic protein 2.

3.4Western blo實驗 將對照細胞與COL1A1敲除的卵巢癌ES-2細胞過夜培養(yǎng)，計數(shù)，分別收集5×105個對照細胞與COL1A1敲除的卵巢癌細胞于1.5 mL的離心管中，收集細胞，提取細胞總蛋白，取100 μg總蛋白做SDS-PAGE，轉(zhuǎn)至PVDF膜上， 5%脫脂奶粉中封閉過夜, TBST洗膜3次， 每次10 min，與抗β-actin和COL1A1抗體4℃孵育過液，TBST洗膜3次， 每次10 min，加入II抗孵育TBST洗膜3次， 每次10 min，雜交反應后應用ECL Western blot化學發(fā)光試劑盒暗房顯影。

3.5PI-Annexin V染色檢測細胞凋亡 將對照細胞與COL1A1敲除的卵巢癌細胞ES-2過夜培養(yǎng)，計數(shù)，分別收集1×106個細胞于15 mL的離心管中，用預冷1×PBS補足至2 mL， 離心5 min棄上清，再用預冷的2 mL 1×PBS洗滌2次,用1 mL 1× binding buffer重懸細胞，取1×105個細胞(即100 μL液體)放置到1.5 mL 離心管中， PI-Annexin V染色按照試劑盒說明操作，設置對照，室溫避光放置15 min, 用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡。

3.6軟瓊脂集落形成實驗 配制0.5%下層膠，取1.5 mL混合液于6孔板，配制底層膠，室溫靜置15 min待膠凝固。將對照細胞與COL1A1 KO的細胞用培養(yǎng)液將細胞吹打成單細胞懸液，血細胞計數(shù)板計數(shù)，與 0.35%頂層膠混合，接種于6孔板，細胞數(shù)為每孔2 500。室溫靜置15 min待膠凝固，在上層放入 2 mL新鮮DMEM培養(yǎng)液，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)14～20 d，用臺盼藍染色后計算集落數(shù)(每個集落的細胞數(shù)目大于50), 每組設3個重復，實驗重復3次。

3.7細胞劃痕實驗 將對照細胞與COL1A1基因敲除的卵巢癌細胞ES-2接種于6孔板過夜培養(yǎng)，待細胞密度達到 80%用200 μL吸頭在細胞表面劃過，使細胞形成劃痕，給細胞換成無血清培養(yǎng)液，分別在0 h、10 h和20 h在同一位置照相,觀察細胞的遷移。

3.8免疫熒光 分別取1×105個對照細胞與COL1A1基因敲除的ES-2細胞,接種于放置玻片的24孔板，細胞過夜培養(yǎng)，PBS洗1次，4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS洗3次，用含5%BSA的PBST封閉液室溫封閉1 h, 棄封閉液加入 p-histone H3、p-H2AX、cleaved caspase-3和Ki-67 I抗(1 ∶200)室溫1 h，PBS洗3次， 加入150 μL II抗，室溫避光孵育1 h，DAPI 復染5 min，PBS洗3遍，封片，觀察。

3.9PI染色檢測細胞周期 分別收集1×106個WT和COL1A1基因敲除ES-2細胞于1.5 mL離心管中，離心去上清，加入1 mL預冷的PBS洗滌，離心，去上清，再加入300 μL預冷的PBS，重懸細胞。再將重懸液緩慢滴入700 μL預冷的無水乙醇中，固定過夜。第2天將1.5 mL的固定液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，補加2 mL PBST，離心去上清。用2 mL預冷的PBST緩慢重懸細胞，離心去上清，操作同上一步，2次。用500 μL染色液重懸細胞，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，避光30～60 min,用流式細胞儀檢測細胞周期。

3.10裸鼠荷瘤模型 6～8周齡BALB/c 雌性裸鼠，SPF級，體重20～30 g，共10只，分成2組，每組5只。在無菌條件下，每只裸鼠兩側(cè)各注射5×105個細胞，第1組注射WT ES-2細胞,第2組注射COL1A1基因敲除ES-2細胞。1周后用游標卡尺測量腫瘤大小，待腫瘤直徑≥15 mm，深度麻醉后處死小鼠取腫瘤并稱重。

4 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism統(tǒng)計軟件統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 COL1A1敲除抑制卵巢癌ES-2細胞增殖、集落形成和遷移

通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除人卵巢癌ES-2細胞中COL1A1基因，如圖1A所示，ES-2細胞中COL1A1基因出現(xiàn)了大片段堿基順序紊亂；Western blot結(jié)果顯示COL1A1基因敲除組COL1A1蛋白表達量顯著降低,見圖1B。這些結(jié)果表明我們通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在卵巢癌ES-2細胞中成功敲除COL1A1基因。我們連續(xù)3 d對野生型ES-2細胞和COL1A1基因敲除ES-2細胞進行計數(shù)，結(jié)果顯示無論在有血清還是無血清的培養(yǎng)液里ES-2野生型ES-2細胞增殖率均明顯高于Col1a1基因敲除ES-2細胞 (P<0.01),見圖1C。免疫熒光檢測表明在COL1A1敲除的卵巢癌細胞中增殖相關(guān)蛋白Ki-67表達顯著降低，見圖3B, Western blot檢測p-histone H3蛋白的表達量在COL1A1敲除的卵巢癌細胞中明顯增加，見圖4B。軟瓊脂集落形成實驗結(jié)果顯示COL1A1敲除顯著抑制細胞集落形成能力(P<0.01)，見圖1D。細胞劃痕實驗結(jié)果顯示COL1A1敲除抑制了卵巢癌細胞的遷移(P<0.01)，見圖1E。

Figure 1.COL1A1gene deletion inhibited the proliferation, colony formation and migration of human ovarian cancer ES-2 cells. A: genomic sequencing ofCOL1A1deletion in ES-2 cells; B: COL1A1 protein expression in ES-2 cells was detected by Wes-tern blot； C： the proliferation of ES-2 cells with or without fetal bovine serum (FBS) was determined by Trypan blue staining; D: the number of colonies formed by ES-2 cells was counted after Trypan blue staining; E: the migration of ES-2 cells was determined by wound-healing assay (×10). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsWT group.
圖1COL1A1基因敲除抑制卵巢癌細胞增殖、集落形成和遷移

2 COL1A1敲除將卵巢癌細胞周期阻滯在G2期

COL1A1敲除的卵巢癌細胞G1和S期細胞減少，G2期細胞顯著增加(P<0.01)，見圖2A。實時定量PCR檢測細胞周期相關(guān)基因p53下游基因Noxa和p16的表達在COL1A1敲除的卵巢癌細胞中顯著增加(P<0.01)，見圖2B。

Figure 2. Deletion ofCOL1A1affected ES-2 cell cycle. A: the cell cycle was measured by flow cytometry； B: Noxa and p16 mRNA expression was detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsWT group.
圖2COL1A1缺失影響ES-2細胞周期

3 COL1A1敲除促進細胞凋亡和DNA損傷

PI-Annexin V細胞凋亡實驗表明COL1A1敲除的卵巢癌細胞凋亡顯著增多(P<0.01),見圖3A。免疫熒光檢測細胞增殖相關(guān)蛋白Ki-67在COL1A1敲除的卵巢癌細胞中低表達，凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3和DNA損傷相關(guān)蛋白p-H2AX在COL1A1敲除的卵巢癌細胞中高表達,見圖3B。Western blot結(jié)果表明COL1A1敲除還促進凋亡相關(guān)蛋白cleaved PARP蛋白表達增加,圖4B。

Figure 3. Deletion ofCOL1A1promoted apoptosis and DNA damage of ES-2 cells. A: the cell apoptosis was detected by PI-Annexin V staining and flow cytometry; B: immunofluorescence was used to detect the expression and distribution of Ki-67, cleaved caspase-3 and p-H2AX (green). DAPI for DNA (blue). The scar bar=30 μm. *: cleaved caspase-3 staining positive cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsWT group.
圖3COL1A1缺失促進ES-2細胞凋亡和DNA損傷

4 COL1A1敲除通過影響多種分子表達而抑制卵巢癌細胞增殖

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，在COL1A1敲除的細胞中osterix和MMP13的mRNA表達量顯著減少(P<0.01)，aggrecanase-1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 (bone morphogenetic protein 2, BMP2)和聚集蛋白聚糖(aggrecan)表達量顯著增多(P<0.01)，而金屬蛋白酶組織抑制物1(tissue inhibitor of metallopro teinase 1, TIMP1)mRNA表達無顯著差異(P>0.05); Western blot檢測結(jié)果表明，COL1A1敲除的細胞中p-ERK1/2和Akt表達量明顯增加，見圖4。

Figure 4. Effects ofCOL1A1deletion on the expression of various molecules in ES-2 cells. A: the mRNA expression of osterix, MMP-13, aggrecanase-1, aggrecan, TIMP1 and BMP2 was detected by RT-qPCR; B: the protein levels of ERK1/2, p-ERK1/2, p-histone H3, PARP, cleaved PARP and Akt were detected by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsWT group.
圖4COL1A1缺失對多種分子表達的影響

5 COL1A1敲除抑制卵巢癌細胞在裸鼠體內(nèi)增殖

為了進一步驗證COL1A1缺失在體內(nèi)的作用，給裸鼠分別注射了WT和COL1A1敲除ES-2細胞,并記錄裸鼠腫瘤的大小及稱重。結(jié)果顯示，COL1A1敲除在體內(nèi)明顯抑制腫瘤生長，見圖5A、B。Western blot結(jié)果顯示，COL1A1敲除的腫瘤組織中p-ERK1/2表達增加，p-histone H3表達降低(圖5C)。RT-qPCR檢測結(jié)果顯示， osterix和MMP-13在COL1A1敲除的腫瘤組織中低表達，而aggrecanase-1在COL1A1敲除的腫瘤中高表達,見圖5D。

Figure 5.COL1A1deletion inhibited tumor growth in vivo. The WT andCOL1A1-deficient ES-2 cells (5×105cells per injection) were subcutaneously implanted into nude mice. A: the tumor growth curve; B: the tumor size and weight at the end of the experiment; C: the protein levels of COL1A1, ERK1/2, p-ERK1/2 and p-histone H3 in the tumor with COL1A1 deletion; D: the mRNA expression of MMP-13, osterix and agrecanase-1 was detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3～5.**P<0.01vsWT group.
圖5COL1A1缺失抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤形成

討 論

COL1A1基因編碼I型膠原的pro-α1鏈，I型膠原蛋白的三螺旋包含2條α1鏈和1條α2鏈[9]。I型膠原蛋白是形成原纖維的膠原蛋白。COL1A1作為原癌基因與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[10-12]。Mori等[13]研究發(fā)現(xiàn)COL1A1在人膀胱癌分化和轉(zhuǎn)移中具有重要作用。Liu等[14]證實COL1A1能夠介導乳腺癌轉(zhuǎn)移，可以作為乳腺癌潛在的治療靶點。此外，COL1A1還作為肝癌發(fā)生和發(fā)展的一個重要標志物[15]，但COL1A1在卵巢癌中的作用研究較少。

本研究通過CRISPR/Cas9基因編輯方法檢測卵巢癌細胞中COL1A1的功能，該基因編輯方法是在引導RNA指導下與目的核酸片段進行靶向結(jié)合并切割， DNA片段可以是有編碼功能也可以是沒有編碼功能的。另外，研究表明CRISPR/Cas9體系的脫靶效應要遠低于RNA干擾。最為重要的是利用CRISPR/Cas9體系編輯的細胞單克隆表型長時間內(nèi)較穩(wěn)定，可以用于動物體內(nèi)研究，因此本研究采用CRISPR/Cas9基因編輯方法進行相關(guān)研究[16]。實驗結(jié)果顯示,COL1A1基因敲除可在體外抑制細胞的增長與遷移，在體內(nèi)可減慢腫瘤的生長速度。COL1A1敲除的卵巢癌細胞被阻滯在G2期，促凋亡基因Noxa和調(diào)控細胞周期的p16基因表達增多。此外，細胞增殖相關(guān)蛋白Ki-67和p-histone H3在COL1A1敲除的卵巢癌細胞中低表達，而凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3和cleaved PARP在COL1A1敲除的卵巢癌細胞中高表達。這些結(jié)果表明，在卵巢癌細胞中敲除COL1A1可以影響細胞周期、抑制細胞增殖，通過影響caspase-3蛋白的表達從而影響細胞凋亡。為了尋找分子機制，我們查閱文獻發(fā)現(xiàn)COL1A1敲除影響多種靶基因表達。osterix能夠直接與COL1A1的啟動子結(jié)合誘導COL1A1基因表達[17]。RT-qPCR驗證顯示無論在體內(nèi)還是體外COL1A1敲除的卵巢癌細胞osterix和MMP-13表達減少，agrecanase-1表達上升。

基質(zhì)金屬蛋白酶類(matrix metalloproteinases，MMPs)是一類具有鋅離子依賴性的內(nèi)源性蛋白水解酶，可介導腫瘤新生血管的形成，調(diào)節(jié)腫瘤細胞與基質(zhì)的黏附，激活具有潛在活性的蛋白來影響腫瘤轉(zhuǎn)移。研究表明，MMP-1和MMP-9與胃癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移有著密切聯(lián)系[18]。MMP-13即膠原酶3在各種生理和病理條件下降解ECM，作用于膠原纖維Ⅳ型和Ⅴ型軟骨膠元質(zhì)，層粘蛋白等，與胃癌、非小細胞肺癌等的浸潤與轉(zhuǎn)移有關(guān)[19-20]。Li等[21]結(jié)果顯示MMP-13基因啟動子區(qū)功能多態(tài)性與上皮性卵巢癌的發(fā)病有關(guān)。本研究結(jié)果顯示在COL1A1敲除的卵巢癌細胞中，MMP-13表達減少，可猜測COL1A1能抑制MMP-13表達從而減少卵巢癌細胞的增殖轉(zhuǎn)移。而aggrecanase-1表達上升,可能與其聚集作用相關(guān)，增加細胞外基質(zhì)合成，抑制卵巢癌細胞轉(zhuǎn)移。

MAPK信號通路參與多種腫瘤細胞增殖，分化，凋亡和遷移等生物學過程[22]。有研究顯示p38 或 ERK1/2 MAPK信號通路可以影響COL1A1的轉(zhuǎn)錄[15]。本研究顯示COL1A1敲除的卵巢癌細胞p-ERK1/2表達量增加，這表明在卵巢癌細胞中ERK1/2 MAPK信號通路也與COL1A1的表達有關(guān)。

綜上所述，COL1A1可以通過影響不同基因轉(zhuǎn)錄及信號通路蛋白表達，從而調(diào)控卵巢癌細胞增殖、凋亡、遷移和DNA損傷。因此，COL1A1可以作為卵巢癌治療的分子靶點，來減緩腫瘤發(fā)展速度。