不同產(chǎn)地甘草中甘草苷等五種成分的含量比較研究

張黎娟，汪盈盈，李 飛

（1.亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 亳州 236800 ；2.安徽中醫(yī)藥科學(xué)院 亳州中醫(yī)藥研究所，安徽 亳州 236800；3.亳州市食品藥品檢驗中心，安徽 亳州 236800）

甘草來源于豆科（Leguminosae）植物甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch.）、脹果甘草（G.inflataBat.）和光果甘草（G.glabra L.）的干燥根和根莖。具有補脾益氣、祛痰止咳、緩急止痛、清熱解毒、調(diào)和諸藥的功效[1-2]。甘草是神農(nóng)本草經(jīng)記載的上品常用中藥，在中國甘草應(yīng)用于臨床的時間已有4 000多年[3]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)甘草的化學(xué)成分有三萜類、黃酮類、生物堿、多糖、氨基酸等。隨著對甘草應(yīng)用的不斷深入研究，中藥納入醫(yī)保使用范圍，甘草的消耗量不斷增加，導(dǎo)致甘草的市場需求量不斷增加，并遠(yuǎn)超國內(nèi)的野生產(chǎn)量，采取野生地區(qū)計劃性人工種植后，仍無法滿足國內(nèi)外市場需求。除中國外，中東、中亞及東歐一些國家也擁有豐富的野生甘草資源，2008年起我國施行了進(jìn)口甘草免關(guān)稅，2011年我國甘草進(jìn)口量為10 659 t，同比增長123 %，進(jìn)口額為1 012萬美元，同比增長160 %。進(jìn)口甘草占到我國76 %的甘草進(jìn)出口貿(mào)易量，已成為我國進(jìn)口中藥材飲片第二大品種[4]。

中藥甘草的質(zhì)量和影響質(zhì)量的因素一直是備受關(guān)注的研究對象，目前閆永紅、林壽全等[5-7]對國產(chǎn)野生與栽培甘草不同來源、不同產(chǎn)地、不同生長年限所導(dǎo)致的性狀和活性成分含量的差異進(jìn)行了研究，結(jié)果表明因來源、生態(tài)環(huán)境、生長年限等差異會造成甘草質(zhì)量上的差別。國內(nèi)外對甘草的研究多在于活性成分的藥理作用和活性成分的提取分離[8-9]。因土壤、氣候、來源等生長環(huán)境的差異，進(jìn)口甘草與國產(chǎn)甘草質(zhì)量是否一致，藥用療效是否相同，這都是進(jìn)口甘草能否用于中醫(yī)藥臨床必須解答的問題。對進(jìn)口甘草在甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素、甘草酸5種活性成分上與國產(chǎn)甘草進(jìn)行質(zhì)量一致性評價，期望能發(fā)現(xiàn)其中的質(zhì)量差異，為今后的進(jìn)口甘草應(yīng)用于中醫(yī)臨床和深入研究提供參考。

高曉娟等考證古代文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)國產(chǎn)甘草的核心產(chǎn)區(qū)從以山西為主產(chǎn)區(qū)變遷為今天的以西北地區(qū)（內(nèi)蒙古、甘肅、新疆、寧夏）為主要產(chǎn)區(qū)[10]。烏拉爾甘草分布于內(nèi)蒙、甘肅、寧夏、新疆、青海、陜西、山西、河北、遼寧、吉林、黑龍江，脹果甘草分布于甘肅、新疆、陜西、山西，光果甘草分布于新疆、青海。林壽全等研究表明生態(tài)因子對甘草質(zhì)量有影響，認(rèn)為不同產(chǎn)區(qū)的甘草在性狀和有效成分含量上有顯著差異。在中東、中亞及東歐一些國家也擁有豐富的野生甘草資源，例如土庫曼斯坦、烏茲別克斯坦、哈薩克斯坦、阿塞拜疆、巴基斯坦、塔吉克斯坦、阿富汗等地皆有野生甘草資源分布，并向中國出口[3]。

1 儀器與材料

1.1 儀器

安捷倫1260高效液相色譜儀（包括 G1311C四元單泵、G1329B 進(jìn)樣器、G1316A紫外檢測器、Technoiogies工作站）；十萬分之一電子天平（上海儀科儀器有限公司）；數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋（廣州市海數(shù)實驗儀器制造廠）；700VDE型數(shù)控超聲波清洗器（合肥金龍克機械制造有限公司）；EV321真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（LadTech）；SHZ-DⅢ予華牌循環(huán)水真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；UORII-207優(yōu)普系列超純水器（四川優(yōu)普超純科技有限公司）。

1.2 材料

國產(chǎn)甘草購于亳州中藥市場；進(jìn)口甘草（烏茲別克斯坦、哈薩克斯坦、巴基斯坦、吉爾吉斯斯坦）來源于國家中藥材質(zhì)量監(jiān)督檢查中心，經(jīng)蔣磊副主任中藥師鑒定為脹果甘草（G.inflataBat）；甘草苷對照品（批號18030905）、甘草酸銨對照品（批號18012902）、甘草素對照品（批號17112302）、異甘草苷對照品（批號17042102）、異甘草素對照品（批號17072104，成都普菲德生物科技有限公司）；磷酸（批號151005，上海展云化工有限公司）；甲醇（批號20170712）、無水乙醇（批號20170612）、乙腈（批號20180103），來源于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實驗用水均為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：島津 Inerisil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm），0.85 %磷酸水溶液為流動相A，乙腈為流動相 B，梯度洗脫（見表1），柱溫 25 ℃，檢測波長237 nm，流速 1.0 mL/min[11]。上述色譜條件下，甘草苷、甘草酸、異甘草苷、甘草素、異甘草素對照品高效液相色譜圖，見圖1。

表1 梯度洗脫程序/%

圖1 甘草混合對照品溶液HPLC圖

2.2 供試品溶液的制備

取本品粉末（過三號篩）約2.0 g，精密稱定，置 250 mL錐形瓶中，加入80%乙醇40 mL，浸泡提取3次，合并收集3次濾液，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至5 mL，加70 %乙醇定容于25 mL容量瓶中，即得。

2.3 對照品溶液的制備

分別精密稱取減壓干燥4 h的甘草苷對照品10.23 mg、異甘草苷對照品13.25 mg、甘草素對照品11.20 mg、甘草酸銨對照品11.21 mg、異甘草素對照品10.61 mg，置于50 mL容量瓶，用70 %乙醇定容至刻度線，分別精密吸取 2.0、2.0、0.5、2.0、1.0 mL，置 10 mL 容量瓶中，用 70%乙醇定容，搖勻，得濃度分別為 0.040 9、0.053 0、0.011 2、0.044 8、0.021 2 mg/mL 的混合對照品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察

分別精密吸取混合對照品溶液 0.5、1、5、10、15 μL 進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，計算回歸方程。甘草苷：Y=40.879X+12.134，r=0.998 5，線性范圍 0.020 5～0.613 05 μg；異甘草苷：Y=48.4X+0.453 09，r=1，線性范圍 0.026 5～0.705 0 μg；甘草素：Y=25.475X+2.000 05，r=0.999 9 線性范圍 0.005 6 ～ 0.168 0 μg；甘草酸：Y=13.526X+1.299 09，r=0.999 07；線性范圍 0.022 4～ 0.672 0 μg；異甘草素：Y=27.706X+0.735 08，r=1；線性范圍 0.010 6～ 0.318 00 μg。各成分在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.2 精密度試驗

精密吸取同一批國產(chǎn)甘草供試品溶液 10 μL，連續(xù)進(jìn)樣 5 次，記錄色譜峰面積。結(jié)果甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸、異甘草素峰面積 RSD 分別為1.74%、0.96%、1.27%、1.54%、1.69%。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗

取國產(chǎn)甘草供試品溶液，分別在 0、2、4、8、16、24 h 進(jìn)樣 10 μL，記錄色譜峰面積，RSD 分別為1.67 %、0.98 %、1.29 %、1.49 %、1.57 %，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗

取同一批國產(chǎn)甘草粉末5份，2.001 9 g、2.001 2 g、2.001 0 g、2.002 1 g、2.002 2 g、精密稱定，制備5份試品溶液，進(jìn)樣 10 μL，記錄色譜峰面積。甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸、異甘草素平均含量分別為 7.295、0.956、0.180、17.347、0.175 mg/g。RSD 分別為1.49 %、0.95 %、1.24 %、1.43 %、1.27 %。

2.4.5 加樣回收率

取已知含量的同一批國產(chǎn)甘草粉末5份，2.002 5 g、2.001 4 g、2.001 5 g、2.000 3 g、2.002 0 g，精密稱定，制備供試品溶液，每份加入相應(yīng)質(zhì)量的對照品，進(jìn)樣 10 μL分析。計算甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸及異甘草素平均加樣回收率分別為98.98 %、99.45 %、96.97 %、99.46 %、96.85 %（見表2），實驗結(jié)果表明本法回收率良好。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果

2.5 甘草含量測定

取甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸、異甘草素混合對照品溶液，制備巴基斯坦進(jìn)口甘草、哈薩克斯坦進(jìn)口甘草、吉爾吉斯斯坦進(jìn)口甘草、烏茲別克斯坦進(jìn)口甘草、國產(chǎn)甘草供試品溶液，進(jìn)樣10 μL 分析。

圖2 不同產(chǎn)地的甘草色譜圖色譜圖

表3 進(jìn)口甘草與國產(chǎn)甘草甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸、異甘草素含量測定結(jié)果/（mg/g）

3 討論

實驗對不同提取方法進(jìn)行比較，溫浸法提取甘草素、異甘草素、異甘草苷效果優(yōu)于加熱回流法和超聲法，且甘草苷、甘草酸的提取效果亦良好。確定了色譜柱為 ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm），0.85 %磷酸水溶液和乙腈為流動相，梯度洗脫，柱溫25 ℃，檢測波長237 nm，流速1.0 mL/min的色譜條件測定甘草素、甘草苷、異甘草素、甘草酸、異甘草苷5種活性成分結(jié)果準(zhǔn)確，可靠。

本實驗測定了進(jìn)口甘草和國產(chǎn)甘草中的甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸、異甘草素的含量。測定結(jié)果表明甘草苷含量以國產(chǎn)甘草最高。進(jìn)口甘草與國產(chǎn)甘草在甘草素成分上存在明顯質(zhì)量差異。