充血性心力衰竭中醫(yī)證候動(dòng)物模型研究思考

李小茜，何建成

(上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201230)

充血性心力衰竭(congestive heart failure，CHF)多發(fā)于各種器質(zhì)性心血管疾病的終末階段，為臨床常見(jiàn)的重大疾病之一，發(fā)病率與致死率逐年攀升，如何積極有效的防治引發(fā)臨床研究者的關(guān)注。中醫(yī)藥在CHF的防治方面發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用[1]，病證結(jié)合是中醫(yī)證候研究的指導(dǎo)原則。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是本病發(fā)病機(jī)制及其中醫(yī)證候研究的重要基礎(chǔ)，其中動(dòng)物模型的制備則為關(guān)鍵所在。

目前有關(guān)CHF疾病的動(dòng)物模型制備方法研究較多，亦有研究者對(duì)中醫(yī)證候的動(dòng)物模型制備進(jìn)行探索。近年來(lái)，隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的發(fā)展與深入，制備符合中醫(yī)證候特征的病證結(jié)合的動(dòng)物模型，對(duì)于進(jìn)一步揭示證候的物質(zhì)基礎(chǔ)、探求中藥藥物的靶向療效機(jī)制具有較重要的理論指導(dǎo)以及臨床實(shí)際意義。

1 CHF動(dòng)物模型的制備

建立符合人類CHF病理生理過(guò)程且穩(wěn)定的動(dòng)物模型，有助于更好地開(kāi)展本病機(jī)制及藥效的研究。對(duì)于目前本病的防治及新的治療手段的研發(fā)而言，選擇合適的動(dòng)物模型亦極為關(guān)鍵?？傮w而言，CHF的動(dòng)物模型包括心肌缺血型、壓力負(fù)荷型、容量負(fù)荷型和心肌病變型等，能夠較好的復(fù)制本病的病理生理改變[2-3]，制備方法主要有藥物誘導(dǎo)和手術(shù)制備等。

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

對(duì)于每一個(gè)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的模型制備而言，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇都十分重要，亦將直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度及科學(xué)性。

一般而言，選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的原則主要根據(jù)相似性、經(jīng)濟(jì)性、標(biāo)準(zhǔn)化、特殊性、模型化和可重復(fù)性等[4]。CHF的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究所選用的動(dòng)物主要有豬、羊、犬、家兔、大鼠、小鼠等。豬的心血管系統(tǒng)與人類相似，可以較好地反映CHF疾病的分子與生理表型[5]。犬的血液循環(huán)系統(tǒng)發(fā)達(dá)，大鼠體型小、價(jià)格低廉，且易操作，小型嚙齒類動(dòng)物和人類之間的心肌能量代謝、收縮能力等方面也相對(duì)相似[6]，小鼠模型在CHF分子、細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)與藥效學(xué)研究等方面發(fā)揮重要作用[7]，可見(jiàn)各類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有各自的優(yōu)勢(shì)。

總體來(lái)講，較大動(dòng)物的心臟解剖結(jié)構(gòu)雖然更接近人類，但是存在造模成本較高、操作難度較大等問(wèn)題，實(shí)際應(yīng)用較少[8]。CHF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇應(yīng)根據(jù)造模方法(藥物法或手術(shù)法)及其易操作性等來(lái)決定。建立穩(wěn)定且可靠的CHF動(dòng)物模型，成功選擇動(dòng)物、模擬類似人體CHF發(fā)病病理過(guò)程都是關(guān)鍵。一般認(rèn)為，大鼠的電生理特性與人相似，且價(jià)格經(jīng)濟(jì)，便于操作。此外，由于其造模時(shí)間短、模型復(fù)制穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)，研究人員較常應(yīng)用Wistar大鼠于CHF的模型制備[9]。

1.2 藥物誘導(dǎo)制備CHF模型

藥物法制備模型即通過(guò)藥物誘導(dǎo)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物CHF發(fā)生，常用藥物包括阿霉素、異丙腎上腺素、乙醇等。

阿霉素(ADR)是一種廣譜抗腫瘤化療藥物，靜脈注射數(shù)小時(shí)或數(shù)日即可能造成劑量依賴性且不可逆轉(zhuǎn)的慢性的心肌損害作用，進(jìn)而導(dǎo)致CHF[10]。有研究指出ADR這種損傷心肌機(jī)制的發(fā)揮有可能與體內(nèi)自由基的釋放、線粒體的損傷以及代謝失衡相關(guān)[11]。有學(xué)者應(yīng)用腹腔注射ADR的方法制備CHF模型，發(fā)現(xiàn)這種方法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單易行，而且可以較精準(zhǔn)預(yù)測(cè)出CHF出現(xiàn)的時(shí)間。但是同時(shí)因?yàn)锳DR的劑量依賴性，短期內(nèi)較大劑量的腹腔注射給藥，可能會(huì)使動(dòng)物的死亡率增加，導(dǎo)致模型的成功率較低，因此研究者更經(jīng)常使用小劑量/低濃度、多次給藥的方法[12-13]。研究表明應(yīng)用ADR制備的CHF動(dòng)物模型，可出現(xiàn)心室增大、心室壁變薄以及射血分?jǐn)?shù)(LVEF)減低等病變，適合用來(lái)探究心肌病、CHF的發(fā)病機(jī)制，或某一種藥物或治療措施的評(píng)估等。吳慧穎等[14]改變ADR入血方式，采用尾靜脈注射法制備CHF模型，兩周后檢測(cè)心臟指數(shù)、血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)、組織病理學(xué)等指標(biāo)，均提示誘導(dǎo)成功，且未發(fā)現(xiàn)腹水、腹膜腫脹等腹腔刺激的現(xiàn)象，提供了一種簡(jiǎn)單易行的制備方法。近來(lái)，ADR還被運(yùn)用到斑馬魚(yú)胚胎上，建立心臟毒性、心臟損傷模型，進(jìn)而探討其中發(fā)生機(jī)制[15]。

異丙腎上腺素(ISO)屬于β受體激動(dòng)劑，臨床應(yīng)用能提高心率、增加心肌收縮力，如果長(zhǎng)期大量的應(yīng)用可能會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞的纖維化、心肌重構(gòu)，導(dǎo)致CHF的發(fā)生。目前應(yīng)用ISO制備CHF模型有皮下注射和腹腔注射兩種方式，無(wú)創(chuàng)傷，易于重復(fù)且誘導(dǎo)時(shí)間較短，但是，動(dòng)物的批次、給藥途徑的變化以及藥量的差異都會(huì)影響模型制備的效果，所以實(shí)際制備的時(shí)候必須進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，最終確定實(shí)際的實(shí)驗(yàn)方案。ISO誘導(dǎo)CHF的模型主要是模擬交感神經(jīng)興奮進(jìn)而引發(fā)CHF的病理過(guò)程，實(shí)際經(jīng)常用于治療藥物的篩選以及藥效發(fā)揮和交感神經(jīng)興奮或抑制的相關(guān)性等實(shí)驗(yàn)中。羅時(shí)珂等[16]實(shí)驗(yàn)探討皮下注射ISO制備CHF大鼠模型的有效劑量。給藥4周后，觀察大鼠左室收縮末期內(nèi)徑、血清腦鈉肽(BNP)水平、心臟指數(shù)以及死亡率等指標(biāo)的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CHF的大鼠模型制備以皮下注射ISO 2.5 mg/(kg·d)較為合適。 另外，王洋等[17]通過(guò)對(duì)ISO誘導(dǎo)造模的CHF大鼠給藥氧化苦參堿，發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿可以逆轉(zhuǎn)肌鈣蛋白I水平的異常增加，改善左心室重構(gòu)，明顯改善ISO導(dǎo)致的心肌損傷等病理改變等。

此外，還有研究者應(yīng)用乙醇誘導(dǎo)制備CHF模型。乙醇中毒會(huì)導(dǎo)致乙醇及其代謝物沉積在血中，致心肌細(xì)胞凋亡、使心肌收縮力減弱，左心房靜息后的增強(qiáng)效應(yīng)受到抑制，損傷心血管，最終導(dǎo)致CHF。乙醇誘導(dǎo)CHF模型的作用機(jī)制可能與興奮交感神經(jīng)系統(tǒng)、腎素-血管緊張素-醛固酮(RAAS)系統(tǒng)、損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞以及加劇細(xì)胞凋亡等有關(guān)[18]。這種方式造模的誘導(dǎo)時(shí)間雖然較長(zhǎng)，但是以恒速進(jìn)行靜脈注射的話，則可控性良好。劉昊琛等[19]曾對(duì)家兔恒速、頸外靜脈注射乙醇，結(jié)果發(fā)現(xiàn)造模后，家兔的動(dòng)脈收縮壓、舒張壓、左室收縮壓以及左室內(nèi)壓上升與下降的最大速率均明顯下降，而且心肌的病理變化符合CHF的病理特征，值得進(jìn)一步探索研究。

1.3 手術(shù)制備CHF動(dòng)物模型

目前常用于CHF動(dòng)物模型制備的手術(shù)方法包括腹主動(dòng)脈縮窄法與左前降支冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法等。

應(yīng)用腹主動(dòng)脈縮窄法來(lái)建立CHF模型，是應(yīng)用注射針頭或者縮窄環(huán)類等工具，結(jié)扎部分腹主動(dòng)脈，促使主動(dòng)脈縮窄，進(jìn)而使外周循環(huán)阻力增加，最終導(dǎo)致壓力超負(fù)荷CHF的方法[20]。這種造模方法在CHF的基礎(chǔ)性研究中已經(jīng)有較長(zhǎng)時(shí)間的應(yīng)用，手術(shù)方法較為簡(jiǎn)單，模型亦確切，是研究CHF發(fā)病以及病理變化機(jī)制、藥物療效等常用且較理想的模型制備方法。對(duì)于這種方法而言，動(dòng)脈的縮窄程度影響著心臟的損傷程度，有研究表明，7號(hào)注射針頭可造成Wistar或SD大鼠約70%～80%的腹主動(dòng)脈縮窄[21]；8號(hào)注射針頭則能造成50%～60%的腹主動(dòng)脈縮窄[22]；而9號(hào)針頭可使得動(dòng)物腹主動(dòng)脈縮窄減少達(dá)到35%～50%[23]。

左前降支冠狀動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)是通過(guò)手術(shù)，結(jié)扎動(dòng)物的左冠狀動(dòng)脈或左前降支及左旋支，導(dǎo)致心肌缺血，誘發(fā)心肌重構(gòu)，最終導(dǎo)致左心衰竭。這種造模方法的操作難度比較大，需要經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期訓(xùn)練的實(shí)驗(yàn)人員才能熟練掌握。此外，采用這種方法制備CHF模型時(shí)，需結(jié)合彩超檢測(cè)心功能指標(biāo)、心肌組織病理學(xué)分析，進(jìn)而觀察動(dòng)物心室重構(gòu)、心肌纖維化甚或心肌梗死的程度。辛偉等[24]通過(guò)在小型豬冠狀動(dòng)脈前降支的近端放置Ameroid縮窄環(huán)的方法，較為成功地制備慢性心肌缺血性的CHF動(dòng)物模型。對(duì)于在不同位置結(jié)扎冠狀動(dòng)脈對(duì)大鼠CHF模型的影響，陳劍等[25]研究發(fā)現(xiàn)，進(jìn)針深度約0.5 mm左右，常規(guī)位結(jié)扎(距左冠狀動(dòng)脈開(kāi)口2 mm)可導(dǎo)致較大心肌梗死的面積、較顯著的血液動(dòng)力學(xué)改變及CHF等病理變化，但是造模的死亡率較高，達(dá)33%～60%左右。采用較低位置(6 mm)結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈的方法則能提高模型的存活率到85.7%左右，明顯節(jié)約實(shí)驗(yàn)的工作量且節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本，值得推廣應(yīng)用。

2 CHF中醫(yī)證候動(dòng)物模型的制備

隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的不斷深入，單純的疾病動(dòng)物模型遠(yuǎn)不能滿足基礎(chǔ)研究的需要。中醫(yī)證候的動(dòng)物模型研究是從糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的陽(yáng)虛證動(dòng)物模型開(kāi)始，模型的評(píng)價(jià)可由動(dòng)物的四診表征即癥狀和體征反映。比如根據(jù)模型動(dòng)物毛發(fā)缺少色澤、蜷縮弓背、活動(dòng)力差、懶動(dòng)喜臥、行動(dòng)緩慢等評(píng)價(jià)為腎陽(yáng)虛證[26]。這種評(píng)價(jià)方法雖然可直觀反映動(dòng)物狀態(tài)，且貼近中醫(yī)臨床辨證方法。易受主觀因素影響、動(dòng)物在行為表現(xiàn)等方面與人類存在差異，導(dǎo)致四診信息的采集準(zhǔn)確性受到影響。

此外，中醫(yī)證候的動(dòng)物模型研究至今雖已達(dá)幾十年之久，但是從中醫(yī)學(xué)研究的趨勢(shì)來(lái)看，單純的證候模型缺乏對(duì)疾病完整性的反映，且證候的致病因素較易消減，而病證結(jié)合的思路則可以較好地彌補(bǔ)這一不足，有研究人員從病證結(jié)合角度提出綜合評(píng)價(jià)復(fù)合模型的中醫(yī)證候指標(biāo)及微觀免疫學(xué)指標(biāo)，制備免疫力低下復(fù)合證候動(dòng)物模型用于現(xiàn)代免疫學(xué)及中醫(yī)學(xué)的相關(guān)研究[27]。

有關(guān)CHF中醫(yī)證候的動(dòng)物模型研究，蔡虎志等[28]認(rèn)為建立CHF心陽(yáng)虛證的病證結(jié)合動(dòng)物模型，可以應(yīng)用臨床醫(yī)學(xué)的疾病模型與中醫(yī)的證候模型相互結(jié)合的方式，并通過(guò)客觀指標(biāo)檢測(cè)與藥物反證等確定，但是在如何選擇客觀指標(biāo)與反證藥物方面仍需大量探索與實(shí)踐。童妍[29]選取雄性SD大鼠，腹腔注射ADR 4 mg/kg，每周1次，連續(xù)6周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組大鼠動(dòng)脈收縮壓、舒張壓、左室收縮內(nèi)壓顯著下降，左室舒張末壓明顯增高，左室內(nèi)壓、左室壓力最大上升及下降速度顯著減小，且出現(xiàn)精神不振、多蜷縮、反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)、進(jìn)食減少，豎毛且毛發(fā)無(wú)光澤、拱背、小便量多、大便稀薄等陽(yáng)虛癥狀，進(jìn)而提出這種方法可以制備CHF心陽(yáng)虛證大鼠模型。趙明鏡等[30]提出CHF心氣虛證的病證結(jié)合動(dòng)物模型的制備思路，認(rèn)為心肌缺血冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法造成心氣虛證的動(dòng)物模型符合臨床流行病學(xué)、研究報(bào)告及實(shí)驗(yàn)研究的成果，并通過(guò)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般情況，如體重變化、飼料的消耗、活動(dòng)能力、精神體能、毛發(fā)情況等，定性角度來(lái)評(píng)價(jià)該模型的證候?qū)傩浴?/p>

可見(jiàn)，有關(guān)CHF中醫(yī)動(dòng)物模型的制備研究不多，可復(fù)制性與推廣性更是少之又少，研究人員提出較多思路，為更深入、更適宜的制備方法探索提供參考。

3 基于病證結(jié)合的CHF中醫(yī)證候動(dòng)物模型的研究與展望

CHF的病因與發(fā)病機(jī)制紛繁復(fù)雜，動(dòng)物模型的制備方式亦是多種多樣。隨著人們對(duì)中醫(yī)藥防治CHF機(jī)制研究的關(guān)注與深入，符合中醫(yī)學(xué)特色和臨床實(shí)際要求的，CHF病證結(jié)合動(dòng)物模型亟待全面建立與發(fā)展。病證結(jié)合是中醫(yī)證候研究的指導(dǎo)原則，是故建立具有臨床中醫(yī)證候特征的病證結(jié)合的動(dòng)物模型，對(duì)探究中醫(yī)證候的物質(zhì)基礎(chǔ)、深入了解中醫(yī)藥療效發(fā)揮機(jī)制等均有重要的意義。

本課題組長(zhǎng)期致力于CHF的基礎(chǔ)與臨床研究，較早地建立了兔氣虛血瘀型CHF動(dòng)物模型[31]，結(jié)果證實(shí)模型組動(dòng)物在發(fā)生心肌形態(tài)學(xué)改變的基礎(chǔ)上有顯著的血流動(dòng)力學(xué)異常，符合CHF的特點(diǎn)；同時(shí)模型組動(dòng)物具有符合中醫(yī)氣虛血瘀證的表現(xiàn)，存在血瘀證的客觀指標(biāo)，為之后的深入研究打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

我們認(rèn)為，病證結(jié)合動(dòng)物模型應(yīng)該能夠較好地體現(xiàn)中醫(yī)對(duì)疾病發(fā)展規(guī)律的認(rèn)識(shí)以及中醫(yī)證候的階段性特征，即西醫(yī)的病和中醫(yī)的證相結(jié)合或一體化共存的模型。無(wú)論是西醫(yī)的疾病抑或是中醫(yī)的證候，對(duì)于一個(gè)患者而言，出現(xiàn)的是同一種病理表現(xiàn)，雖然西醫(yī)與中醫(yī)的辨病、辨證理論體系大相徑庭，但由于研究?jī)?nèi)容與目的相同，必然存在相通之處。

基于此，筆者認(rèn)為首先要建立確切的CHF動(dòng)物模型，通過(guò)四診信息的判定、對(duì)標(biāo)病因病機(jī)、客觀指標(biāo)協(xié)同、治法方藥的反證等，同時(shí)結(jié)合動(dòng)物實(shí)際表現(xiàn)等評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，共同來(lái)證明疾病模型確立后所表現(xiàn)出的中醫(yī)證候類型，即為CHF病證結(jié)合的動(dòng)物模型。這種動(dòng)物模型的干預(yù)因素相對(duì)較少，病理機(jī)制較單一，用之開(kāi)展實(shí)驗(yàn)研究可保證研究結(jié)果的可靠性，而且結(jié)合中醫(yī)學(xué)特色，證明為與該疾病模型聯(lián)系最為直接的證候。在這個(gè)思路指導(dǎo)下，課題組在帕金森病(PD)病證結(jié)合動(dòng)物模型的制備方面持續(xù)深入探究，通過(guò)模擬病因(6-羥基多巴胺立體注射于大鼠右側(cè)紋狀體)、模擬癥狀(對(duì)照震顫、肌強(qiáng)直、二便、舌象等臨床癥狀，推斷PD模型大鼠的證候?qū)傩?、客觀指標(biāo)驗(yàn)證(氧化應(yīng)激狀態(tài))、藥物反證(天麻鉤藤飲、桃紅四物湯、滌痰湯等)，較早制備了陰虛動(dòng)風(fēng)證PD病證結(jié)合大鼠模型，證實(shí)模型具有疾病和證候的雙重特征，并從不同時(shí)間點(diǎn)，從功能、細(xì)胞、蛋白、分子生物學(xué)角度持續(xù)進(jìn)行深入的生物學(xué)基礎(chǔ)與藥效研究[32]。目前我們也在通過(guò)不同的中藥藥物驗(yàn)證，摸索制備CHF常見(jiàn)證候的病證結(jié)合動(dòng)物模型。

總而言之，CHF病證結(jié)合的動(dòng)物模型是本病中醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)研究的重要前提與保障。眾所周知，動(dòng)物模型用于實(shí)驗(yàn)研究，不能完全復(fù)制出疾病的自然發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，且每種方法制備的模型都具有各自的優(yōu)勢(shì)和局限性。我們應(yīng)該不脫離中醫(yī)學(xué)的理論指導(dǎo)以及研究思路，同時(shí)結(jié)合自身研究項(xiàng)目的需求，權(quán)衡利弊，選擇較適宜的模型制備方法。我們研究發(fā)現(xiàn)，CHF臨床上的中醫(yī)證候呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)演變的趨勢(shì)，早中晚期都有不同的證候類型，這一結(jié)論亦影響著CHF病證結(jié)合動(dòng)物模型的制備，即要考慮時(shí)間因素導(dǎo)致的動(dòng)態(tài)證候，在實(shí)際操作過(guò)程中納入時(shí)間因素、控制影響因素，盡量提高模型成功率，保證其可復(fù)制性，為之后的基礎(chǔ)與臨床研究夯實(shí)基礎(chǔ)。