碳纖維微電極負載金納米粒子用于蘆薈多糖的在體動態(tài)監(jiān)測

王婷婷, 李 元, 楊莉莉, 鮑昌昊, 程 寒,2

(1. 中南民族大學(xué)藥學(xué)院, 2. 民族藥學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心, 武漢 430074)

中國蘆薈又稱作斑紋蘆薈, 其作為藥用植物被載入中國藥典[1～4]. 蘆薈有500多個品種, 可藥用的達50余種[5]. 其味苦性寒, 歸肝經(jīng)、 心經(jīng)、 胃經(jīng)、 大腸經(jīng), 可以治療肝火頭疼、 目赤腫痛、 熱解便秘、 燙傷、 咳嗽, 也可美容, 臨床應(yīng)用于五官科、 內(nèi)科, 外科及腫瘤科等[6～8]. 研究證明蘆薈多糖是蘆薈的主要有效成分之一[9], 具有殺菌消炎[10]、 抗病毒[11]、 抗胃潰瘍[12]、 抗腫瘤[13]和免疫調(diào)節(jié)等作用[14], 因此蘆薈多糖成為蘆薈產(chǎn)品研發(fā)關(guān)注的重點. 近年來, 蘆薈在醫(yī)藥、 美容和日用品等方面應(yīng)用廣泛, 但針對蘆薈多糖合成水平的監(jiān)測技術(shù)相對薄弱[15], 因此, 有必要建立操作簡便的蘆薈多糖測定方法, 便于檢測蘆薈的生長狀況及考查蘆薈原料的質(zhì)量. Lin等[16]采用苯酚-硫酸顯色反應(yīng)法和電化學(xué)差示脈沖伏安法測定了蘆薈不同部位的多糖含量; 佘曉雷等[17]采用精制蘆薈多糖測得蘆薈多糖對葡萄糖的換算因子, 樣品經(jīng)前處理除雜質(zhì), 用苯酚-硫酸法測定蘆薈中多糖的含量; 程萬清等[18]采用分光光度法測定蘆薈樣品中蘆薈多糖的含量, 但上述方法均無法實現(xiàn)對在體蘆薈植株中蘆薈多糖的動態(tài)監(jiān)測.

碳纖維具有質(zhì)量輕、 尺寸小、 比表面積大、 吸附性好及電化學(xué)性能穩(wěn)定等優(yōu)點, 是優(yōu)良的電極材料[19,20]. 在生物分析領(lǐng)域, 碳纖維微電極(CFME)可以實現(xiàn)細胞胞內(nèi)及胞間生物因子的無損分析, 為在體實時動態(tài)監(jiān)測蘆薈多糖因子水平提供了更加高效、 準確的技術(shù)方法和手段. 納米材料修飾電極具有更高的靈敏度, 同時能更好地消除共存組分的干擾, 提高檢測選擇性[21,22].

使用活體檢測技術(shù)對生物體內(nèi)組分進行快速檢測, 能夠更準確地反映活體生物體內(nèi)目標分析物的真實水平[23]. 與通常的離體分析過程相比, 活體檢測技術(shù)將采樣與檢測過程集成為一步, 顯著提高了活體生物分析的效率. 在活體分析領(lǐng)域, 基于相關(guān)電化學(xué)檢測動力學(xué)理論的發(fā)展和新型活體檢測電極的研制, 電化學(xué)檢測技術(shù)正逐步用于不同動植物體系中多種成分的分析[24,25]. 低損傷的電化學(xué)分析方法非常適合活體分析, 它能實現(xiàn)反復(fù)對同一生物體進行采樣, 而不造成嚴重的侵入式傷害.

迄今, 關(guān)于實時、 動態(tài)地在體監(jiān)測蘆薈多糖水平隨環(huán)境應(yīng)激變化波動情況的研究鮮見報道. 本文采用金納米粒子修飾的碳纖維微電極提高檢測靈敏度, 將修飾電極嵌入活體植株凝膠中, 實現(xiàn)了對不同光照條件下生長的蘆薈植株中蘆薈多糖水平的動態(tài)監(jiān)測.

1 實驗部分

1.1 試劑、 材料與儀器

氯金酸(HAuCl4·4H2O)、 乙醇(分析純)和葡萄糖(分析純)購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司; 蘆薈(6周齡, 中華蘆薈, 零零壹蘆薈農(nóng)業(yè)科技有限公司); 碳粉導(dǎo)電膠(自制); 實驗用水為超純水.

XD-RFL型倒置顯微鏡(寧波舜宇儀器有限公司); CHI660D型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司); AR224CN型分析天平(上海奧豪斯儀器有限公司); KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司). 電化學(xué)實驗采用雙電極系統(tǒng): 碳纖維電極為工作電極, Ag/AgCl為參比電極.

1.2 實驗過程

1.2.1 納米金分散液的制備 將1 g AuCl3·HCl·4H2O溶解于100 mL二次蒸餾水中配制10 g/L HAuCl4溶液; 將1 g檸檬酸三鈉溶解于100 mL二次蒸餾水中配制10 g/L C6H5Na3O7·2H2O溶液; 將0.345 g碳酸鉀溶解于100 mL二次蒸餾水中配制成10 g/L K2CO3溶液; 將1 g單寧酸溶解于100 mL二次蒸餾水中配制成10 g/L C76H52046溶液. 室溫下在燒杯中依次加入20 mL蒸餾水、 0.560 mL 10 g/L的檸檬酸三鈉溶液、 0.3 mL 10 g/L的單寧酸和碳酸鉀溶液, 攪拌直至溶液呈酒紅色, 即得粒徑為(6±2) nm的納米金粒子分散液.

1.2.2 納米金修飾碳纖維微電極的制備 取10 mL納米金分散液置于50 mL小燒杯中, 將碳纖維電極和 Ag/AgCl參比電極放入其中, 恒定電流模式下于2.0 V電沉積30 min, 即在碳纖維微電極(CFME)表面構(gòu)建了納米金修飾層, 取出用水沖洗, 晾干, 即得納米金修飾碳纖維微電極(AuNPs/CFME).

2 結(jié)果與討論

2.1 碳纖維微電極在蘆薈凝膠層中的電化學(xué)響應(yīng)及檢測穩(wěn)定性

將CFME置于納米金溶膠中, 球形納米金粒徑為15 nm[圖1(A)], 圖1(B)中517 nm處的峰是粒徑為15 nm的納米金的紫外特征吸收峰[26], 于1.5 V下電沉積30 min制得AuNPs/CFME. 由AuNPs/CFME的SEM照片可見, 未修飾的CFME表面光滑平整[圖2(A)], 修飾后電極表面被一層納米金包裹, 電極直徑略有增加, 表面積增大[圖2(B)].

Fig.1 TEM image(A) and UV-Vis absorption spectrum(B) of AuNPs

Fig.2 SEM images of CFME(A) and AuNPs/CFME(B)

Fig.3 EDS image of AuNPs/CFME Inset: the red box in the SEM image of AuNPs/CFME is the detection window of EDS.

圖3為AuNPs/CFME的EDS譜圖, AuNPs/CFME的Au含量為0.117%, 表明金納米粒子已修飾在CFME表面.

用消毒刀片在蘆薈葉片表面剖開一個5 mm×5 mm的檢測窗口(圖4插圖), 使蘆薈植株的儲水凝膠組織暴露, 分別插入碳纖維微電極與Ag/AgCl 參比電極進行差分脈沖掃描, 電極直徑6 μm(φtip<6 μm), 插入深度1 mm, 掃描范圍0.5～-0.2 V. 由圖4可見, 在0.2～0.3 V電位處出現(xiàn)1個氧化峰, 在檢測窗口處滴加100 μL 10-2mol/L的葡萄糖溶液后, 該氧化峰電流明顯增加, 且峰電位偏移小于0.1 V, 與文獻[16,27]報道的峰電位一致, 推測該峰為蘆薈多糖的氧化峰.

Fig.4 DPVs of aloe polysaccharide in water storage tissue gel layer of aloe leaves for AuNPs/CFME before(a) and after(b) adding 100 μL 10-2 mol/L glucose solution

Fig.5 Repetitive CV curves of aloe polysaccharide in water storage tissue gel layer of aloe leaves with scanning speed of 0.1 V/s for CFME

Fig.6 CV curves of 1 mg/mL aloe polysaccharide in PBS(pH=7.0) with scanning speed of 0.1 V/s for AuNPs/CFME

將一根潔凈的CFME置于儲水凝膠組織中連續(xù)進行循環(huán)伏安掃描6次, 掃描速率100 mV/s, 掃描范圍1.0～-0.4 V. 結(jié)果如圖5所示, 電流強度隨掃描次數(shù)的增加而遞減, 表明CFME在蘆薈儲水凝膠組織中檢測蘆薈多糖的穩(wěn)定性較差. 這是由于在蘆薈儲水凝膠組織中, 葉酸含有對氨基苯甲酸的苯環(huán)結(jié)構(gòu)從而在電化學(xué)檢測過程中表現(xiàn)出強吸附作用[28]; 另外, 蛋白酶等物質(zhì)會在傳感界面產(chǎn)生非特異性吸附[29], 對電極產(chǎn)生明顯的鈍化作用, 使CFME對蘆薈多糖的檢測靈敏度明顯降低, 對電化學(xué)動態(tài)監(jiān)測蘆薈葉儲水凝膠組織中的蘆薈多糖水平有嚴重的干擾.

2.2 AuNPs/CFME在體檢測蘆薈多糖

將CFME和Ag/AgCl參比電極置于納米金溶膠中, 恒定電壓下電沉積適當時間. 經(jīng)AuNPs修飾后的CFME在pH=7.0的PBS緩沖溶液中, 蘆薈多糖的循環(huán)伏安曲線的氧化峰電流值明顯增大(見圖6).

將AuNPs/CFME電極應(yīng)用于蘆薈植株在體檢測, 由圖7可見, CFME經(jīng)納米金修飾后在蘆薈儲水凝膠組織中檢測蘆薈多糖的電化學(xué)穩(wěn)定性明顯增強, 通過比較6次循環(huán)伏安掃描曲線中氧化峰和還原峰電流的變化得出其相對標準偏差(RSD)值<10%. 這說明CFME經(jīng)納米金修飾后, 降低了電化學(xué)動態(tài)監(jiān)測蘆薈多糖水平的干擾.

Fig.7 Repetitive CV curves of aloe polysaccharide in water storage tissue gel layer of aloe leave with scanning speed of 0.1 V/s for AuNPs/CFME

Fig.8 CV curves of aloe polysaccharide in aloe leaves water storage tissue gel layer for different electrodes

從納米金修飾前后CFME監(jiān)測蘆薈多糖的循環(huán)伏安疊加圖(圖8)可見, 納米金修飾后電極對蘆薈多糖的電化學(xué)響應(yīng)顯著增加, 而且氧化峰電流的位置無明顯偏移, 說明修飾后的電極對蘆薈多糖有良好的電催化效果.

2.3 AuNPs/CFME的電化學(xué)阻抗譜及電化學(xué)活性面積分析

采用電化學(xué)阻抗譜(EIS)對修飾過程中電極的阻抗值變化進行了考察. 在EIS譜測定過程中, 以[Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-作氧化還原探針, 阻抗譜半圓直徑等于電子轉(zhuǎn)移電阻Ret. 結(jié)果如圖9(A) 所示, 譜線a和b分別為CFME和AuNPs/CFME的EIS譜線, 頻率范圍0.05 Hz～100 kHz. 裸CFME的Ret值非常大, 約為5.913×105Ω, 而AuNPs/CFME 的Ret值明顯減小, 約為10-3Ω. 這是由于納米金粒子的表面效應(yīng)[30]及表面原子的空位效應(yīng)使納米金粒子具有高活性, 修飾電極表面被一層納米金粒子覆蓋, 降低了電極的界面阻抗值. 電極的電活性區(qū)域是評估電極性能的重要參數(shù), 以多巴胺為氧化還原探針通過循環(huán)伏安法測定了修飾電極的有效表面積. 對于可逆過程, 采用Randles-Sevcik方程計算電極的電活性面積:

Ip=2.69×105An3/2D1/2v1/2c

Fig.9 EIS curves of bare CFME(a), AuNPs/CFME(b) in 0.1 mol/L of KCl solution containing 5 mmol/L of [Fe(CN)6]3-/4-(A) and linear relationship between peak current and the square root of scanning rate for CFME(a) and AuNPs/CFME(b)(B) Inset of (A): Randles equivalence circuit model was used to fit the data.

式中:A(cm2)為工作電極的有效電活性表面積;n為反應(yīng)中的電子轉(zhuǎn)移, 該值等于2;D為在確定的溶液中指探針分子的擴散系數(shù), 約為9.145×10-7cm2/s;υ(V/s)表示掃描速率,c(mol/L)對應(yīng)于氧化還原探針的濃度, 在該反應(yīng)中檢測到的分子濃度為10 μmol/L;Ip(nA)代表氧化還原電流峰值. 由Ip對v1/2線性方程[圖9(B)]的斜率計算得出CFME和AuNPs/CFME的表面積分別為4.123×10-7和5.498×10-6cm2, AuNPs/CFME的微觀電活性面積是裸CFME的13.334倍. 上述結(jié)果表明, 與CFME相比, AuNPs/CFME具有更大的比表面積, 從而可提供更多的電化學(xué)活性位點. 綜上, AuNPs/CFME電化學(xué)性能提高是修飾電極大的比表面積、 優(yōu)良電導(dǎo)率以及AuNPs 粒子的催化活性共同作用的結(jié)果.

2.4 CFME修飾條件的優(yōu)化

采用循環(huán)伏安法考察了修飾電極電沉積時間對蘆薈多糖電化學(xué)響應(yīng)的影響. 如圖10所示, 設(shè)定初始恒定電壓為1.5 V, 隨著電沉積時間的延長, 蘆薈儲水組織中蘆薈多糖電化學(xué)的響應(yīng)也隨之增強, 當沉積時間達30 min時, 蘆薈多糖的氧化峰電流達到最大值, 繼續(xù)增加電沉積時間, 蘆薈多糖的氧化峰電流下降, 故選擇最佳電沉積時間為30 min.

Fig.10 CV curves of aloe polysaccharide in water storage tissue gel layer of aloe leaves for AuNPs/CFME with different electrodeposition time(A) and effects of electrodeposition time on the oxidation peak current of aloe polysaccharide in water storage tissue gel layer of aloe leaves by CV measurements(B) Electrodeposition time/min: a. 10; b. 20; c. 30; d. 40.

2.5 不同光照條件下蘆薈多糖的含量變化

分別設(shè)置對照組和實驗組, 對照組為正常光照環(huán)境下的蘆薈植株, 實驗組為在黑暗環(huán)境下放置2 d的蘆薈植株(與對照組所用植株相同). 將納米金修飾后的CFME與參比電極插入蘆薈葉片的儲水凝膠組織中, 進行電化學(xué)檢測, 在不同葉片位置平行檢測20次, 表1列出了測定結(jié)果. 圖11為對照組和實驗組分別進行20次電化學(xué)響應(yīng)實驗的柱狀圖, 可以看出對照組的電化學(xué)響應(yīng)均明顯高于實驗組(P<0.01), 對照組和實驗組的氧化峰電流值具有統(tǒng)計學(xué)差異, 說明無光條件下蘆薈多糖的含量比正常光照環(huán)境下明顯降低, 可用于衡量蘆薈植株光合作用程度.

Table 1 Electrochemical response of control group and experimental group(n=20)*

*I: the average value of three times measure on each identical detection window.

Fig.11 Histogram of 20 electrochemical responses of test group and control group in Table 1

3 結(jié) 論

建立了一種動態(tài)監(jiān)測不同生長環(huán)境下活體蘆薈植株中蘆薈多糖濃度水平的電化學(xué)方法, 通過在基底電極界面修飾納米金粒子增強其對蘆薈多糖的電化學(xué)響應(yīng), 可更靈敏地監(jiān)測蘆薈多糖的濃度變化. 結(jié)果表明, 不同光照環(huán)境下生長的蘆薈植株中蘆薈多糖的變化具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異, 可作為衡量蘆薈光合作用強度的指標之一, 為進一步研究蘆薈植株應(yīng)對不同外界環(huán)境體內(nèi)各種激素水平變化提供了論據(jù).