基于整合素介導(dǎo)的炎癥通路分析PM2.5對人血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷機(jī)制

張林 余路陽 暴一眾*

近年來實(shí)驗(yàn)研究表明，PM2.5可能推動(dòng)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的發(fā)生從而損傷內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)一步引發(fā)各類心血管疾?。?］，但其引發(fā)的損傷程度、特別是損傷機(jī)制和通路并未明確。在炎癥反應(yīng)的發(fā)展過程中，JNK、p38、IKK等蛋白激酶起關(guān)鍵作用，其可以活化多種核轉(zhuǎn)錄因子（AP-1、NF-κB）等，使其入核調(diào)控大量炎癥因子產(chǎn)生，引發(fā)炎癥反應(yīng)［2］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，人體血漿內(nèi)的vWF含量與空氣中PM2.5濃度呈正比［3］。而vWF是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成員之一，能與整合素（ITG）特異性結(jié)合，激發(fā)ITG介導(dǎo)的信號(hào)通路［4］。2017年6月至2019年3月作者通過實(shí)驗(yàn)研究，探討ITG介導(dǎo)通路在PM2.5誘導(dǎo)JNK、p38、IKK等蛋白激酶表達(dá)、引發(fā)炎癥反應(yīng)、損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用，分析PM2.5損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞、引發(fā)心血管疾病的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑中流量顆粒物采樣器（嶗應(yīng)2050，青島嶗山應(yīng)用技術(shù)研究所）、BX53型倒置顯微鏡（日本OLYMPUS）；CytoFlex分析型流式細(xì)胞儀（美國Beckman）；ThermoForma3111型CO2培 養(yǎng) 箱（美 國Thermo）；垂直板電泳儀；半干轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad）；多功能酶標(biāo)儀（上海申順生物）。HUVEC細(xì)胞（CRL1730，美國ATCC）；乙醇（中國華源醫(yī)療）；胎牛血清（杭州四季青生物）；DMEM高糖培養(yǎng)液（杭州吉諾生物）；BCA蛋白濃度檢測試劑盒、噻唑藍(lán)（MTT）（上海碧云天）；MDA、SOD、LDH檢測試劑盒（南京建成生物）；ROSELISA試劑盒（青島捷世康生物）；vWFELISA試劑盒（上海喬羽生物）；各類蛋白抗體（英國Abcam）；磷酸緩沖鹽溶液（PBS）（天津?yàn)笊铮?/p>

1.2 HUVEC培養(yǎng)將HUVEC接種到含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶，使用胰酶-EDTA消化液對細(xì)胞傳代。細(xì)胞量達(dá)到所需要時(shí)，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板放在倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度，注入細(xì)胞板中培養(yǎng)，備用。

1.3 PM2.5采集及染毒液制備在浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)樓6樓戶外平臺(tái)設(shè)置采樣點(diǎn)放置PM2.5采樣器（采樣流量100L/min）。單次采樣為24h，連續(xù)采樣。將采樣器內(nèi)收集PM2.5的濾膜取出，剪成小塊浸入去離子水中，放入超聲振蕩器中振蕩4次，溫度20℃，30min/次，振蕩后用6層無菌紗布過濾收集濾液，將濾液用真空冷凍干燥機(jī)冷凍干燥制成干粉。稱取干粉50mg加入1mlPBS溶液配制成50mg/ml的染毒母液，-80℃避光保存?zhèn)溆?。染毒前將母液超聲振蕩后加?mlPBS，稀釋成5mg/ml染毒液，共10ml。取染毒液20、80、160μl，分別加入1980、1920、1840μl細(xì)胞培養(yǎng)液，配制成質(zhì)量濃度分別為50、200、400μg/ml的PM2.5混懸培養(yǎng)液備用。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組將培養(yǎng)24h的HUVEC分成2組：（1）對照組（PM2.5濃度0μg/ml）：繼續(xù)用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)；（2）染毒組（設(shè)置3個(gè)濃度梯度）：分別用不同濃度（50、200、400μg/ml）的PM2.5混懸培養(yǎng)液染毒培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 MTT法、流式細(xì)胞術(shù)法分別檢測細(xì)胞存活率、凋亡率每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔加入MTT溶液（5g/L）20μl，于37℃、5%CO2和100%飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育4h。吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μlDMSO，置搖床上低速振蕩10min，用酶標(biāo)儀在570nm處檢測每孔OD值，并計(jì)算細(xì)胞存活率。收集細(xì)胞并以1000r/min離心10min，去培養(yǎng)液，PBS洗滌。用500μl的Bindingbuffer重懸細(xì)胞，加入5μl的AnnexinV-FITC和5μl的PI，混勻后室溫下避光反應(yīng)10min，隨即用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.6 檢測細(xì)胞內(nèi)MDA、SOD、LDH、ROS含量，胞外vWF含量收集各組細(xì)胞，用硫代巴比妥法檢測MDA含量、黃嘌呤氧化酶法檢測SOD含量（活力）、比色法檢測LDH含量（活力）、ELISA法檢測ROS與vWF含量。具體操作步驟按各試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 WesternBlot法檢測ITG通路中關(guān)鍵蛋白含量收集細(xì)胞，提取總蛋白后用BCA法檢測所提取蛋白濃度，并計(jì)算電泳上樣量與緩沖液體積，確保每個(gè)泳道蛋白含量達(dá)到40μg。用SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，350mA恒流1h后轉(zhuǎn)到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜后、用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉1h，TBST洗滌2次。加一抗稀釋液于4℃孵育過夜，TBST洗膜3次；加二抗處理后用TBST洗膜4次。以化學(xué)發(fā)光法檢測，并采用QuantityOne軟件分析條帶灰度值。以β-actin、GAPDH做內(nèi)參蛋白。

1.8 免疫熒光定位AP-1c-Jun蛋白亞基和NF-κBp65蛋白亞基收集細(xì)胞，用胰酶-EDTA消化液消化后，PBS清洗，多聚甲醛固定10min。結(jié)合后用PBS洗滌3次，0.2%TritonX-100通透20min，加入5%山羊血清在室溫下封閉20min，加入一抗，4℃過夜，洗去一抗后，加FITC標(biāo)記的二抗，孵育45min。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將DAPI（1mM）加入到培養(yǎng)基中并在37℃孵育30min，雙蒸水清洗5min，吸干，中性樹膠封片，熒光顯微鏡分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用（LSD）檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度PM2.5作用下HUVEC存活率、凋亡率及SOD、MDA、LDH、ROS、vWF含量比較隨著PM2.5濃度增加，HUVEC凋亡率呈上升趨勢；細(xì)胞存活率和SOD含量呈下降趨勢，MDA、LDH、ROS、vWF含量呈上升趨勢。各個(gè)指標(biāo)在PM2.5濃度增加到200μg/ml后，與對照組（PM2.5濃度0μg/ml）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1、圖1。

2.2 PM2.5作用下ITG介導(dǎo)通路中各關(guān)鍵蛋白表達(dá)情況和核轉(zhuǎn)錄因子AP-1、NF-κB蛋白表達(dá)情況隨著PM2.5濃度升高，ITG介導(dǎo)的兩條通路中的關(guān)鍵蛋白表達(dá)量及核轉(zhuǎn)錄因子AP-1、NF-κB表達(dá)均上調(diào)；且在PM2.5濃度>200μg/ml，與對照組比較，上述蛋白表達(dá)量均顯著上升差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2。

2.3 PM2.5作用下核轉(zhuǎn)錄因子（AP-1、NF-κB）的核定位水平隨著PM2.5濃度增加，AP-1c-Jun和NFκBp65熒光強(qiáng)度值增大，質(zhì)核熒光比例下降，顯示AP-1和NF-κB含量增加且進(jìn)入細(xì)胞核數(shù)量上升。在PM2.5濃度達(dá)200μg/ml，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

表1 不同濃度PM2.5作用下HUVEC存活率、凋亡率及SOD、MDA、LDH、ROS、vWF含量比較（±s）

表1 不同濃度PM2.5作用下HUVEC存活率、凋亡率及SOD、MDA、LDH、ROS、vWF含量比較（±s）

注：與對照組比較，*P<0.01

PM2.5濃度（μg/ml） 細(xì)胞存活率（%） 細(xì)胞凋亡率（%） SOD（U/ml） MDA（μmol/L） LDH（U/L） ROS（mg/ml） vWF（mU/ml）0 100.00 6.43±0.95 17.92±1.06 1.31±0.3 679.7±82.23 5.77±0.11 0.592±0.027 50 92.91±2.55* 17.88±1.04* 12.71±0.94* 1.86±0.56 726.26±61.2 6.63±0.25* 0.717±0.034*200 79.18±3.15* 26.69±1.52* 7.38±0.67* 3.89±0.41* 1294.23±89.52* 9.1±0.37* 1.025±0.046*400 64.92±2.33* 40.48±1.61* 2.36±0.58* 4.28±0.49* 1340.78±93.48* 8.94±0.39* 1.207±0.057*

圖1 不同濃度PM2.5作用下HUVEC的流式散點(diǎn)分布圖

圖2 不同濃度PM2.5作用下HUVEC內(nèi)ITG通路關(guān)鍵蛋白及核轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)

圖3 不同濃度PM2.5作用下細(xì)胞內(nèi)AP-1 c-Jun和NF-κB p65的核定位水平比較

3 討論

ROS、MDA、LDH、SOD和vWF均為細(xì)胞損傷指標(biāo)［5］，其中過量的ROS是細(xì)胞損傷的重要標(biāo)志，可通過過氧化細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜上的脂質(zhì)、改變胞內(nèi)蛋白活性、參與多條細(xì)胞信號(hào)通路影響核內(nèi)DNA轉(zhuǎn)錄并進(jìn)一步引發(fā)炎癥反應(yīng)損傷細(xì)胞；MDA為線粒體內(nèi)膜上ROS與不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，可通過引發(fā)炎癥反應(yīng)、損傷線粒體等途徑損傷細(xì)胞；LDH為糖酵解酶，也是細(xì)胞重要損傷指標(biāo)之一，其含量與細(xì)胞損傷程度成正比；SOD是細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶，可通過清除超氧陰離子、減輕活性氧損害保護(hù)細(xì)胞；vWF是ITG特異性結(jié)合因子，也是血管內(nèi)皮損傷和功能障礙的標(biāo)記物［4］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著PM2.5濃度升高，HUVEC內(nèi)ROS、MDA、LDH含量顯著升高，SOD含量顯著降低，胞外vWF含量顯著升高，同時(shí)HUVEC存活率呈現(xiàn)下降趨勢、凋亡率呈上升趨勢，表明PM2.5可通過增加過氧化水平、抑制細(xì)胞抗氧化修復(fù)能力、增加細(xì)胞毒性、改變細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路并影響核內(nèi)DNA轉(zhuǎn)錄、最終激活炎癥反應(yīng)對HUVEC造成損傷。且當(dāng)PM2.5濃度達(dá)到200μg/ml后，損傷程度顯著。

ITG是細(xì)胞粘附分子家族的重要成員，是一組廣泛分布于各類細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白受體，是介導(dǎo)細(xì)胞與ECM之間相互作用的主要分子。其可影響和調(diào)控細(xì)胞的粘附遷移、增殖和凋亡，參與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響胞內(nèi)基因表達(dá)，進(jìn)而參與較多重要的生理病理過程［6］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：隨著PM2.5濃度增加，胞外vWF含量顯著上升。而vWF是ECM中的重要成員，能與ITG特異性結(jié)合，激發(fā)胞內(nèi)ITG介導(dǎo)的信號(hào)通路。研究結(jié)果表明，隨著vWF含量上升，通過ITG傳入到血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)被異常放大。

ITG將胞外信號(hào)傳入胞內(nèi)后，會(huì)促進(jìn)胞質(zhì)內(nèi)Src家族激酶活化，進(jìn)而作用并激活胞質(zhì)中小G蛋白家族中的RhoA蛋白［6］。YungBS等對于心臟損傷機(jī)制的最新研究發(fā)現(xiàn)，在心血管系統(tǒng)中，RhoA被激活后，可能會(huì)與由G蛋白調(diào)控因子活化的GTP結(jié)合，刺激PLC激活［7］。PLC是Ca2+信號(hào)通路的上游因子，可開啟鈣離子通道，促使胞內(nèi)鈣離子濃度升高，并促使細(xì)胞質(zhì)中的PKC結(jié)合到質(zhì)膜上，在鈣離子的作用下激活PKC［8］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：隨著PM2.5濃度增加，HUVEC內(nèi)PLC、PKC蛋白表達(dá)水平顯著上升。表明在PM2.5侵染下，ITG傳入信號(hào)異常放大，血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)PLC過表達(dá)并被過度激活，這一機(jī)制在血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷發(fā)展中起重要作用；并因此異常激活Ca2+信號(hào)通路，導(dǎo)致下游的PKC異常表達(dá)并激活。Chen等［9］研究發(fā)現(xiàn)，PKC與MKK4有密切聯(lián)系，激活的PKC會(huì)使胞質(zhì)內(nèi)MKK4磷酸化并激活MKK4。而MKK4是MAPK通路中的蛋白，可通過蘇氨酸和酪氨酸殘基的雙重磷酸化激活JNK和p38［10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：隨著PM2.5濃度增加，HUVEC內(nèi)MKK4、p38、JNK蛋白表達(dá)水平顯著上升。表明PKC的異常激活傳導(dǎo)至下游MKK4，并因此過度激活MAPK信號(hào)通路和下游核轉(zhuǎn)錄因子p38、JNK。本研究結(jié)果揭示：隨著PM2.5濃度增加，胞外vWF含量顯著上升，通過ITG傳入至血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)被異常放大，過度激活I(lǐng)TG介導(dǎo)的“ITG-Ca2+信號(hào)通路-MAPK信號(hào)通路”，導(dǎo)致p38和JNK被異常激活。信號(hào)傳導(dǎo)通路示意圖見圖4。

圖4 ITG-Ca2+信號(hào)通路-MAPK信號(hào)通路和ITG- FAK粘附通路

此外，ITG與ECM結(jié)合后，可在細(xì)胞膜上聚集成簇，導(dǎo)致細(xì)胞骨架重新組合形成粘著斑，磷酸化FAK的Tyr397位點(diǎn)，使其激活，從而激活FAK粘附通路［10］。在FAK粘附通路中，活化后的FAK可招募并活化信號(hào)分子P130cas和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）。一方面，激活后的P130Cas可與接頭蛋白Crk的SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合，導(dǎo)致Crk的SH3結(jié)構(gòu)域與“CrkSH3域結(jié)合鳥嘌呤核苷酸交換因子”（C3G）結(jié)合從而活化C3G；活化后的C3G使Rap1中的GDP變成GTP，導(dǎo)致Rap1構(gòu)象改變使其活化；并進(jìn)一步激活下游JNK。另一方面，PI3K是PI3K-AKT信號(hào)通路上游分子，可以通過激活PI3K-AKT通路最終激活下游分子AKT，進(jìn)而磷酸化激活I(lǐng)KK［10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著PM2.5濃度增加，F(xiàn)AK粘附通路中關(guān)鍵蛋白FAK、Crk、Rap1、JNK、AKT、IKK表達(dá)水平均顯著升高。表明PM2.5可通過增加胞外vWF含量，并通過ITG使胞內(nèi)傳入信號(hào)異常放大，過度激活I(lǐng)TG介導(dǎo)的“ITG-FAK粘附通路”，從而異常激活下游分子JNK和IKK。

p38、JNK、IKK等蛋白在炎癥反應(yīng)發(fā)生中起到重要作用，其是激活A(yù)P-1、NF-κB等核轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)鍵激酶。其中，JNK、p38能使c-Jun和c-fos磷酸化，在胞漿中組成同源或異源二聚體復(fù)合物AP-1，使其激活并入核；IKK能使IkB（NF-kB抑制分子）結(jié)構(gòu)域的Ser32/36磷酸化，加速IkB的降解，暴露出NF-kB核定位信號(hào)，激活NF-kB并使其入核；AP-1、NF-kB等核轉(zhuǎn)錄因子入核后，可調(diào)控炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄翻譯，促使炎癥因子產(chǎn)生，激發(fā)炎癥反應(yīng)［2］。蛋白實(shí)驗(yàn)顯示，隨著PM2.5濃度增加，AP-1、NF-κB表達(dá)顯著升高；核定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PM2.5作用下，AP-1、NF-κB在細(xì)胞核內(nèi)含量顯著增加、細(xì)胞質(zhì)中含量顯著減少，顯示其大量入核。表明核轉(zhuǎn)錄因子AP-1、NF-κB被異常激活并入核激發(fā)炎癥反應(yīng)。

綜上所述，PM2.5可增加血管內(nèi)皮細(xì)胞外vWF含量，并通過ITG將這一異常信號(hào)傳入到血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)部，異常激活I(lǐng)TG介導(dǎo)的ITG-Ca2+信號(hào)通路-MAPK信號(hào)通路和ITG-FAK粘附通路，活化p38、JNK、IKK等激酶，激活A(yù)P-1、NF-κB等核轉(zhuǎn)錄因子并使其入核，進(jìn)而調(diào)控各類炎癥因子產(chǎn)生，引發(fā)炎癥反應(yīng)，損傷內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)和引發(fā)各類心血管疾病。