白酒釀造過程中的微生物研究進展

梁栩煜 ，錢 敏，白衛(wèi)東*，肖更生，劉功良，俞劍燊，郭 波

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州 510225；2.上海金楓酒業(yè)股份有限公司，上海 200120；3.廣東石灣酒廠集團有限公司，廣東佛山 528031）

白酒是中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的一顆明珠。中國傳統(tǒng)白酒在中國的發(fā)展歷史上源遠流長，是采用飽含豐富淀粉質(zhì)（糖質(zhì)）的糧谷類為主要釀造原料，以曲類或者酒母等為糖化發(fā)酵劑，采取固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)釀造等形式，經(jīng)過蒸煮、發(fā)酵、蒸餾、貯存和勾調(diào)而成的蒸餾酒，已是馳名中外的蒸餾酒之一[1]。

白酒發(fā)酵的全過程均是依賴微生物的繁殖及代謝而得以進行。參與釀酒發(fā)酵的微生物不可勝舉，因在釀酒的每一個過程都有各式各樣的微生物產(chǎn)生并發(fā)揮作用，如在制曲車間所形成的微生物環(huán)境可帶給曲餅富饒的微生物、制作酒曲的過程中由曲餅自身發(fā)酵所產(chǎn)生的微生物、酒曲與原料混合并與生產(chǎn)車間所在現(xiàn)場的環(huán)境微生物結(jié)合共同產(chǎn)生的微生物等。不但有自然環(huán)境中的微生物參與其中，還有通過技術(shù)人員培育的純種且高產(chǎn)的微生物；既有產(chǎn)香菌、產(chǎn)酒菌、糖化菌等對生產(chǎn)白酒有益處的微生物，也有造成白酒產(chǎn)生不愉快氣味的的無益菌群[2]。

白酒釀造過程中微生物的種類、數(shù)量、分布及其消長變化等能直接影響酒的風(fēng)味質(zhì)量，是影響典型香型形成的重要因素[3]。因為白酒釀造的本質(zhì)是其微生物繁殖代謝的結(jié)果，研究意義顯而易見，也是科研人員一直以來重點研究白酒微生物的原因。因此，對近年來白酒釀造過程中的微生物和利用現(xiàn)代分子學(xué)技術(shù)檢測出的白酒微生物進行綜述，以從微生物的角度深入了解白酒的發(fā)酵本質(zhì)。

1 白酒釀造中的微生物

1.1 細菌

細菌（bacteria）是一類細胞細短、結(jié)構(gòu)簡單、多以二分裂方式繁殖和水生性較強的原核生物，多在溫度適宜、濕度較大和飽含有機質(zhì)的環(huán)境生存[4]。白酒生產(chǎn)過程中細菌的種類各色各樣，相對較為集中的細菌有乳酸菌、醋酸菌、芽孢桿菌等。

1.1.1 細菌在白酒釀造中的多樣性及其變化

從細菌在白酒釀造期間的菌落結(jié)構(gòu)變化上來看，細菌群落結(jié)構(gòu)在每一個階段都表現(xiàn)出一定的規(guī)律。如翟磊等[5]對宜賓產(chǎn)區(qū)濃香型白酒釀造環(huán)境中細菌的菌落結(jié)構(gòu)進行分析，實驗結(jié)果表明，窖泥中的微生物多樣性最高，大曲次之，酒醅和黃水中微生物多樣性最低；其中乳酸菌在窖泥、大曲、酒醅以及黃水中都是主要菌群；且在白酒釀造過程中微生物群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出從多種微生物共同作用轉(zhuǎn)化為功能微生物主要發(fā)揮作用的趨勢。任愛容等[6]對醬香型白酒連續(xù)七輪次的大曲和釀造環(huán)境的樣品進行研究，實驗結(jié)果表明，各輪次大曲與環(huán)境樣品中細菌的復(fù)雜性均存在差異，但其主要功能細菌菌群組成及其變化過程基本保持一致，且其中的優(yōu)勢細菌都能代謝豐富的酶系。胡小霞等[7]通過對醬香型白酒一輪次堆積和窖池發(fā)酵酒醅中的細菌菌群進行研究，實驗結(jié)果表明，前期堆積細菌的多樣性和豐富度都比窖池酒醅高；在窖池發(fā)酵期間，細菌的多樣性和豐富度呈現(xiàn)快速降低；到了窖池發(fā)酵后期，微生態(tài)即從繁雜的多菌屬生態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)展到以單一的乳酸桿菌屬（Lactobacillus）為主導(dǎo)的生態(tài)結(jié)構(gòu)。胡小霞等[8]對清醬香型白酒陶壇發(fā)酵過程中酒醅的細菌群落進行研究。實驗結(jié)果表明，清醬香型白酒的關(guān)鍵細菌群落結(jié)構(gòu)同時擁有清香型和醬香型白酒關(guān)鍵細菌群落結(jié)構(gòu)的特點。在發(fā)酵旺盛時，因存在協(xié)同與競爭關(guān)系，雖約1/5的主要細菌屬濃度顯著降低，但約3/4顯著升高；在發(fā)酵后期，主要細菌屬的群落組成基本不變，其相對豐度都＜25.97%。且平均81.12%的主要細菌屬之間呈顯著正相關(guān)，18.88%的呈負相關(guān)。

1.1.2 細菌對白酒風(fēng)味物質(zhì)的作用

細菌在酒曲培制和白酒釀造中扮演著重要的角色，其代謝產(chǎn)物對白酒的香型和風(fēng)味具有特殊作用，所以在釀酒過程中適當引入細菌不僅可積累一些香味物質(zhì)或香味前體物質(zhì)以達到增香效果[9]，還能克服白酒后味不足的缺點。如徐巖[10]就細菌與香味前體物質(zhì)之間的關(guān)系作了深入研究，發(fā)現(xiàn)茅臺酒吡嗪類化合物中濃度最高的是四甲基吡嗪，高達1.6～2.0 mg/L，并通過白酒生產(chǎn)工廠的實踐確認其可提高茅臺酒在空杯中的酒香味更為持久的特點。因枯草芽孢桿菌可高產(chǎn)四甲基吡嗪，且醬香大曲中重要的產(chǎn)酶細菌包括蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等[11]，其中枯草芽孢桿菌的蛋白酶活力極強，故推斷其特性對產(chǎn)出四甲基吡嗪的作用巨大。

從白酒風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生的影響上來看，細菌的作用對白酒生產(chǎn)舉足輕重，比如能夠顯著提高發(fā)酵液的蛋白酶活力、氨態(tài)氮濃度和酯化能力的功能性細菌群[12]。以醬香型已制成的酒曲為例，大曲里絕大部分的微生物都為細菌，數(shù)量高達107個/g曲[11]，因此此曲又被稱為“細菌曲”[13]。如瀘州老窖在制作大曲期間有著不勝枚舉的細菌參與其中，多數(shù)為芽孢桿菌屬、醋桿菌屬等[14]。經(jīng)研究證明[15]，芽孢桿菌是醬香型白酒中形成成百上千種風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)鍵功能細菌，其能夠代謝復(fù)雜多樣的酶系，如蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等，其能分解薯類、大米、高粱等用于釀酒的原輔料，分解后形成各種各樣的氨基酸、糖類等物質(zhì)，進而經(jīng)過繼續(xù)發(fā)酵所產(chǎn)生的一連串生物化學(xué)變化而形成具有獨特風(fēng)味的的芳香類化合物。另據(jù)研究發(fā)現(xiàn)[16-17]，醬香高溫大曲制曲過程中各式各樣的游離氨基酸能夠形成美拉德反應(yīng)，極力推動了醬香這種別具一格的風(fēng)味產(chǎn)生，關(guān)鍵是芽孢桿菌促使了這一反應(yīng)的進行。

1.2 酵母菌

酵母菌是一種單細胞真菌，被歸類為兼性厭氧微生物，能發(fā)酵糖類產(chǎn)生酒精，多數(shù)在糖濃度高且較為酸性的條件下生存[4]。在制曲時，生產(chǎn)工具是被酵母菌加進到酒曲里所利用的其中一種介質(zhì)，酵母菌再經(jīng)過連續(xù)繁殖，形成整個發(fā)酵過程內(nèi)關(guān)鍵的功能微生物之一[18]。

1.2.1 酵母菌在白酒釀造中的機理

酵母菌本身含有豐富蛋白質(zhì)，尤其是含有13種酶系統(tǒng)，生物活性物質(zhì)如氧化還原酶的輔酶煙酰胺類、脫羧酶的輔酶（coenzyme A，CoA）、還原型的谷胱甘肽和核糖核酸酶等[19]；另外，酵母菌在缺氧環(huán)境時根據(jù)糖酵解途徑，將糖經(jīng)過一連串的酶催化后生成丙酮酸，在同一環(huán)境下，丙酮酸經(jīng)乙醛脫氫酶和乙醇脫氫酶轉(zhuǎn)化成乙醇。白酒釀造期間，釀酒主輔料被酵母菌分泌的胞外酶分解，經(jīng)過一連串的酶催化和產(chǎn)物間的復(fù)雜變化，從而形成香、純、厚等各種風(fēng)味的酒體。

1.2.2 酵母菌在白酒釀造中的作用

酵母菌在白酒發(fā)酵過程中擔(dān)任酒化與酯化的角色[20]，釀酒酵母主要起產(chǎn)酒精作用，具有強的產(chǎn)酒精能力[21]。研究表明，在白酒發(fā)酵期間存在各式各樣的酵母相互影響，其中釀酒酵母是優(yōu)勢酵母[22]。其他大部分屬于產(chǎn)酯酵母，雖然其產(chǎn)酒精量比較少，但白酒在發(fā)酵期間能夠?qū)Ⅴ惨褐械募Z谷類轉(zhuǎn)化為醛、酯、高級醇等[23]，即酯化酸類、醇類等物質(zhì)，并形成以乙酸乙酯為主要酯類的風(fēng)味物質(zhì)，這種作用在醬香型白酒釀造中使得醬香白酒的質(zhì)量得以提高[24]。

1.2.3 酵母菌在白酒釀造中的應(yīng)用

在白酒釀造期間，通過調(diào)控各階段釀酒酵母數(shù)量的變化，則能控制酒精的產(chǎn)出進而提高白酒的質(zhì)量，因此可體現(xiàn)出酵母菌在厭氧發(fā)酵這一過程舉足輕重。如產(chǎn)酯、產(chǎn)膜酵母在白酒發(fā)酵時因其喜于有氧特性，代謝過程產(chǎn)生豐富酯質(zhì)，是釀制白酒產(chǎn)酯香的重要菌種[25]。釀酒酵母和非釀酒酵母常同時用于白酒的釀造，如將異常畢赤酵母和釀酒酵母按比例混合加入其中，不但能夠確保白酒的出酒率，更能明顯提高白酒風(fēng)味物質(zhì)的含量，其中乙酸乙酯含量的提高尤為突出[26]。

研究技術(shù)人員已經(jīng)從酒曲餅和發(fā)酵液中分離并純化出各式各樣種屬的酵母，包括有釀酒酵母屬、畢赤酵母屬、漢遜酵母屬等[27]。WU Q等[28]就酵母菌在茅臺酒釀造過程中生長繁殖及其代謝的研究發(fā)現(xiàn)，種類豐富的酵母存在于茅臺酒發(fā)酵液中，且在整個發(fā)酵期間釀酒酵母一直活躍于其中，屬于優(yōu)勢酵母。馬榮山等[29]從醬香型白酒發(fā)酵液中篩選出7株酵母菌，通過制曲篩選出5株具有高酶活性和高發(fā)酵性的酵母菌，將其作為酒曲發(fā)酵菌種，用此酒曲來釀造的酒其醬香味獨特，口感柔潤細膩，回味持久，醬香格調(diào)別具一格。將醬香型醪糟中的優(yōu)勢酵母都投入到實際生產(chǎn)中，產(chǎn)出酒的醇甜味比標準酒樣顯著[30]。

1.3 霉菌

霉菌常見于周圍自然環(huán)境，其菌絲體由兩部分菌絲組成且較為旺盛，孢子具有較強抗逆性的真菌類型，菌落較蓬散干燥且菌絲體發(fā)達，因此其生長繁殖能力較高[4]。

1.3.1 霉菌在白酒釀造中的機理

在白酒釀造過程中分離出的主要真菌除酵母菌外，便是霉菌；其糖化力可以把某些含有淀粉的原料分解成還原糖并被微生物利用。此外，霉菌的液化力和酯化力也大力促進發(fā)酵液中淀粉、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的分解與轉(zhuǎn)化，使得整個發(fā)酵過程中的糖類及氨基酸濃度上漲，不僅能為發(fā)酵體系內(nèi)的微生物代謝供應(yīng)營養(yǎng)，更為白酒可產(chǎn)生獨特的風(fēng)味提供保障[31-32]。

1.3.2 霉菌在白酒釀造中的作用及其變化

霉菌會通過不斷地生長繁殖代謝等途徑產(chǎn)生對白酒香氣成分有影響的物質(zhì)，如根霉菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物具有甜味。目前霉菌多被利用在小曲酒的釀造，如吳雪梅[33]對豉香型白酒酒曲微生物進行研究，檢測到一級種均以毛霉為主，米根霉其次。餅丸則均以米根霉為主，華根霉或毛霉其次。酒餅多以米根霉為主，華根霉較多，有時甚至占優(yōu)勢，毛霉占1/5～1/3，各霉菌比例較均衡。在白酒發(fā)酵期間，黑曲霉通過消耗有機酸來調(diào)節(jié)酒醅中微生物的數(shù)量及其多樣性。同時，它分泌大量的生物酶及其代謝產(chǎn)物都有很高的酯化力，使得白酒風(fēng)味飽滿從而提升酒的質(zhì)量[34]。另外，黑曲霉在酒曲表面發(fā)酵期間能分泌許多糖化和液化酶，其強糖化力可以將淀粉水解生成葡萄糖并供酵母菌直接利用[35]。霉菌的類別、數(shù)目和生長情況等對白酒釀造過程及其成品的影響尤為重要，特別是對發(fā)酵有著徑直效力的功能菌群，對白酒香型、產(chǎn)量和品質(zhì)都產(chǎn)生直接的影響[36]。

1.3.3 霉菌在白酒釀造中的應(yīng)用

酒曲含有豐富多樣的霉菌，如曲霉（Aspergillus）、根霉（Rhizopus）、毛霉（Mucor）、紅曲霉（Monascus）等。不計其數(shù)的霉菌附著在酒曲上并快速生長形成孢子，因其抗逆性較強且能在溫濕度較高的條件下生長代謝，并產(chǎn)生能分解釀酒原料中蛋白質(zhì)等物質(zhì)的各樣水解酶類，從根本上提高白酒的質(zhì)量。如黃丹等[37]從瀘州老窖酒曲中篩選并純化獲得高產(chǎn)酯化酶的根霉菌，其細胞內(nèi)酶活性達7.91 U/mL。根霉菌在酒曲培養(yǎng)期間可以轉(zhuǎn)化出一連串酯類、醛類等風(fēng)味成分，個別根霉可以產(chǎn)生乳酸，因此根霉菌在白酒釀造期間大大影響著其乳酸含量和酸度平衡[38]，則說明霉菌在酒曲中的種類、數(shù)量對酒曲質(zhì)量和白酒的風(fēng)味品質(zhì)，起著決定性的影響[39]。

因白酒釀造過程中微生物菌落呈現(xiàn)復(fù)雜多樣性，而釀酒經(jīng)過體系內(nèi)各種微生物的相互作用，對白酒的品質(zhì)和產(chǎn)量都有至關(guān)重要的影響。隨著對白酒生產(chǎn)中微生物的深入研究，其主要微生物正漸漸被揭示。

2 利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)揭示白酒釀造微生物

在科學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展的今天，現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展飛快，因其能夠快速精確檢測等特性遂逐漸取代傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)技術(shù)，現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用為白酒釀造微生物菌群的深入探究提供了重要的研究方向。

2.1 白酒釀造中優(yōu)勢菌群的分析

翟平平等[40]通過聚合酶鏈式反應(yīng)-限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）技術(shù)研究白酒小曲細菌的復(fù)雜性，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小曲細菌類別遠低于大曲，其大部分細菌類別為黃單胞菌屬、片球菌屬以及乳桿菌屬等，其中以戊糖片球菌為主的乳酸菌屬于優(yōu)勢種群。董士偉[41]通過PCR擴增16S rDNA技術(shù)對從豉香型白酒酒曲中篩選出的高產(chǎn)四甲基吡嗪菌株進行了測序并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確認此菌株為枯草芽孢桿菌，且為優(yōu)勢細菌。LI X R等[22]基于核糖體高通量測序分析汾酒釀造期間的優(yōu)勢菌群，結(jié)果表明汾酒在釀造過程中大部分細菌是乳桿菌科，真菌中大部分是酵母科和復(fù)膜孢酵母科。謝國排等[42]利用嗜熱細菌產(chǎn)芽孢與蛋白酶的特性，通過高溫作育、熱處理等技術(shù)手段，從金種子濃香型大曲中分離出6株產(chǎn)蛋白酶的嗜熱細菌，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）分析其單菌種液體發(fā)酵中的香氣組成，發(fā)現(xiàn)6株菌株都檢測到酯類、芳香族化合物、酚類等風(fēng)味物質(zhì)且其含量各異。劉效毅等[43]利用傳統(tǒng)的分離方法和分子生物學(xué)相結(jié)合，分析醬香型高溫大曲中微生物的復(fù)雜性，鑒定出的147株微生物中，細菌約占2/3，霉菌約占1/3，細菌和霉菌均分離出12個種類，芽孢桿菌屬為細菌的優(yōu)勢菌群；體現(xiàn)出酒曲中菌群的復(fù)雜性。LI Z M等[44]研究表明，地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌是釀酒大曲中具備較高α-淀粉酶、葡糖糖化酶活性的優(yōu)勢菌群。

2.2 白酒釀造中微生物菌群多樣性的分析

利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對白酒釀造過程中的微生物進行分析，大部分從對其鑒定、微生物檢測及其群落結(jié)構(gòu)分析方面著手，其中對菌群的分析較多。黃治國等[45]通過聚合酶鏈式反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術(shù)檢測區(qū)域差異對醬香型酒醅細菌群落的影響，實驗結(jié)果顯示，不同細菌群間存在協(xié)同或此消彼長的關(guān)系，因釀造環(huán)境、溫濕度、操作流程等差異，使得酒醅細菌群落多樣性較大和相似性偏低。潘勤春等[46]通過PCR-DGGE手段分析汾酒酒曲的細菌群落組成，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)了5個不可培養(yǎng)的細菌類別，拓寬了酒曲微生物物種數(shù)據(jù)庫，并表明汾酒大曲中的細菌大部分為芽孢桿菌。高亦豹等[47]同樣通過PCR-DGGE圖譜手段分析高溫和中溫大曲細菌群落組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同釀酒工藝的大曲細菌群落組成具有顯著差異，并檢測出傳統(tǒng)方法暫時不可培養(yǎng)鑒定的細菌種屬。張會敏等[48]通過16S rDNA克隆文庫的技術(shù)，檢測古井貢酒高溫大曲細菌群落結(jié)構(gòu)及其多樣性，并通過分子鑒定確定大曲中主要細菌菌落組成比例，并研究了其相應(yīng)的進化鏈。陳玲等[49]通過結(jié)合16S rDNA克隆文庫法和高通量測序法，對大曲中細菌群落的組成及豐度進行了分析，結(jié)果表明通過兩種方法分析得出大曲中主要微生物的種類和數(shù)量比例相近，特別是其優(yōu)勢微生物群落基本一致。

3 結(jié)論與展望

盡管現(xiàn)在在白酒微生物方面的研究大多是針對某些功能菌株的探究，但對微生物的類型、生長繁殖狀況、彼此作用原理等研究有待深入，對微生物在白酒發(fā)酵中的共生或競爭等關(guān)系的探究更為重要；另外，白酒因有各自的特征風(fēng)味從而形成不同的風(fēng)格和香型，而微生物發(fā)酵則是形成白酒風(fēng)味非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，但目前對微生物如何產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)等的研究卻鳳毛麟角，因此，未來白酒微生物的研究必須克難攻堅，著重研究并解析二者的關(guān)系，此舉對白酒的研究領(lǐng)域必然貢獻巨大。總之，若要真正的弄清楚白酒發(fā)酵的本質(zhì)，還需結(jié)合利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)深入研究白酒發(fā)酵過程中微生物的各種變化，揭示白酒發(fā)酵過程中微生物多樣性的變化規(guī)律及其代謝產(chǎn)物與風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)系，這將對白酒生產(chǎn)實踐意義非凡。