磁性納米顆粒負(fù)載質(zhì)粒DNA 的研究

彭子艾，李丹丹，夏澳運(yùn)，王加峰，黃翠紅，王 慧，郭 濤，陳志強(qiáng)

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/國(guó)家植物航天育種工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510642)

隨著納米生物技術(shù)的迅速發(fā)展，納米材料可作為基因載體，通過(guò)包裹、靜電吸附及化學(xué)鍵作用等方式負(fù)載外源基因[1-3]，通過(guò)細(xì)胞吞噬作用將其傳送到細(xì)胞內(nèi)，使基因成功表達(dá)[4]。與其他納米載體相比，磁性納米載體具有超順磁性優(yōu)勢(shì)[5]，在磁場(chǎng)作用下可快速負(fù)載、運(yùn)輸目的基因[6]。有研究表明外源基因成功整合到基因組中需要通過(guò)3個(gè)細(xì)胞屏障：細(xì)胞膜、溶酶體和細(xì)胞核[7]，影響整合效率的關(guān)鍵因素是避開溶酶體的消化作用[8-9]，納米載體的表面電荷[10]、粒徑大小[11]和修飾功能基團(tuán)[12]等是影響整合效率的重要因素。有學(xué)者提出納米載體基因復(fù)合物可通過(guò)“質(zhì)子海綿效應(yīng)”免受溶酶體的消化作用[13-14]。

納米載體基因傳輸技術(shù)為動(dòng)植物遺傳育種提供了新思路，Wang 等[15]將磁性納米載體與精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染相結(jié)合，獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠。Zhao等[16]利用磁性納米顆粒(Magnetic nanoparticle，MNP)作為基因載體，負(fù)載pGBIF4ABCΔα 質(zhì)粒，在磁場(chǎng)作用下磁轉(zhuǎn)染棉花花粉，成功篩選到轉(zhuǎn)融合抗蟲基因的棉花。隨著CRISPR 基因編輯和修飾技術(shù)的使用，磁性納米顆粒會(huì)是將生物分子傳送到植物體內(nèi)進(jìn)行基因編輯和修飾的最佳平臺(tái)[17]。

本研究選用MNP作為基因載體，負(fù)載質(zhì)粒pRGEB32，構(gòu)建了不同質(zhì)量比的納米載體?基因復(fù)合物MNP?pRGEB32。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳阻滯試驗(yàn)評(píng)價(jià)和分析了MNP對(duì)pRGEB32 的結(jié)合和保護(hù)能力。通過(guò)納米粒度分析儀、Zeta 電位分析儀、透射電子顯微鏡和原子力顯微鏡對(duì)MNP 和MNP?pRGEB32復(fù)合物的粒徑、表面電位、形貌、分布等進(jìn)行了檢測(cè)和觀察，研究了MNP?pRGEB32復(fù)合物的生物物理特性、基因負(fù)載形態(tài)與負(fù)載機(jī)理，以期為MNP負(fù)載CRISPR/Cas9表達(dá)載體的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

MNP poly MAG1000購(gòu)自德國(guó)Chemicell公司；DNase I 購(gòu)自TaKaRa 公司；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購(gòu)自TIANGEN 生物技術(shù)有限公司；含CRISPR/Cas9表達(dá)載體pRGEB32[18]的大腸埃希菌EscherichiacoliDH5α 由國(guó)家植物航天育種工程技術(shù)研究中心保存；核酸染料GelRed 購(gòu)自美國(guó)Biotium公司。

1.2 質(zhì)粒DNA 的提取與純化

取pRGEB32(15 888 bp)大腸埃希菌菌液加入到含50 ng/μL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基(每升培養(yǎng)基含酵母提取物5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g)中，于37℃、220 r/m in 培養(yǎng)16 h，按照TIANGEN無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒說(shuō)明書提取質(zhì)粒。利用超微量紫外分光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒DNA 的濃度和純度，選取D260nm/D280 nm≈1.8的質(zhì)粒DNA 于?20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 磁性納米顆粒?DNA 復(fù)合物的制備

pRGEB32質(zhì)量固定為4μg，將poly MAG1000和pRGEB32按照質(zhì)量比為1∶1、1∶4、1∶8、1∶16、1∶24、1∶40、1∶50混合，于37℃條件下培育30m in，連接制備MNP?DNA 復(fù)合物。

1.4 瓊脂糖凝膠阻滯試驗(yàn)

將MNP?pRGEB32復(fù)合物點(diǎn)樣在8 g/L 的瓊脂糖凝膠(含7μL 熒光染料GelRed)上，在TAE緩沖液中于130 V 電泳30m in，然后在凝膠成像儀上觀察，分析MNP對(duì)pRGEB32的負(fù)載能力；同時(shí)，將MNP?pRGEB32復(fù)合物在37℃分別用DNase I酶切4 h，用Hind III和BsaI 雙酶切16 h，然后電泳跑膠，分析對(duì)MNP對(duì)pRGEB32的保護(hù)能力。

1.5 粒度分布及Zeta 電位分析

將MNP和pRGEB32按照質(zhì)量比為1∶1、1∶4、1∶8制備的MNP?pRGEB32復(fù)合物分別用超純水稀釋至0.001μg/μL，采用納米粒度分析儀及Zeta電位分析儀分析粒度分布及Zeta 電位。

1.6 透射電子顯微鏡觀測(cè)

吸取MNP和MNP、pRGEB32質(zhì)量比為1∶1的MNP?pRGEB32復(fù)合物，用超純水分別稀釋至0.001μg/μL，各取10μL 均勻滴加到干凈的碳膜覆蓋的銅網(wǎng)上，用濾紙吸干多余的液體，靜置晾干30m in，用20 g/L的磷鎢酸負(fù)染1m in，置于干凈的培養(yǎng)皿中自然干燥，然后在透射電子顯微鏡下觀測(cè)形態(tài)并拍照。

1.7 原子力顯微鏡觀測(cè)

吸取M NP和p RGEB 32質(zhì)量比為1∶1的MNP?pRGEB32 復(fù)合物，用超純水稀釋至0.01μg/μL，取10μL 均勻滴加到新剝離的云母片表面，置于干凈的培養(yǎng)皿中自然干燥，然后在原子力顯微鏡下掃描成像，用NanoScope Analysis 1.5在Height Sensor 模式下分析圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 磁性納米顆粒對(duì)質(zhì)粒DNA 負(fù)載和保護(hù)能力分析

2.1.1 磁性納米顆粒對(duì)質(zhì)粒DNA 的負(fù)載能力分析MNP和pRGEB 32質(zhì)量比為1∶1、1∶4、1∶8、1∶16時(shí)，MNP與pRGEB32完全結(jié)合，泳道中無(wú)游離的pRGEB32；質(zhì)量比為1∶24、1∶40、1∶50時(shí)，逐漸減少的MNP難以負(fù)載逐步增多的pRGEB32，形成的MNP?pRGEB32復(fù)合物較少，過(guò)量的pRGEB32在泳道中呈現(xiàn)明顯條帶(圖1)。結(jié)果表明MNP能有效裝載相當(dāng)于自身質(zhì)量16倍的pRGEB32。

圖1 MNP?pRGEB32復(fù)合物電泳分析Fig.1 Electrophoreses analyses of MNP-pRGEB 32 complexes

2.1.2 磁性納米載體對(duì)pRGEB32的保護(hù)能力分析MNP?pRGEB32復(fù)合物用核酸酶DNase I處理4 h 后，質(zhì)量比為1∶1、1∶4、1∶8、1∶16的復(fù)合物樣品仍停留在點(diǎn)樣孔，純質(zhì)粒及質(zhì)量比為1∶24、1∶40、1∶50的復(fù)合物樣品中過(guò)量的DNA 被完全消化，完全結(jié)合的MNP?pRGEB32復(fù)合物停留在點(diǎn)樣孔(圖2)。MNP?pRGEB32復(fù)合物用Hind III 和BsaI 雙酶切16 h 后，純質(zhì)粒及質(zhì)量比為1∶24、1∶40、1∶50的復(fù)合物樣品中過(guò)量的DNA 隨電場(chǎng)遷移，被限制性內(nèi)切酶Hind III和BsaI切開形成2條線性質(zhì)粒條帶，MNP?pRGEB32復(fù)合物質(zhì)量比為1∶1、1∶4、1∶8、1∶16的泳道沒(méi)有DNA 痕跡，說(shuō)明MNP?pRGEB32復(fù)合物沒(méi)有被酶切割(圖3)。結(jié)果證明MNP 能保護(hù)其負(fù)載的pRGEB32 免受酶促降解。

圖2 MNP?pRGEB32復(fù)合物用DNase I 酶切處理的電泳分析Fig.2 Electrophoresis analyses of MNP-pRGEB 32 complexes digested with DNase I

2.2 粒度分布及Zeta 電位分析

納米粒度及Zeta 電位分析儀結(jié)果顯示，MNP的平均疏水粒徑為127.5 nm，Zeta 電位為12.1m V，在結(jié)合帶負(fù)電的pRGEB32后，MNP?pRGEB32復(fù)合物的粒徑增大，Zeta 電位降低(圖4)。隨著結(jié)合的pRGEB32的量逐漸增加，MNP?pRGEB32復(fù)合物的粒徑也逐漸增加，Zeta 電位逐漸降低。結(jié)果說(shuō)明MNP能通過(guò)靜電作用負(fù)載pRGEB32，并能有效地結(jié)合和負(fù)載pRGEB32形成納米載體基因復(fù)合物。

圖3 MNP?pRGEB32復(fù)合物用Hin d III 和Bsa I 雙酶切處理的電泳分析Fig.3 Electrophoresis analyses of MNP-pRGEB 32 complexes digested with Hin d III and Bsa I

圖4 MNP和MNP?pRGEB32復(fù)合物的粒徑及Zeta 電位分析Fig.4 Size distribution and Zeta potential of MNP and MNP-pRGEB32 complex

2.3 透射電子顯微鏡觀測(cè)

透射電鏡下MNP為規(guī)則球形，分散性較好，粒徑約10～150 nm(圖5a)。中心深色部分為磁性氧化鐵核心，外層附有陽(yáng)離子PEI膜包裹(圖5b)。MNP與pRGEB32結(jié)合后大量的pRGEB32被壓縮、吸附、聚集在納米顆粒表面(圖5c和5d)。試驗(yàn)表明MNP可攜帶大量的pRGEB32，從而作為外源基因轉(zhuǎn)移的載體。

2.4 原子力顯微鏡觀測(cè)

原子力顯微鏡觀察到MNP周圍吸附了桿狀的pRGEB32，以載體顆粒為中心，越靠近中心濃度越高，呈放射狀向外擴(kuò)展(圖6)，與透射電鏡觀測(cè)的形態(tài)相符合。這種高濃度的聚集有利于載體顆粒攜帶大量的pRGEB32，從而通過(guò)細(xì)胞的吞噬作用將外源基因傳送至細(xì)胞內(nèi)部。

圖5 MNP和MNP?pRGEB32復(fù)合物的透射電鏡圖像Fig.5 Transmission electron microscope images of MNP and MNP-pRGEB32 complex

圖6 MNP?pRGEB32復(fù)合物的原子力顯微鏡圖像Fig.6 Atomic force microscope images of MNP and MNP-pRGEB32 complex

3 討論與結(jié)論

納米技術(shù)已經(jīng)與許多學(xué)科交叉研究，具有巨大的潛在價(jià)值，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[19-21]。理想的基因載體應(yīng)該能有效地負(fù)載外源核酸，具有較高的生物相容性，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可以有效保護(hù)外源核酸免受酶促降解，使其最終能實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)[22-23]。瓊脂糖凝膠電泳阻滯試驗(yàn)顯示了MNP高效負(fù)載pRGEB32的能力，并能夠有效保護(hù)pRGEB32免受核酸酶降解作用。有研究推測(cè)可能是DNA 和納米載體結(jié)合后導(dǎo)致DNA 構(gòu)象發(fā)生變化，阻止M g2+、核酸酶與DNA 接觸，從而保護(hù)DNA 免受酶的消化作用[24-25]。通過(guò)粒度分布和Zeta 電位測(cè)試顯示MNP結(jié)合pRGEB32后，粒徑增大，電位降低，說(shuō)明二者通過(guò)靜電相互作用形成了MNP?pRGEB32復(fù)合物。透射電鏡和原子力顯微鏡的觀測(cè)證實(shí)pRGEB32被吸附壓縮后聚集在MNP表面[26]，這種壓縮和高濃度的聚集，使載體能夠有效地負(fù)載和保護(hù)pRGEB32。通過(guò)上述結(jié)果可知，M NP在負(fù)載、聚集和保護(hù)pRGEB32方面表現(xiàn)優(yōu)越，是一種理想的基因載體。

有研究通過(guò)磁性納米載體負(fù)載外源基因，將外源基因整合到生殖細(xì)胞中，外源基因能在后代穩(wěn)定遺傳[16]。同時(shí)有研究證明可以利用CRISPR/Cas9編輯性細(xì)胞基因組，如Chapman 等[27]利用CRISPR/Cas9直接編輯大鼠的精原細(xì)胞，產(chǎn)生純合非鑲嵌突變后代。若能將納米材料和CRISPR 基因編輯技術(shù)有效結(jié)合，直接對(duì)動(dòng)植物生殖細(xì)胞定向編輯，將克服傳統(tǒng)方式中部分物種基因轉(zhuǎn)化困難、育種周期長(zhǎng)等瓶頸問(wèn)題。本試驗(yàn)證實(shí)磁性納米載體能有效結(jié)合CRISPR 編輯系統(tǒng)，為探索基于磁性納米載體定向編輯技術(shù)的研究奠定了基礎(chǔ)。