子宮內(nèi)膜異位癥小鼠模型研究進展

孟鑫，陳景偉

(河北中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，中西醫(yī)結(jié)合研究所，河北省中西醫(yī)結(jié)合肝腎病證研究重點實驗室，石家莊 050200)

EMs是一種常見的婦科疾病，以盆腔疼痛、不孕、盆腔包塊為主要臨床表現(xiàn)[1]。迄今為止，該病的發(fā)病機制尚未明確，其臨床藥物療效和手術(shù)治療效果也欠佳，由于倫理道德等多方面現(xiàn)實原因的限制，在人體進行其發(fā)病機制和治療方法的各項研究存在一定的局限性。動物實驗為研究EMs提供了極大便利，逐漸成為了研究該病的重要手段。目前，已經(jīng)成功建立了非人靈長類、家兔、鼠類及雞胚絨毛尿囊膜等的EMs動物模型[2]。本文將從各類小鼠的造模方法、模型評價等方面作出較為綜合的闡述及比較，以便研究者可以據(jù)此選擇更貼合實驗的造模方法。

1 發(fā)病機制

目前為止，國內(nèi)外較為公認的發(fā)病機制有經(jīng)血逆流學(xué)說、化生學(xué)說、轉(zhuǎn)移學(xué)說、新生兒宮血學(xué)說[3]。經(jīng)血逆流學(xué)說認為有活性的子宮內(nèi)膜組織碎片經(jīng)輸卵管逆行至腹腔，并種植生長于盆腹腔或卵巢等其他組織上。該學(xué)說目前最為廣泛接受，但依然不能完全解釋EMs的發(fā)病原因，因此，在此基礎(chǔ)上，郎景和[4]提出了“在位內(nèi)膜決定論”，認為個體在位子宮內(nèi)膜的生物學(xué)特性是其能否種植生長在其他部位的決定因素。化生學(xué)說認為異位子宮內(nèi)膜細胞來自于其他組織的化生；轉(zhuǎn)移學(xué)說認為組織碎片是經(jīng)血管或淋巴管轉(zhuǎn)移至其他部位并種植生長；新生兒宮血學(xué)說提出母體激素在新生兒出生后的減少導(dǎo)致了子宮出血，部分子宮出血逆流到腹腔，其中可能含有干細胞[5]。除此之外，中醫(yī)認為瘀血是EMs的基本病因病機，瘀血阻滯，氣血運行不暢是導(dǎo)致EMs的基本病因[1]。盡管各學(xué)說眾說紛紜，但其發(fā)病機制依然不明確，因此，選擇合理的動物模型就成為了研究其發(fā)病機制的首要任務(wù)。

2 動物的選擇

目前的動物造模方法都基于經(jīng)血逆流學(xué)說，主要包括自發(fā)性、誘發(fā)性(自體移植)和種植性(異體移植)三種[6]。自發(fā)性主要應(yīng)用于非人靈長類動物[7]，如獼猴、狒狒和帶尾纖獼猴，因其具有類似于人類的盆腔解剖結(jié)構(gòu)和有規(guī)律的月經(jīng)周期，可以自發(fā)形成EMs，是研究EMs發(fā)病機制及治療的理想方案。但因為靈長類動物價格昂貴，自發(fā)性造模成功率低，周期長等原因無法普及。誘發(fā)性主要適用于兔、鼠等嚙齒類動物，種植性則多見于裸小鼠、SCID小鼠等。但因為嚙齒類動物與人類之間有種屬差異性，其實驗結(jié)果可能與臨床存在一定偏差。

在眾多動物中，嚙齒類動物中的小鼠因其價格便宜，體型嬌小，飼養(yǎng)管理方便，生長繁殖速度快，并且已經(jīng)培育出了大量的近交系、突變系和封閉群，成為了EMs研究的主要選擇，不僅可以用于EMs發(fā)病機制的研究，還可用于研究藥物對EMs的影響作用，為EMs的實驗研究作出了巨大貢獻。

3 造模方法及小鼠的選擇

3.1 術(shù)前處理

使實驗小鼠處于統(tǒng)一的動情周期，常用的方法為連續(xù)陰道涂片法[8]和直接給予外源性雌激素法[9](灌胃或肌注戊酸雌二醇、苯甲酸雌二醇、乙烯雌酚等)，但在操作過程中發(fā)現(xiàn)使大量的實驗動物都處于統(tǒng)一的動情周期無疑加大了實驗的難度與耗損。張薇等[10]分別選擇在SD大鼠的動情期和非動情期進行自體移植術(shù)以建立EMs模型，發(fā)現(xiàn)非動情期和動情期的造模率及異位灶體積無顯著差異。陳瓊?cè)A等[11]通過建立BALB/C小鼠EMs模型并觀察同樣發(fā)現(xiàn)小鼠的造模成功率與其所處的動情周期無關(guān)。這一結(jié)果在簡化造模實驗、節(jié)約時長、節(jié)省資源等方面均具有重要意義。

3.2 造模方法

EMs小鼠的造模方法主要包括自體移植、同種異體移植和異體移植。

3.2.1 自體移植

即手術(shù)縫合法[12]，選取尿道口上方2 cm處沿腹部正中線縱行切開，找到左側(cè)子宮，于近卵巢端結(jié)扎子宮兩端，剪下中間段，剪除其他多余組織血管后縱行剪開，將其內(nèi)膜面貼于小鼠腹腔壁上，并將子宮對角縫合固定，完成后關(guān)腹并進行后續(xù)操作。王智超[13]通過分別移植到小鼠腹壁內(nèi)側(cè)、大網(wǎng)膜及腸壁三個部位來比較異位灶種植成功率，最終結(jié)果表明三者的種植率無明顯差異，研究者可根據(jù)各自的研究目的選擇最佳的種植部位。

3.2.2 同種異體移植

即腹腔注射法[14]，將小鼠分為供體組和受體組，將供體小鼠脫頸處死，剖開腹部，取出子宮，除去其多余組織后沿Y型子宮正中線剪開，分別放入生理鹽水中，縱行切開暴露出子宮內(nèi)膜后，用眼科剪將其剪碎至1 mm3大小的小碎片。取受體小鼠，用16號針頭注射器將含有子宮碎片的1 mL生理鹽水注射至受體小鼠腹腔內(nèi)，進針點選取受體小鼠的小腹部偏腹中線0.5 cm處的左下腹，一只供體小鼠子宮平分給兩只受體小鼠。關(guān)于注射量，徐建波[15]進行了階梯性注射實驗，分別向受體小鼠注射1、2、4、8、16、32 片 1 mm2大小的子宮內(nèi)膜碎片觀察，結(jié)果表明異位灶的成活率與注射量呈一定的曲線關(guān)系，當(dāng)注射量≥4片時，注射量與成活率無顯著關(guān)系。

3.2.3 異體移植

異體移植是指將人子宮內(nèi)膜組織植入到動物體內(nèi)加以研究觀察，由于裸鼠和SCID小鼠屬于免疫缺陷小鼠，不會發(fā)生異體移植的免疫排斥反應(yīng)，種植的成功率較高，被作為異體移植的首選。其造模方法包括腹腔種植法、腹腔注射法和皮下種植法。

腹腔種植法[16]：將新鮮的人子宮內(nèi)膜組織標本置入含DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，后用冷的0.1 mol/L的無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3～4次，于無菌培養(yǎng)皿中將組織剪至2 mm×3 mm大小的碎塊，分為每組約8～10個小碎塊，分別放入PBS中。取麻醉后的裸鼠于下腹正中橫切約1 cm的切口，將處理好的一組碎塊隨機放置盆腹腔內(nèi)的不同位置后，逐層關(guān)腹。

腹腔注射法[17]：人子宮內(nèi)膜組織的準備清洗同上，將組織剪至0.5～1 mm2大小的碎片，平均分至PBS中。選取SCID小鼠下腹正中部位為進針點行腹腔穿刺，用16號針頭注入含有組織碎片的PBS液0.2 mL后，按壓片刻，防止液體流出。

皮下種植法[18]：將準備好的人子宮內(nèi)膜組織用無菌PBS清洗3～4次，剪至1 mm2大小的碎片，平均放置于含有DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中混勻。用9號針頭將含有內(nèi)膜組織碎片的培養(yǎng)液按每只0.5 mL注入，裸鼠可選取背部皮下方便后續(xù)觀察，SCID小鼠則選取下腹部皮下，以腹部中線臍下為進針點。

3.3 各造模方法優(yōu)缺點比較

EMs動物模型對研究其發(fā)病機制及臨床治療具有重大價值，其造模方法逐漸實現(xiàn)了由自發(fā)到誘發(fā)，有創(chuàng)到無創(chuàng)的進化，盡管如此，現(xiàn)有的造模方法仍然都存有各自的不足之處，因此，以實驗?zāi)康暮涂尚行宰鳛檫x擇條件，綜合權(quán)衡各種模型方法的利弊，才能充分發(fā)揮不同造模方法的優(yōu)勢。常用的幾種建立小鼠EMs模型方法的優(yōu)缺點比較見表1。

3.4 小鼠的選擇

隨著實驗小鼠培育技術(shù)的提升，小鼠的品種逐漸豐富，更大地滿足了實驗的需求，結(jié)合實驗?zāi)康?、操作技術(shù)及環(huán)境因素選擇最佳的實驗小鼠，可以進一步提高造模的成功率及實驗的準確性。目前，用于建立EMs模型的小鼠品種，優(yōu)缺點及各自適用的造模方法詳見表2。

4 模型評價

4.1 模型建立成功標準

肉眼可以觀察到異位灶體積增大，呈透明囊狀，內(nèi)有黃色液體，異位灶表面可看到新生的細小血管。顯微鏡下可見異位灶中含有子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)細胞，囊液內(nèi)和間質(zhì)層可見到炎癥細胞[19]。

4.2 觀察指標及方法

4.2.1 大體觀察

肉眼觀察小鼠的精神狀態(tài)，毛色質(zhì)量，飲食情況及活動變化；采用皮下種植法時要觀察皮下異位灶結(jié)節(jié)的大小，生長情況。處死開腹探查時，觀察異位灶生成情況，形態(tài)，位置，有無粘連等，并用雙腳規(guī)測量異位灶體積大小。

4.2.2 組織學(xué)觀察

取異位灶進行HE染色鏡下觀察及免疫組化觀察，可直接觀察異位灶組織細胞形態(tài)，為EMs的發(fā)展、惡化提供了病理學(xué)依據(jù)。

4.2.3 影像學(xué)觀察

影像學(xué)觀察包括MRI、超聲等都在EMs動物模型研究中有所應(yīng)用，影像學(xué)檢查可以通過圖像來直觀的獲取所需信息，并可直接進行數(shù)據(jù)分析，有效地避免了動物死亡，減少了動物的應(yīng)激反應(yīng)。但該方法因其價格昂貴，在實驗中未得到廣泛普及。

表1 建立EMs小鼠模型方法優(yōu)缺點比較Table 1 Advantages and disadvantages of the mouse model of EMs

表2 實驗常用小鼠的優(yōu)缺點及適用造模方法Table 2 Advantages and disadvantages of mouse and the applicable modeling are commonly used in experiments

4.2.4 熒光染色法觀察

熒光染色是一種活體成像技術(shù)，可應(yīng)用慢病毒載體將熒光素酶和紅色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)入內(nèi)膜組織并注入裸鼠體內(nèi)，利用活體成像儀來實時監(jiān)測造模情況及疾病進展情況[20]。該方法不僅實現(xiàn)了無創(chuàng)監(jiān)測，而且定位更加準確，最大限度地避免動物死亡所帶來的實驗耗損，具有很高的優(yōu)越性。

4.3 造模周期

關(guān)于小鼠EMs造模的最佳周期，現(xiàn)階段國內(nèi)外的研究結(jié)果各不統(tǒng)一，不同的研究者選擇的時間也不盡相同。徐建波[15]通過建立C57BL/6小鼠EMs模型研究，表明異位灶的重量在第5天趨于穩(wěn)定，大小在第9天也達到穩(wěn)定，故提示第9天可能為最佳觀察時間。陳瓊?cè)A等[11]從異位灶大小、分布及BALB/C小鼠的體重方面研究發(fā)現(xiàn)第4天與第21天無明顯差異，提示第4天便是最佳觀察時間。王智超[13]研究KM小鼠造模時間表明在術(shù)后第2周模型既已建立成功，但異位灶體積在第4周處于最大。任旭等[18]通過研究SCID小鼠造模發(fā)現(xiàn)模型在術(shù)后第2周已成功，且第2周與第4周異位灶體積無明顯差異，但于第6周出現(xiàn)異位灶體積縮小現(xiàn)象。綜上所述，目前小鼠異位灶模型的最佳造模周期并不統(tǒng)一，研究過程中觀察指標只有異位灶體積及重量，不能全面地反應(yīng)模型的生長情況。由此可見，EMs造模的最佳周期，以及其時間是否與小鼠種類不同而存在差異性等問題仍然需要進一步深入研究。

5 模型的發(fā)展與優(yōu)化

5.1 EMs合并癥模型的建立

EMs作為一個復(fù)雜的婦科疾病，其機理，癥狀表現(xiàn)涉及多個方面，主要癥狀表現(xiàn)為不孕，疼痛；其病變過程還包括炎癥，纖維化等多方面的共同作用?，F(xiàn)階段的動物模型是否可以用于某一方面的深入研究，需要我們在此基礎(chǔ)上進一步評價與發(fā)展。

EMs不孕模型：崔陽陽等[21]采用“腹腔 +皮下”注射法建立EMs小鼠模型并通過生育功能檢測，證實了模型小鼠的生殖能力較正常小鼠低下。王汝倩等[22]采用了供體小鼠模擬經(jīng)期內(nèi)膜的方法，以腹腔注射法建立EMs小鼠模型后，再以2∶1的機率與雄鼠合籠，得到不孕小鼠，成功建立EMs不孕小鼠模型。

EMs疼痛模型：陳景偉等[12]采用自體移植法成功復(fù)制小鼠EMs模型，于術(shù)后連續(xù)灌胃補佳樂12 d后，腹腔注射縮宮素，通過觀察其小鼠的扭體反應(yīng)建立了EMs痛經(jīng)模型，為EMs疼痛的研究提供了理想的動物模型。

EMs纖維化模型：鎖漉萱等[23]采用腹腔注射法成功復(fù)制EMs小鼠模型后，用Masson染色法分別檢測小鼠造模后第7、14、21天的異位病灶和在位內(nèi)膜纖維化程度，發(fā)現(xiàn)于造模后第14天纖維化面積比率達到最佳。路攀等[16]用腹腔種植法復(fù)制人EMs裸鼠模型并觀察后，同樣于造模后第14天發(fā)現(xiàn)難以分離的致密粘連，可見EMs小鼠模型建立后14 d即可作為研究EMs纖維化機制的可靠動物模型。

5.2 中醫(yī)病證結(jié)合模型的建立

辨證論治是中醫(yī)理論體系重要的組成部分，為了更好的從中醫(yī)傳統(tǒng)理論角度認識EMs的發(fā)病機制及探究中醫(yī)藥治療EMs的作用機理，單純的EMs動物模型已不能滿足實驗需要，因此，開展中醫(yī)病證結(jié)合EMs動物模型的研究勢在必行。

氣滯血瘀型EMs模型：王哲等[24]在自體移植的造模術(shù)后1周采用了：(1)腎上腺素皮下注射；(2)食用油灌胃；(3)在夾子上貼附紗布并夾小鼠尾部，每次 5 min；(4)45°傾斜鼠籠 2 h；(5)束縛大鼠，限制其自由2 h；(6)冰水浴5 min；(7)禁食水1 d；(8)晝夜顛倒1 d。每天隨機選擇以上3種方法干預(yù)并觀察兩周，成功用藥物加情志刺激干預(yù)方法建立了氣滯血瘀的EMs模型，實驗動物出現(xiàn)精神活躍，脾氣暴躁，易激惹等氣滯癥狀，血清CA125值升高，提示造模成功。鏡下觀察可見異位灶內(nèi)膜上皮細胞扁平，積層較薄，結(jié)構(gòu)不清的組織病理學(xué)改變。

寒凝血瘀型EMs模型：孫博等[25]在自體移植術(shù)1周后，將其置于0～1℃冰水混合物中浸泡20 min，連續(xù)2周成功建立了寒凝血瘀小鼠模型。周世卿等[26]則采用鹽酸腎上腺素皮下注射加冰水浸泡的方法成功建立了寒凝血瘀的裸鼠模型。實驗動物出現(xiàn)精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，易扎堆等寒邪致病癥狀，耳唇、爪甲、尾部暗淡，舌質(zhì)紫暗，舌下脈絡(luò)增粗等血瘀癥狀，結(jié)合血液流變學(xué)和凝血功能指標的變化提示造模成功。鏡下觀察可見異位灶內(nèi)膜上皮細胞呈柱狀排列，偶有假復(fù)層結(jié)構(gòu)，上皮細胞層較薄，間質(zhì)細胞明顯增多，腺體數(shù)量增多，腺上皮呈立方排列，且血管豐富。

腎陽虛血瘀型EMs模型：賈云波等[27]先在大鼠籠中放入一定量的冰水，置于4℃冰箱20 min，每天2次，1個月后行自體移植術(shù)，術(shù)后再次重復(fù)術(shù)前的冷凍行為成功建立了虛寒型EMs模型。實驗動物出現(xiàn)體溫降低，動情周期紊亂，反應(yīng)遲鈍，倦縮懶動，大便溏等虛寒癥狀，結(jié)合臟器指數(shù)、激素水平均降低的結(jié)果提示造模成功。鏡下觀察可見異位內(nèi)膜較厚，腺體不明顯，管腔消失，炎癥細胞增多，細胞排列不整齊[28]。

以上三個證型目前已有發(fā)展，但依然有許多中醫(yī)理論和問題無法在實驗中體現(xiàn)，此外，還有濕熱、痰瘀等等中醫(yī)表現(xiàn)暫不能實現(xiàn)，EMs的中醫(yī)病證結(jié)合模型仍需進一步研究發(fā)展與完善。

5.3 特殊動物模型的建立與應(yīng)用

5.3.1 基因敲除小鼠EMs模型的建立

通過基因敲除技術(shù)建立轉(zhuǎn)基因動物模型近年來也逐漸在EMs研究過程中備受關(guān)注，基因敲除技術(shù)是利用一定的生物手段，允許特定的目的基因缺失或失活，對敲除的基因進行有效的控制，從而排除其他因素對實驗結(jié)果的干擾，使實驗結(jié)果變得更加可靠和直觀[29]?；蚯贸∈蠹夹g(shù)是指通過基因工程的辦法使小鼠體內(nèi)某種基因功能缺失的生物技術(shù)[30]。宮庭鈺等[31]應(yīng)用雌激素受體β基因敲除小鼠結(jié)合自體移植法建立了EMs模型；Burns等[32]分別用IL-6基因敲除小鼠和ER基因敲除小鼠結(jié)合腹腔注射法成功構(gòu)建了EMs模型。應(yīng)用基因敲除小鼠建立EMs模型，有利于了解已知基因在EMs形成過程中的作用及與相關(guān)因子之間的關(guān)系，為明確EMs發(fā)生發(fā)展的影響因素提供科學(xué)的實驗數(shù)據(jù)，為臨床合理選擇有效的治療藥物提供靶向依據(jù)。

5.3.2 毒物暴露動物模型的建立及應(yīng)用

EMs是一種多因素復(fù)雜的疾病，受到多種因素的互相影響與調(diào)控，根據(jù)近年來相關(guān)的流行病學(xué)調(diào)查和實驗依據(jù)發(fā)現(xiàn)，暴露于具有內(nèi)分泌干擾作用的環(huán)境毒物之下可能在其發(fā)病機制中發(fā)揮了一定的作用[33]，因此建立可靠的EMs毒物暴露動物模型是獲得準確研究結(jié)果的首要條件。崔照領(lǐng)等[34]采用灌胃強飼的方法使受孕雌鼠暴露于TCDD中并產(chǎn)下子鼠，再采用自體移植法建立子鼠EMs模型，成功構(gòu)建了二惡英暴露的EMs小鼠模型；Bruner-Tran等[35]采用了宮內(nèi)+哺乳期暴露模式直接暴露雌鼠胎兒及其生殖細胞，成功培育出毒物暴露小鼠并進一步研究了暴露毒素在EMs中的潛在機制。越來越多的研究表明，EMs的多基因遺傳易感性與環(huán)境因子有關(guān)[36]，毒物暴露小鼠模型的建立及應(yīng)用可以更好地研究環(huán)境、內(nèi)分泌因素與遺傳因素在EMs病因?qū)W中的相互密切關(guān)系，為探索EMs的機制與治療提供了新的思路。

6 總結(jié)與展望

EMs作為一種復(fù)雜的婦科疾病一直以來都是研究的焦點，雖然隨著動物模型的不斷發(fā)展與完善，為EMs發(fā)病機制，治療等方面的認識提供了很大幫助，但由于該病很多方面的研究依然不甚完善，故而在未來的研究中，動物模型的創(chuàng)新與選擇仍是實驗的重要且首要部分。小鼠構(gòu)建的模型因小鼠的各種優(yōu)點而具有較其他動物的優(yōu)越性，操作方便，成功率高，已然成為了眾多實驗的首選。盡管如此，現(xiàn)階段各種小鼠模型中仍舊存在著不可避免的不足之處，限制了EMs的研究進展，故各研究者應(yīng)該根據(jù)其研究目的，綜合衡量考慮，充分發(fā)揮各種模型的最優(yōu)點，選擇最合適的模型，以便更好的研究中醫(yī)藥治療EMs的作用機理，為中醫(yī)藥治療EMs提供客觀依據(jù)。