• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    2 株真菌的鑒定及對禾谷孢囊線蟲的防治效果

    2020-01-18 03:40:44陳秀菊堅晉卓李惠霞李瑞盧智琴
    華南農(nóng)業(yè)大學學報 2020年1期
    關鍵詞:禾谷生防菌孢囊

    陳秀菊,堅晉卓,李惠霞,李瑞,盧智琴

    (甘肅農(nóng)業(yè)大學植物保護學院/甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室,甘肅 蘭州730070)

    禾谷孢囊線蟲Heteroderaavenae是重要的病原線蟲,其寄主包括小麥屬、大麥屬等32個屬60余種禾本科作物和紫羊茅等多種雜草,嚴重影響小麥、燕麥、大麥、裸大麥等作物生產(chǎn)[1]。禾谷孢囊線蟲病在全球多個國家均有發(fā)生和為害[2],一般患病麥田可減產(chǎn)20%~30%[3],嚴重時可使小麥減產(chǎn)50%~90%[4]。1989年,該病在我國湖北首次被公開報道,隨后在北京、河南、河北、山西、陜西、內(nèi)蒙古、甘肅等地相繼被發(fā)現(xiàn)[1,5-8]。侵染麥類的孢囊線蟲有禾谷孢囊線蟲H.avenue、菲利普孢囊線蟲H.filipjevi、麥類孢囊線蟲H.latipons、雙膜孔孢囊線蟲H.bifenestra和稀少孢囊線蟲H.mani等。目前,我國報道的種主要為H.avenae和H.filipjevi[9]。作為我國小麥種植大省,甘肅省小麥常年種植面積超過90萬hm2,受到禾谷孢囊線蟲的嚴重侵害。李惠霞等[10]調(diào)查結果顯示,甘肅省禾谷孢囊檢出率超過47.9%,2/3以上的鄉(xiāng)鎮(zhèn)有孢囊線蟲分布,全省約44.2萬hm2小麥受禾谷孢囊線蟲病為害。

    禾谷孢囊線蟲病主要通過土壤傳播,可通過農(nóng)事操作、農(nóng)業(yè)機械、人、畜、水流等途徑近距離傳播,也可經(jīng)暴雨、洪水、運輸車輛等途徑遠距離傳播[11-12]。由于線蟲及其寄主地理分布非常廣泛,寄主種類繁多,易于傳播擴散,化學防治存在成本高、毒性大、易殘留、破壞土壤生態(tài)、污染水源、線蟲易產(chǎn)生抗藥性等一系列弊端,生物防治因以下優(yōu)點而備受關注,選擇性強、對人及家畜無毒無害;利用可再生資源,低碳環(huán)保;對環(huán)境友好,對生態(tài)環(huán)境影響較小,易被植物、土壤微生物和陽光降解[13]。

    在線蟲病害生物防治方面研究較多的有厚垣普可尼亞菌Pochoniachlamydosporia、少孢節(jié)叢孢Arthrobotrysoligospora[14]、球孢白僵菌Beauveria bassiana[15]和淡紫紫孢菌Purpureocillium lilacinum[16]等真菌,其中淡紫紫孢菌和厚垣普可尼亞菌已經(jīng)商品化,并廣泛使用[17-18]。目前,用于植物線蟲的生防細菌有蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis[19]、堅強芽孢桿菌Bacillus firmus[20]和枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis[21]等。為了進一步拓展禾谷孢囊線蟲病的生防菌資源,本研究擬對前期篩選得到的2株真菌的殺線蟲活性進行離體活性測定和盆栽試驗,以期為禾谷孢囊線蟲病生防菌的利用提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    禾谷孢囊線蟲采自甘肅省永登縣受禾谷孢囊線蟲侵染的麥田。

    供試菌株A 1和B1由甘肅農(nóng)業(yè)大學植物線蟲學實驗室前期分離和保存。

    1.2 方法

    1.2.1 形態(tài)學鑒定挑取待測真菌菌絲于PDA 培養(yǎng)基上,在25℃條件下培養(yǎng)7 d 后,觀察菌株生長速度、菌落顏色及表面特征等,在顯微鏡下觀察菌絲、孢子,記錄菌株的形態(tài)特征。

    1.2.2 分子生物學鑒定 按照生工真菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取真菌基因組DNA,?20℃保存?zhèn)溆?。采用通用引物ITS1(5′-CTTGGTCAT TTAGAGGGAAGTAA-3′)和ITS4(5′-TCCT CCUCTTATTUATATUC-3′)進行PCR 擴增。擴增產(chǎn)物送上海生物工程有限公司測序,在NCBI數(shù)據(jù)庫上通過BLAST 比對分析,用MEGA 6.0中的UPGAM法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

    1.2.3 禾谷孢囊線蟲的采集選擇甘肅省永登縣禾谷孢囊線蟲發(fā)生較嚴重的田地,用Z字形取樣法采集土樣,去除表層干土,取0~20 cm 層的土壤,將多點土樣混合后裝入封口塑料袋中,帶回實驗室。用漂浮法分離孢囊,在解剖鏡下觀察,挑取飽滿的棕色孢囊,于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.4 卵和2齡幼蟲懸浮液的制備挑取飽滿的棕色孢囊,加入5 g·L?1NaC lO溶液,表面消毒3m in,滅菌水多次清洗后,用橡皮塞磨破孢囊后,將卵懸浮液倒入200目和500目組合篩,用無菌水沖洗,收集卵懸浮液,將卵懸浮液濃度調(diào)整為1 000mL?1。

    4℃冰箱處理6~8周的禾谷孢囊線蟲,用5 g·L?1NaClO溶液表面消毒3 m in,滅菌水清洗3~5次后,置于100目網(wǎng)篩上。將網(wǎng)篩置于滅菌培養(yǎng)皿里,加滅菌水至浸沒孢囊,15℃黑暗條件下孵化。4 d 后開始收集2齡幼蟲,并配置成濃度為1 000 mL?1的線蟲懸浮液。

    1.2.5 真菌孢子懸浮液的制備取在PDA 平板上培養(yǎng)7 d 的菌株,加入1滴吐溫80和2.5mL 無菌水沖洗,使其分生孢子脫落,得到分生孢子懸浮液,用血球計數(shù)板計數(shù),調(diào)整濃度為1×107CFU·mL?1備用。

    1.2.6 發(fā)酵液的制備 將2mL 1×107CFU·mL?1的分生孢子懸浮液接種在100 mL PD 培養(yǎng)液中(150 mL三角瓶),26℃,150 r·m in?1振蕩培養(yǎng)120 h。10 000 r·m in?110m in,用0.22 μm 細菌過濾器過濾。經(jīng)上述處理后的懸浮液作為發(fā)酵原液,同時用滅菌水制備5倍和10倍發(fā)酵液,并測定發(fā)酵液的pH。

    1.2.7 生防菌對禾谷孢囊線蟲孢囊的寄生作用將分離出的生防菌株轉移至PDA 培養(yǎng)基上,等菌落直徑長至培養(yǎng)皿1/2時,將消毒后的孢囊放入菌落邊緣,每皿10個孢囊。培養(yǎng)7 d 后,將孢囊移出培養(yǎng)皿,5 g·L?1NaClO溶液表面消毒3m in,每個孢囊單獨置于經(jīng)滅菌的濾紙片上,加滅菌水保濕培養(yǎng),6 d 后觀察菌株對孢囊的寄生作用。

    1.2.8 真菌發(fā)酵液對卵孵化的影響分別吸取100 μL生防菌原液(1倍)、5倍、10倍發(fā)酵液,加入到滅菌的96孔細胞培養(yǎng)板中,然后向每個孔中分別加入200μL卵懸浮液。每個濃度重復3次,以空白培養(yǎng)基濾液為對照。試驗在15℃條件下,每隔2 d 在顯微鏡下觀察1次。12 d 后鏡檢、記錄各菌株發(fā)酵液對卵孵化的影響,統(tǒng)計相對抑制率。

    1.2.9 真菌發(fā)酵液對J2的致死作用分別吸取100μL生防菌1倍、5倍、10倍發(fā)酵液,加入無菌96孔細胞培養(yǎng)板中,每個濃度重復3次,然后向每個孔中分別加入200μL 2齡幼蟲懸浮液。試驗在15℃條件下進行,以培養(yǎng)基濾液為空白對照,每個處理重復3次。分別在24、48和72 h 鏡檢各處理中線蟲的死亡情況,用NaOH 法測定線蟲的死活,并計算死亡率和校正死亡率。

    1.2.10 室內(nèi)防效測定從禾谷孢囊線蟲病田采集土樣,過篩使每100 g 土含20個孢囊,然后將病土裝入直徑21 cm 的花盆,每盆約1 500 g 土。

    制備麥麩培養(yǎng)基,高溫滅菌(121℃,30m in),接菌后28℃條件下培養(yǎng)7 d。以1%、2%和3%的比例將其與病土混勻,裝入盆中,挑選飽滿的寧春50號種子播種,每盆13粒,每處理4盆,以不接生防真菌的病土為對照。

    播種10 d 后調(diào)查出苗率,90 d 后調(diào)查發(fā)病情況,將植株從盆中取出,盡可能保持根系完整。將植株根系用自來水沖洗干凈,放在盛有清水的塑料盤中調(diào)查病情,記錄土中孢囊量,計算孢囊減少率,并測量小麥的根長和株高。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    用Excel2003進行數(shù)據(jù)處理和表格繪制,并采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析,用最小顯著差異法進行多重比較。

    2 結果與分析

    2.1 菌株的形態(tài)學鑒定

    A1菌株在PDA 培養(yǎng)基25℃條件下培養(yǎng)7 d,菌落直徑為3.2~4.5 cm,菌落中央淡黃色至深綠色,邊緣白色,有放射狀溝紋(圖1a)。菌落背面奶油色至淡褐色(圖1b),產(chǎn)生大量分生孢子。分生孢子球形或近球形,長4.0~6.5μm,寬4.5~6.0μm ,一部分菌絲形成長而粗糙的分生孢子梗,頂端產(chǎn)生燒瓶形頂囊,表面著生許多小梗,小梗上產(chǎn)生成串的分生孢子(圖1c)。初步鑒定為曲霉屬Aspergillus真菌(注:A1的鑒定已發(fā)表于大豆科學)。

    圖1 菌株A1(a~c)、B1(d~f)的培養(yǎng)性狀及形態(tài)特征Fig.1 Cultural characteristics and morphologies of strain A1(a?c)and B1(d?f)

    B1菌株在PDA 培養(yǎng)基上,菌落初期白色呈氈狀,后期變?yōu)闇\綠色,致密地平鋪在培養(yǎng)基平板上(圖1d),背面黃綠色或金黃色(圖1e),孢子聚生成頭狀。瓶梗細胞單生或2~5個輪生。分生孢子橢球形,長2.0~4.0μm,寬2.5~3.8μm,壁光滑(圖1f),初步鑒定為木霉屬Trichoderma真菌。

    2.2 菌株的分子學鑒定

    菌株A 1和B1的ITS片段長度分別為594和652 bp,GenBank 登錄號分別為MH 937578.1和MH 937579.1。序列經(jīng)BLAST比對分析,用MEGA 6.0中的UPGMA 法構建系統(tǒng)發(fā)育樹,由圖2a 可知,在親緣關系上,A1與登錄號為JF 412785.1、HQ 340102.1、AY 373859.1、MG 662404.1的寄生曲霉聚為一支,序列相似性為99%,故將其鑒定為寄生曲霉Aspergillus parasiticus。由圖2b可知,在親緣關系上,B1與登錄號為KU 375460.1的長枝木霉親緣關系最近,序列相似性為99%,故將其鑒定為長枝木霉Trichodermalongilbrachiatum。

    圖2 菌株A1和B1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic trees of strain A 1 and B1

    2.3 生防菌對孢囊的寄生作用

    從圖3可以看出,菌株A1和B1對禾谷孢囊的寄生率隨侵染時間的增加呈直線上升趨勢。在處理后第6天,菌株A 1和B 1的寄生率均在24.00%以上。在處理后第10天,菌株A 1和B1的寄生率均在45.00%以上。菌株A1和B1寄生率上升幅度相近,均在第14天達到80.00%以上,寄生率分別是90.00%和83.33%。菌株A 1在6~14 d,寄生率均略高于B1。

    圖3 不同浸染時間A1、B1分生孢子懸浮液對禾谷孢囊線蟲的寄生率Fig.3 Parasitic rates of A1 and B1 conidia suspensions to cereal cyst nematode at different time of infection

    2.4 生防菌發(fā)酵液對線蟲卵孵化的抑制作用

    A 1、B1真菌1倍、5倍、10倍稀釋發(fā)酵液對卵孵化抑制作用測定結果表明,A1和B1各稀釋倍數(shù)發(fā)酵液對卵孵化抑制率均在45.00%以上。隨著發(fā)酵液稀釋倍數(shù)增加,J2孵化數(shù)量呈逐漸增加的趨勢。從圖4可知,發(fā)酵液濃度對卵孵化有顯著影響(P<0.01,F(xiàn)=9.71)。發(fā)酵液處理12 d后,A1的1倍發(fā)酵液對卵孵化的抑制率為63.98%,1倍和5倍稀釋液對卵的抑制率差異不顯著(P>0.05),但均顯著高于10倍(P<0.05)(圖4a)。B1的1倍發(fā)酵液對卵孵化的抑制率為67.56%,且顯著高于5倍、10倍稀釋液(P<0.05)(圖4b)。

    2.5 生防菌發(fā)酵液對J2的致死作用

    隨著A1、B1真菌發(fā)酵液稀釋倍數(shù)的增加,2齡幼蟲的死亡率總體呈減小的趨勢。隨著處理時間的延長,同一濃度發(fā)酵液的校正死亡率呈顯著增強趨勢,具體結果見表1。

    圖4 真菌發(fā)酵液對禾谷孢囊線蟲卵孵化的影響Fig.4 Effectsof fungal fermentation broth on egg hatching of cereal cyst nematode

    表1 真菌發(fā)酵液對禾谷孢囊線蟲2齡幼蟲的致死作用Table 1 Lethal effectsof fungal fermentation broth on the second-stage juveniles of cereal cyst nematode

    經(jīng)菌株A1和B1的發(fā)酵液處理后,死亡線蟲數(shù)顯著多于對照組(P<0.05),說明這3種發(fā)酵液均對線蟲有致死作用。菌株A1發(fā)酵液處理24、48、72 h后線蟲校正死亡率為16.00%以上,A1的1倍稀釋液在7 2 h 對2齡幼蟲的校正死亡率較高為68.14%。菌株B1發(fā)酵液處理24、48、72 h 后線蟲校正死亡率為35.00%以上,B1的1倍稀釋液在72 h對2齡幼蟲的校正死亡率最高為92.98%,顯著高于5倍、10倍(P<0.05)。在相同處理時間和發(fā)酵液稀釋倍數(shù)下,菌株B1 校正死亡率均大幅高于菌株A1。

    2.6 生防菌菌肥室內(nèi)防治禾谷孢囊線蟲的效果

    室內(nèi)盆栽試驗表明,隨著生防菌菌肥量的增大,孢囊減少率持續(xù)增多。由表2可知,A 1的3%菌肥處理后,孢囊減少率為31.71%,顯著高于1%和2%菌肥處理(P<0.05)。小麥根長增加28.82%,株高增加20.38%。B1的3%菌肥處理后,孢囊減少率36.04%,顯著高于1%和2%菌肥處理(P<0.05)。小麥根長增加59.62%,株高增加21.43%。

    表2 真菌對禾谷孢囊線蟲病室內(nèi)防治效果測定Table 2 Control efficienciesof the fungi on cereal cyst nematode in indoor pots

    3 討論與結論

    寄生曲霉屬于半知菌亞門絲孢菌綱絲孢目從梗孢科[22],其廣泛存在于土壤、灰塵和植物上。目前研究集中于寄生曲霉的種類鑒定和對甘蔗綿蚜、吹綿蚧等害蟲的生物防治方面[23-25],鮮見寄生曲霉對其他植物寄生線蟲有生防作用的報道。長枝木霉生長速度快、產(chǎn)孢量大、對植物病原菌有一定的拮抗作用,可作為農(nóng)業(yè)上重要的生防菌株[25],目前研究集中于其對南方根結線蟲的防治及其根際定殖作用[26]、對禾谷孢囊線蟲的寄生和致死作用[27],但長枝木霉對禾谷孢囊線蟲的盆栽防效試驗的報道甚少。

    生物農(nóng)藥源于自然,具有作用譜廣、對生態(tài)環(huán)境影響小、對人畜低毒等特點[28-29],篩選細菌、真菌等微生物來防治植物病原線蟲,對生態(tài)環(huán)境保護具有重要的意義。本研究篩選的具有殺線蟲活性的菌株A1 和B1,經(jīng)鑒定分別為寄生曲霉Aspergillus parasiticus和長枝木霉Trichodermalongibrachiatum,均對禾谷孢囊具有良好的寄生性,分別在第6天、第10天后,寄生率超過50.00%,侵染2周左右禾谷孢囊寄生率達80.00%以上,這與遲君道等[30]報道的結果基本一致。

    卵孵化試驗中,隨著菌株A1和B1發(fā)酵液稀釋濃度的增大,這2 株菌的卵孵化率相應增大。菌株A1和B1的1倍稀釋液pH 分別為4.27和5.72,菌株A1和B1的1倍稀釋液抑制卵孵化效果均好于5倍和10倍稀釋液。這可能與發(fā)酵液pH 有關,pH 可影響發(fā)酵液中殺線蟲物質(zhì)的活性,還可以直接影響卵的孵化[31]。

    菌株A 1和B1不同濃度發(fā)酵液對禾谷孢囊線蟲2齡幼蟲具有一定的毒殺作用,隨著菌株發(fā)酵液濃度的升高,2齡幼蟲死亡率也相應增高,并且隨著處理時間的延長呈上升趨勢。該結果和梁晨等[32]報道的研究結果基本一致。發(fā)酵液對線蟲作用的效果與殺線蟲活性物質(zhì)成分的濃度和線蟲裸露程度有關,呈現(xiàn)出濃度越低、線蟲死亡率越低的規(guī)律[33]。趙迪[34]發(fā)現(xiàn)菌株Snef 5的殺線蟲活性物質(zhì)是一種強極性、弱酸性的水溶性抗生素。李玲玉等[35]發(fā)現(xiàn)放線菌Snea253代謝產(chǎn)物中氨基糖類物質(zhì)對線蟲有毒性。Niu 等[36]從細菌Bacillusnematocidal中分離純化出對線蟲有毒性作用的絲氨酸蛋白酶,能夠很大程度上破壞線蟲表皮并水解膠原蛋白和凝膠,從而使線蟲死亡。劉霆等[37]研究發(fā)現(xiàn),真菌Snf 907代謝物,在原液、5×、10×、20×稀釋濃度下,對大豆孢囊線蟲2齡幼蟲的校正死亡率分別是96.33%、83.18%、63.15%和47.04%,這與本試驗結果A 1和B1在發(fā)酵液原液處理下,對2齡幼蟲最高的校正死亡率分別為68.14%和92.98%相比存在差異。這可能與菌株種類、產(chǎn)生的活性物質(zhì)類型、作用對象、對線蟲的作用機理有關[37]。各類真菌的代謝產(chǎn)物不同,殺線蟲的活性物質(zhì)也不相同,不同的孢囊線蟲寄生真菌有其獨特作用機理[38]。

    盆栽試驗結果表明,菌株A 1、B1的生物菌肥均能顯著減少土壤中的禾谷孢囊線蟲的孢囊數(shù)量,對小麥植株根長和株高有不同程度的影響。2種菌肥可使小麥株高增加、根長增長。適量菌肥處理可顯著促進小麥根的生長,與對照相比,2種真菌3%(w)處理組小麥根長均增加3 cm 以上。除B1 1%(w)菌肥處理除外,不同濃度的2種菌肥均有效促進了小麥株高增加,這與Zhang 等[20]的研究結果一致,但本試驗中2株生防菌3%(w)菌肥處理后的孢囊減少率低于其6%(w)的菌劑處理,可能是由于生物菌肥中加入的生物菌種和劑量不同所致。

    本研究表明菌株A1和B1在防治禾谷孢囊線蟲上有較好的應用前景,且B1的生防效果略優(yōu)于A1。對于這2株生防菌的殺線蟲活性物質(zhì)成分、對線蟲的作用機理等有待進一步深入的研究。

    猜你喜歡
    禾谷生防菌孢囊
    稻草人言
    遼河(2024年1期)2024-03-04 06:06:13
    人間好個秋
    福建福寧灣表層沉積物中甲藻孢囊分布與多樣性研究*
    海洋與湖沼(2022年6期)2022-11-25 05:29:56
    浙江象山港表層沉積物中甲藻孢囊多樣性與分布研究
    新型生防菌組合防治煙草青枯病田間藥效評價
    漢字對對碰(四)
    郁南平臺鎮(zhèn)歡慶禾谷誕
    源流(2018年7期)2018-12-03 13:26:38
    朝鮮孢囊線蟲——浙江省孢囊線蟲新記錄種
    基于羥基自由基高級氧化快速殺滅錐狀斯氏藻孢囊的研究
    海洋學報(2017年4期)2017-04-13 05:17:04
    玉米莖腐病生防菌的篩選鑒定及最佳培養(yǎng)條件研究
    秋霞伦理黄片| 人妻一区二区av| 免费av不卡在线播放| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 男女啪啪激烈高潮av片| 精品少妇黑人巨大在线播放| 韩国av在线不卡| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 精品国内亚洲2022精品成人| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 天天一区二区日本电影三级| 国产成人精品久久久久久| 日本午夜av视频| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 色吧在线观看| 丰满乱子伦码专区| 一个人免费在线观看电影| 在线观看免费高清a一片| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产精品熟女久久久久浪| 简卡轻食公司| 色视频www国产| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲在线观看片| 国产av码专区亚洲av| 精品久久久久久电影网| 婷婷色综合www| 精品人妻一区二区三区麻豆| 永久网站在线| 国产精品日韩av在线免费观看| 好男人在线观看高清免费视频| 日本三级黄在线观看| 岛国毛片在线播放| 久久久久久伊人网av| av卡一久久| 午夜精品国产一区二区电影 | 国产高清不卡午夜福利| 国产精品人妻久久久影院| 高清欧美精品videossex| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 两个人视频免费观看高清| 成人鲁丝片一二三区免费| 日韩成人伦理影院| 日本午夜av视频| 嫩草影院新地址| 久热久热在线精品观看| 国产男女超爽视频在线观看| 七月丁香在线播放| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 亚洲综合精品二区| 一级爰片在线观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 日韩成人av中文字幕在线观看| 麻豆av噜噜一区二区三区| 国产亚洲精品av在线| freevideosex欧美| 欧美zozozo另类| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产成人精品福利久久| 婷婷六月久久综合丁香| 免费观看的影片在线观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 麻豆av噜噜一区二区三区| 亚洲,欧美,日韩| 国产一区二区三区av在线| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 欧美3d第一页| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲欧美成人综合另类久久久| av卡一久久| 极品少妇高潮喷水抽搐| 欧美精品一区二区大全| 欧美一区二区亚洲| 欧美日韩亚洲高清精品| 亚洲成人av在线免费| 国产成人免费观看mmmm| 成人性生交大片免费视频hd| 高清视频免费观看一区二区 | 亚洲人成网站高清观看| 亚洲av日韩在线播放| 一边亲一边摸免费视频| 美女高潮的动态| 亚洲最大成人中文| 久久久成人免费电影| 性色avwww在线观看| 在线观看人妻少妇| 永久免费av网站大全| 国国产精品蜜臀av免费| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 国产视频首页在线观看| 中文字幕制服av| 伦理电影大哥的女人| 久久久精品欧美日韩精品| 人妻少妇偷人精品九色| 内射极品少妇av片p| 精品久久久久久久久亚洲| 国产精品久久久久久av不卡| 亚洲三级黄色毛片| 91aial.com中文字幕在线观看| 日本av手机在线免费观看| 男人狂女人下面高潮的视频| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 黄色配什么色好看| 久久精品人妻少妇| 黑人高潮一二区| 中国国产av一级| 毛片女人毛片| 免费少妇av软件| 男女啪啪激烈高潮av片| 丝袜美腿在线中文| 黄色欧美视频在线观看| 亚洲欧美精品专区久久| 国产在视频线精品| 欧美97在线视频| 中文字幕av成人在线电影| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 中文字幕亚洲精品专区| 午夜免费男女啪啪视频观看| 欧美精品一区二区大全| 亚洲内射少妇av| 大香蕉97超碰在线| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 欧美不卡视频在线免费观看| 久久久久精品久久久久真实原创| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 99热这里只有是精品在线观看| 啦啦啦韩国在线观看视频| 欧美三级亚洲精品| 久久久久久久久久黄片| 午夜福利在线观看吧| 日本三级黄在线观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 99九九线精品视频在线观看视频| 97热精品久久久久久| 一级爰片在线观看| 国产 一区精品| 国精品久久久久久国模美| 蜜桃久久精品国产亚洲av| av福利片在线观看| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 久久综合国产亚洲精品| 男人爽女人下面视频在线观看| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国精品久久久久久国模美| 观看免费一级毛片| 亚洲乱码一区二区免费版| 久久韩国三级中文字幕| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚洲成人精品中文字幕电影| 在现免费观看毛片| 久久鲁丝午夜福利片| 七月丁香在线播放| 男人狂女人下面高潮的视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 欧美一区二区亚洲| 成人综合一区亚洲| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 毛片女人毛片| 国产毛片a区久久久久| 在线免费观看的www视频| 成年人午夜在线观看视频 | 亚洲18禁久久av| 亚洲四区av| 亚洲天堂国产精品一区在线| 成年版毛片免费区| 欧美日韩在线观看h| 欧美成人a在线观看| 精品一区二区三卡| 黄片wwwwww| 国产精品嫩草影院av在线观看| 在线播放无遮挡| 日韩精品有码人妻一区| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 精品酒店卫生间| 亚洲av成人av| 免费黄网站久久成人精品| 两个人的视频大全免费| 国产精品久久视频播放| 特级一级黄色大片| 精品久久国产蜜桃| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 黄片无遮挡物在线观看| 久久久久精品性色| 色网站视频免费| av一本久久久久| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国内精品美女久久久久久| 亚洲av一区综合| 午夜久久久久精精品| 亚洲精品亚洲一区二区| 最近手机中文字幕大全| 九草在线视频观看| 日韩强制内射视频| 一级爰片在线观看| 亚洲怡红院男人天堂| 国产成人aa在线观看| 久久鲁丝午夜福利片| 久久人人爽人人爽人人片va| 丝瓜视频免费看黄片| 久久精品人妻少妇| 成人无遮挡网站| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲18禁久久av| 亚洲精品456在线播放app| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 免费黄网站久久成人精品| 精品人妻偷拍中文字幕| 春色校园在线视频观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 成人漫画全彩无遮挡| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国产av在哪里看| 亚洲欧美清纯卡通| 天天一区二区日本电影三级| 嫩草影院精品99| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 人人妻人人澡欧美一区二区| 人妻少妇偷人精品九色| 国产黄片美女视频| 国产黄片视频在线免费观看| 少妇的逼水好多| 色综合亚洲欧美另类图片| 三级国产精品片| 高清午夜精品一区二区三区| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲无线观看免费| 精品久久国产蜜桃| 国产色婷婷99| 欧美97在线视频| 国产极品天堂在线| 国产片特级美女逼逼视频| 色综合色国产| 乱人视频在线观看| 少妇的逼水好多| 国产精品一及| 精品久久久久久成人av| 黄片无遮挡物在线观看| 韩国av在线不卡| 永久网站在线| 午夜免费激情av| 精品少妇黑人巨大在线播放| 色哟哟·www| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久久这里只有精品中国| 国产精品蜜桃在线观看| 国产精品国产三级专区第一集| 亚洲综合精品二区| 少妇熟女aⅴ在线视频| 久久精品综合一区二区三区| 欧美97在线视频| 99久久精品热视频| 又爽又黄无遮挡网站| 1000部很黄的大片| 99久国产av精品国产电影| 伦理电影大哥的女人| 我要看日韩黄色一级片| 日韩一区二区视频免费看| 七月丁香在线播放| 日日啪夜夜爽| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产麻豆成人av免费视频| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产精品久久视频播放| 一个人看视频在线观看www免费| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 日本三级黄在线观看| 91aial.com中文字幕在线观看| 成人性生交大片免费视频hd| 国产一级毛片七仙女欲春2| 天天躁日日操中文字幕| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 99久久精品一区二区三区| 高清日韩中文字幕在线| 国产在线一区二区三区精| 亚洲欧美精品专区久久| 天堂俺去俺来也www色官网 | 亚洲国产色片| 国产免费一级a男人的天堂| 国产精品久久视频播放| 日韩欧美一区视频在线观看 | 免费播放大片免费观看视频在线观看| 国产综合精华液| 欧美日韩亚洲高清精品| 成人亚洲欧美一区二区av| 少妇的逼好多水| 美女高潮的动态| av天堂中文字幕网| 久久人人爽人人爽人人片va| 青春草国产在线视频| 欧美不卡视频在线免费观看| 在线免费观看的www视频| 久久精品夜色国产| 看免费成人av毛片| 亚洲av.av天堂| 久久人人爽人人片av| 大香蕉久久网| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产精品一二三区在线看| 三级国产精品欧美在线观看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 成人亚洲欧美一区二区av| 一二三四中文在线观看免费高清| 伦理电影大哥的女人| 一夜夜www| 亚洲无线观看免费| 欧美一区二区亚洲| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲av一区综合| 久久亚洲国产成人精品v| 一级a做视频免费观看| 黄色欧美视频在线观看| 国产亚洲91精品色在线| 国产高清三级在线| 国产一区亚洲一区在线观看| 精品一区二区三卡| 精品久久国产蜜桃| 久久久久久久久中文| 九色成人免费人妻av| av在线老鸭窝| 日韩三级伦理在线观看| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产成人91sexporn| 久久久久久久国产电影| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 特大巨黑吊av在线直播| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 欧美 日韩 精品 国产| 国产一区二区三区av在线| 日本黄色片子视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| 精品久久久久久成人av| 久久久成人免费电影| 日本三级黄在线观看| 成人国产麻豆网| 晚上一个人看的免费电影| 久久国产乱子免费精品| 极品教师在线视频| 亚洲av成人精品一二三区| 内地一区二区视频在线| 久久久久久伊人网av| 精品久久久久久久久久久久久| 少妇丰满av| 99久国产av精品| 亚洲国产精品sss在线观看| 久久精品久久久久久久性| 久久久亚洲精品成人影院| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 国产黄色免费在线视频| 99热这里只有是精品在线观看| 国产av在哪里看| a级毛色黄片| 国产乱人视频| 少妇熟女欧美另类| 亚洲欧美精品专区久久| 中文字幕亚洲精品专区| www.色视频.com| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚州av有码| 亚洲在线观看片| 国产精品一区二区在线观看99 | 日韩视频在线欧美| 夫妻午夜视频| 尾随美女入室| 一夜夜www| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 日本爱情动作片www.在线观看| 亚洲欧美日韩东京热| 久久99热这里只频精品6学生| 高清视频免费观看一区二区 | 免费观看在线日韩| 简卡轻食公司| 人人妻人人澡欧美一区二区| 极品教师在线视频| 精品一区二区免费观看| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产av不卡久久| 日韩电影二区| 嫩草影院精品99| 人妻一区二区av| 亚洲精品久久午夜乱码| 成人亚洲精品一区在线观看 | 在线免费观看的www视频| 国产一区有黄有色的免费视频 | 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 99久久中文字幕三级久久日本| 99热这里只有是精品50| 精品久久久久久久久av| 国产成人午夜福利电影在线观看| 一夜夜www| 精品酒店卫生间| 精品久久久久久久末码| 国产成人精品久久久久久| av女优亚洲男人天堂| 男的添女的下面高潮视频| 在线免费观看不下载黄p国产| av在线观看视频网站免费| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 色综合站精品国产| av在线亚洲专区| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 人妻一区二区av| 免费观看性生交大片5| 黄色一级大片看看| 亚洲国产最新在线播放| 边亲边吃奶的免费视频| 色视频www国产| eeuss影院久久| 伊人久久国产一区二区| 高清av免费在线| 看黄色毛片网站| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲经典国产精华液单| 午夜精品在线福利| 国产极品天堂在线| 亚洲精品国产av蜜桃| 日日撸夜夜添| 秋霞伦理黄片| 一夜夜www| 国产精品1区2区在线观看.| 午夜福利视频1000在线观看| 久久精品人妻少妇| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲伊人久久精品综合| 青春草视频在线免费观看| 国产精品日韩av在线免费观看| 久久亚洲国产成人精品v| 两个人视频免费观看高清| 成人亚洲欧美一区二区av| 日韩亚洲欧美综合| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 欧美日韩亚洲高清精品| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 97人妻精品一区二区三区麻豆| 免费黄网站久久成人精品| 日韩大片免费观看网站| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 青青草视频在线视频观看| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 成人无遮挡网站| 亚洲精品aⅴ在线观看| a级毛色黄片| 日韩精品有码人妻一区| 夜夜爽夜夜爽视频| 超碰av人人做人人爽久久| 网址你懂的国产日韩在线| 午夜免费激情av| 久久精品人妻少妇| 欧美极品一区二区三区四区| 国产精品人妻久久久影院| 18+在线观看网站| 嫩草影院新地址| 欧美区成人在线视频| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 中文字幕免费在线视频6| www.色视频.com| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 国产欧美日韩精品一区二区| 视频中文字幕在线观看| 熟女电影av网| 免费黄色在线免费观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲人成网站高清观看| 欧美性感艳星| 欧美区成人在线视频| 熟女人妻精品中文字幕| 国产一区二区在线观看日韩| 国产日韩欧美在线精品| 欧美一区二区亚洲| 国产av码专区亚洲av| 国产麻豆成人av免费视频| 五月伊人婷婷丁香| 黄色欧美视频在线观看| 日韩成人av中文字幕在线观看| 最近中文字幕2019免费版| 精品人妻熟女av久视频| 日本午夜av视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 久久久久久久久久人人人人人人| 国产美女午夜福利| 婷婷色综合大香蕉| 日韩视频在线欧美| 天美传媒精品一区二区| 国产午夜福利久久久久久| 青春草国产在线视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 成人欧美大片| 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲精品aⅴ在线观看| 免费看日本二区| 亚洲精品乱久久久久久| 人妻一区二区av| 一个人观看的视频www高清免费观看| 网址你懂的国产日韩在线| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 久久97久久精品| 看十八女毛片水多多多| 免费观看无遮挡的男女| 黄色配什么色好看| 国产免费视频播放在线视频 | 欧美激情在线99| 国产毛片a区久久久久| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 91久久精品电影网| 能在线免费观看的黄片| ponron亚洲| 99热6这里只有精品| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 韩国av在线不卡| 91aial.com中文字幕在线观看| 免费看日本二区| 看非洲黑人一级黄片| 九九爱精品视频在线观看| 久久久成人免费电影| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 日韩欧美三级三区| 国产一区有黄有色的免费视频 | 婷婷色av中文字幕| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产伦理片在线播放av一区| 亚洲综合精品二区| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | av.在线天堂| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产精品人妻久久久影院| 亚洲在久久综合| 久久久色成人| 欧美bdsm另类| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| av卡一久久| 亚洲av中文av极速乱| 高清在线视频一区二区三区| 最近视频中文字幕2019在线8| 九九在线视频观看精品| 欧美3d第一页| 国产男人的电影天堂91| 国产毛片a区久久久久| 精品人妻熟女av久视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产精品人妻久久久久久| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产亚洲5aaaaa淫片| 观看免费一级毛片| 嫩草影院新地址| 欧美精品一区二区大全| 国产久久久一区二区三区| or卡值多少钱| 免费观看在线日韩| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 男女边吃奶边做爰视频| 大陆偷拍与自拍| 久久99热6这里只有精品| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 亚洲在久久综合| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 热99在线观看视频| 欧美变态另类bdsm刘玥| 精品久久久久久久末码| 久久99蜜桃精品久久| 黄色欧美视频在线观看| 91精品伊人久久大香线蕉| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲av在线观看美女高潮| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产一级毛片七仙女欲春2| 午夜精品国产一区二区电影 | 好男人视频免费观看在线| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 午夜精品一区二区三区免费看| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 久久精品人妻少妇| 免费黄频网站在线观看国产| 日本免费a在线| 麻豆久久精品国产亚洲av| 欧美高清性xxxxhd video| 乱人视频在线观看| 国产精品一区二区性色av| 国产久久久一区二区三区| 一级二级三级毛片免费看| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产v大片淫在线免费观看| 免费电影在线观看免费观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 日韩 亚洲 欧美在线| 久久国产乱子免费精品| 如何舔出高潮| 丰满人妻一区二区三区视频av| 国产午夜精品一二区理论片| 一夜夜www| 免费av不卡在线播放| 好男人在线观看高清免费视频| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产高清三级在线| 18禁在线播放成人免费| h日本视频在线播放| 亚洲欧美清纯卡通| 日韩精品青青久久久久久| 高清毛片免费看| 色综合站精品国产| 少妇熟女aⅴ在线视频| 六月丁香七月| 国产精品一区二区性色av| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲av.av天堂| 大香蕉久久网| 麻豆av噜噜一区二区三区|