海洋土曲霉C23-3 與不同類型海洋微生物共培養(yǎng)對其次生代謝產(chǎn)物的影響

梁金月，李文卿，楊靜明，劉亞月，聶影影，楊文聰，張 翼,2

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院// 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室// 廣東省海洋生物制品工程實驗室// 廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心//水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點實驗室// 湛江市腦健康海洋藥物與營養(yǎng)品重點實驗室// 廣東海洋大學(xué)海洋藥物研究所，廣東 湛江 524088；2. 廣東海洋大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳 518120）

遼闊深邃的海洋占地球表面積約70%，其中蘊藏著高度的生物多樣性和豐富的天然產(chǎn)物資源[1]，海洋真菌等海洋微生物為適應(yīng)海洋高鹽、高壓、低溫、寡營養(yǎng)等有別于陸地的多樣化生境和激烈的生存競爭，進化出可產(chǎn)生多樣化生物活性次生代謝產(chǎn)物的潛力，如較早發(fā)現(xiàn)的頭孢霉素C已衍生出龐大的頭孢霉素家族，環(huán)孢霉素A則被用于免疫抑制劑，越來越多的抗腫瘤活性物質(zhì)也在海洋真菌中被發(fā)現(xiàn)，海洋真菌正日益受到科研人員的重視[2]。然而脫離了自然生境的海洋真菌等微生物，在實驗室人工培養(yǎng)條件下大部分次級代謝產(chǎn)物途徑并不能充分表達，有研究表明通過接觸性或非接觸性的共培養(yǎng)方法，能夠利用微生物種群之間的協(xié)同代謝或誘導(dǎo)作用，有效激活這些沉默表達途徑，從而提高微生物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量以及多樣性[3]。如OH等[4]將一株海洋真菌Libertella（CNL-523）與一株海洋細(xì)菌aproteobacterium（CNJ-328）共培養(yǎng)，從共培養(yǎng)提取物中分離純化得到4個新化合物，分別為libertellenones A-D；OH 等[5]將一株海洋真菌Emericellasp.和一株海洋放線菌Salinispora arenicola共培養(yǎng)，從共培養(yǎng)提取物中得到2個新化合物emericellamides A和B。董杰杰等[6]將海洋真菌Aspergillussp.SCSGAF 0076與細(xì)菌Bacillussp.MNMCCE 001共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)提取物中的抗菌活性化合物青霉酸以及紅色素含量均比Aspergillussp.SCSGAF 0076純培養(yǎng)時高。這些表明共培養(yǎng)是一種激活沉默次生代謝途徑的有效手段。

土曲霉(Aspergillus terreus)屬于子囊菌門(Ascomycota) 散囊菌綱(Eurotiomycetes) 散囊菌目(Eurotiales)發(fā)菌科(Trichocomaceae)曲霉屬(Aspergillus)，是廣泛存在于海洋和陸地的一種真菌[7]。丁內(nèi)酯和土震素類化合物是土曲霉次級代謝產(chǎn)物中的代表性化合物，研究發(fā)現(xiàn)丁內(nèi)酯類化合物具有良好抗炎[8-9]、神經(jīng)元保護[10]、抗氧化[11]以及抗菌[12]等作用，土震素類化合物具有強的乙酰膽堿酯酶抑制活性[13]，考慮到乙酰膽堿酯酶抑制劑仍是迄今臨床阿爾茲海默癥藥物的主流，而大腦氧化應(yīng)激在阿爾茲海默癥發(fā)展過程中發(fā)揮了廣泛作用[14-15]，故土曲霉次生代謝產(chǎn)物的研究對于尋找抗阿爾茲海默病的先導(dǎo)化合物具有一定研究價值。

本實驗室在前期研究中發(fā)現(xiàn)一株南海珊瑚來源的海洋真菌土曲霉C23-3 的代謝產(chǎn)物具有一定的抗菌、抗氧化及乙酰膽堿酯酶抑制活性，并發(fā)現(xiàn)其可產(chǎn)生特征性次生代謝產(chǎn)物丁內(nèi)酯-I[7,15]。本研究選用該菌株分別與海洋真菌膠紅酵母、海洋細(xì)菌枯草芽孢桿菌（革蘭陽性，G+）和副溶血弧菌（革蘭陰性菌，G-）等3 種類型微生物進行共培養(yǎng)，研究共培養(yǎng)對次生代謝的影響，以期誘導(dǎo)土曲霉C23-3產(chǎn)生更高產(chǎn)或更豐富的丁內(nèi)酯類等活性次生代謝產(chǎn)物，為尋找具有抗阿爾茲海默病等活性的先導(dǎo)化合物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器與試劑 多功能紫外透射儀WFH-201B（上海精科實業(yè)有限公司）、電熱恒溫培養(yǎng)箱HPX-9082MBE（上海博訊實業(yè)有限公司）、高效液相色譜儀1260 Infinity Ⅱ（美國安捷倫科技有限公司）、分析天平ME204E（德國梅特勒托利多公司）、酶標(biāo)儀Epoch2（美國伯騰儀器有限公司）、超聲波清洗機300ZED（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-300（瑞士步琦公司）、全自動高壓滅菌鍋IRM-100（德國愛安姆公司）、生物安全柜BSC-1300 II A2（上海博訊實業(yè)有限公司）。

碘化硫代乙酰膽堿(Acetylthiocholine，ATCI)，sigma，DA0048；5，5-二硫代二硝基苯甲酸(Dithiobisnitrobenzoicacid，DTNB)，Ruibio，D8130；乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)，Sigma，C3389；牛血清白蛋白(BSA)，Sigma，A1933；二苯代苦味酰自由基(1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl,DPPH)，Sigma，D9132；GF254 硅膠高效薄層層析板購自德國默克公司；海鹽（湛江海之儀有限公司），酮康唑（≥98%）和氨芐青霉素鈉（≥98%）購自上海阿拉丁試劑公司；二甲基亞砜、甲醇、超純水、三氯化鐵、鐵氰化鉀均為國產(chǎn)分析純試劑，高效液相色譜分析用甲醇為色譜甲醇。

1.1.2 生物材料 海洋真菌土曲霉Aspergillus terreusC23-3（GDMCC No.60316）采自湛江徐聞珊瑚保護區(qū)，現(xiàn)保存于廣東省微生物菌種保藏中心；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilisMCCC 1A03710）購自中國海洋微生物菌種保藏中心；副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）由廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院溫崇慶教授贈予；膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）由廣東海洋大學(xué)徐春厚教授贈予。

1.1.3 培養(yǎng)基配制 大米固體培養(yǎng)基：糙米50 g、質(zhì)量濃度2%半人工海水60 mL；海水馬鈴薯蔗糖固體培養(yǎng)基：500 mL 的馬鈴薯汁、蔗糖20 g、蛋白胨5 g、海鹽20 g、加入蒸餾水定容至1 L，pH＝7.2± 0.2；沙氏培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、葡萄糖40 g、瓊脂20 g、純水定容至1 L，pH＝5.6 ± 0.2；MH 肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏5 g、可溶性淀粉1.5 g、酪蛋白水解物17.5 g、瓊脂20 g、純水定容至1 L，pH＝7.2～7.4；海生菌瓊脂培養(yǎng)基2216E：酵母膏1 g、蛋白胨5 g、瓊脂16 g、粗海鹽20 g、純水定容至1 L。酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基YPD：酵母膏10 g、葡萄糖20 g、蛋白胨20 g、瓊脂20 g、粗海鹽20 g、純水定容至1 L。

1.2 方法

1.2.1 菌株次生代謝產(chǎn)物的TLC 分析 參照文獻[16]，以氯仿：甲醇(V/V=7∶1)為TLC 展開劑，記錄254 nm 和365 nm 紫外圖像，DPPH 自由基清除活性自顯影圖像（若物質(zhì)具有活性，則呈明顯斑點，非活性部分顯紫色），乙酰膽堿酯酶抑制活性自顯影圖像（白色為活性部分，其余部分為黃色），茴香醛硫酸顯色及鐵氰化鉀-三氯化鐵顯色圖像。

1.2.2 菌株純培養(yǎng)與提取 將已經(jīng)活化的枯草芽孢桿菌、副溶血性弧菌、膠紅酵母和土曲霉C23-3切塊分別置于裝有大米固體培養(yǎng)基的500 mL 錐形瓶中培養(yǎng)，12 d 時，取1/4 的大米培養(yǎng)基，用150 mL甲醇超聲提取、過濾、濃縮得粗提物；余下的3/4繼續(xù)培養(yǎng)至24 d 時用450 mL 甲醇超聲提取、過濾、濃縮得粗提物，均設(shè)置2 個平行試驗。

1.2.3 活菌株與土曲霉C23-3 共培養(yǎng)與提取 在超凈臺中，用移液槍各取10 mL 枯草芽孢桿菌、副溶血弧菌和膠紅酵母的菌液分別接種于已滅菌的大米培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)4 d 后再分別放入土曲霉C23-3菌塊進行共培養(yǎng)；12 d 時，取1/4 的大米培養(yǎng)基，用150 mL 甲醇超聲提取、過濾、濃縮得粗提物；余下的3/4 繼續(xù)培養(yǎng)至24 d 時用450 mL 甲醇超聲提取、過濾、濃縮得粗提物，試驗均設(shè)置2 個平行。

1.2.4 滅活菌體與土曲霉C23-3 共培養(yǎng)與提取 在超凈臺中，用移液槍各取10 mL 枯草芽孢桿菌、副溶血弧菌和膠紅酵母的菌液分別接種于已滅菌的大米培養(yǎng)基中，在28 ℃培養(yǎng)4 d 后于121℃滅菌21 min 得到已滅活的各菌株菌體，最后再分別放入土曲霉C23-3 菌塊進行共培養(yǎng)；12 d 時，取1/4 的大米培養(yǎng)基，用150 mL 甲醇超聲提取、過濾、濃縮得粗提物；余下的3/4 繼續(xù)培養(yǎng)至24 d 時用450 mL 甲醇超聲提取、過濾、濃縮得粗提物，試驗均設(shè)置2 個平行。

1.2.5 HPLC 分析 將培養(yǎng)時間相同的不同培養(yǎng)條件下得到的各提取物用適量同樣體積的甲醇溶解，過0.22 μm 的微孔濾膜，供檢測用。

Agilent C18色譜柱(4.6 mm × 150 mm，4 μm)，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30℃，進樣量為10 μL，檢測波長254 nm；流動相梯度條件為0～ 30 min:由體積分?jǐn)?shù)10%甲醇～ 90%水梯度洗至100%甲醇；30～ 40 min:甲醇/水＝100%～ 100%；40～ 45 min:甲醇/水＝100%～10%；45～ 50 min:甲醇/水＝10%～10%。

1.2.6 抗菌試驗 采用濾紙片法進行抗菌試驗，將培養(yǎng)基倒至平板中，待培養(yǎng)基凝固后，吸取100 μL 0.5 麥?zhǔn)蠞岫鹊木?，用涂布棒均勻涂布在固體平板上，將負(fù)載有待測樣品的6 mm 濾紙片(每個濾紙片負(fù)載200 μg 待測樣品）用鑷子緊貼在平板表面，氨芐青霉素鈉和酮康唑用于陽性對照(每個濾紙片負(fù)載10 μg 氨芐青霉素鈉或酮康唑），然后把平板倒置于4℃約10 h，后將真菌平板置于28℃培養(yǎng)箱、細(xì)菌平板置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)13 h，記錄抑菌圈直徑大小，每個實驗做2 個平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株培養(yǎng)的表觀形態(tài)對比 如圖1 所示，菌株土曲霉C23-3 在生長前期呈白色，隨著培養(yǎng)時間的增加顏色由白色變?yōu)樯钭厣↗1-J3）?？莶菅挎邨U菌隨著培養(yǎng)時間的增加菌株由原來的淺黃色變?yōu)樽攸S色，菌體生長也越來越旺盛（A1-A3），枯草芽孢桿菌與土曲霉C23-3 共培養(yǎng)（C1-C3），枯草芽孢桿菌呈深棕色，土曲霉C23-3 呈白色；副溶血弧菌隨著培養(yǎng)時間增加顏色由淺黃色變?yōu)樯铧S色（D1-D3），當(dāng)副溶血弧菌與土曲霉C23-3 共培養(yǎng)至12 d 白色的土曲霉幾乎把整個大米培養(yǎng)基覆蓋（F1-F3）。膠紅酵母隨著培養(yǎng)時間的增加由淺紅色變?yōu)樯罴t色（G1-G3），當(dāng)膠紅酵母與土曲霉C23-3共培養(yǎng)時（I1-I3），可觀察到這2 種真菌都有生長。

圖1 菌株在不同培養(yǎng)時期的生長形態(tài)Fig.1 Growing morphology of strains during different cultured periods

2.2 粗提物TLC 自顯影活性成分分析 將發(fā)酵粗提物用同樣體積甲醇溶解，以玻璃毛細(xì)管定量點樣到GF254 硅膠高效薄層層析板上，進行TLC 紫外及顯色分析，對比不同培養(yǎng)條件下代謝產(chǎn)物的TLC指紋圖譜（圖2）可知土曲霉在不同共培養(yǎng)條件下均能產(chǎn)生丁內(nèi)酯-I，由圖2-A4可知，不同滅活菌體與土曲霉C23-3 共培養(yǎng)提取物中丁內(nèi)酯-I 斑點比對應(yīng)活菌與土曲霉C23-3 共培養(yǎng)提取物中丁內(nèi)酯-I 斑點明顯大，這表明在培養(yǎng)12 d 時滅活菌體與土曲霉C23-3 共培養(yǎng)所產(chǎn)生的丁內(nèi)酯-I 含量比活菌與土曲霉C23-3 共培養(yǎng)產(chǎn)生的丁內(nèi)酯-I 多。由圖2 中的B4、D4和E4可知，副溶血弧菌滅活菌體與土曲霉C23-3共培養(yǎng)提取物中的大極性（Rf＜0.4）熒光斑點物質(zhì)、大極性（Rf＜0.3）抗氧化成分和酚胺類物質(zhì)明顯比土曲霉C23-3 純培養(yǎng)提取物更加豐富多樣；由圖2中的B5、D5和E5可知，副溶血弧菌與土曲霉C23-3共培養(yǎng)提取物和副溶血弧菌滅活菌體與土曲霉C23-3 共培養(yǎng)提取物中的大極性（Rf＜0.4）熒光斑點物質(zhì)、大極性（Rf＜0.4）抗氧化成分和酚胺類物質(zhì)比土曲霉C23-3 純培養(yǎng)提取物豐富多樣；由圖2中的F4和F5可知，枯草芽孢桿菌與土曲霉C23-3共培養(yǎng)提取物中大極性（Rf＜0.2）乙酰膽堿酯酶抑制成分比土曲霉C23-3 純培養(yǎng)提取物豐富；由圖2-E5中可知枯草芽孢桿菌與土曲霉C23-3 共培養(yǎng)提取物和枯草芽孢桿菌滅活菌體與土曲霉C23-3 共培養(yǎng)提取物中的酚胺類物質(zhì)比土曲霉C23-3 純培養(yǎng)提取物豐富。這些表明不同形式的共培養(yǎng)均可激活微生物的次生代謝，產(chǎn)生更豐富的活性物質(zhì)。

圖2 粗提物的薄層層析紫外、化學(xué)顯色及TLC 生物自顯影圖像Fig.2 The UV,chemically colorization and TLC bioautography images of the extracts

2.3 抗菌活性 濾紙片法發(fā)現(xiàn)副溶血弧菌、枯草芽孢桿菌和膠紅酵母純培養(yǎng)提取物對土曲霉沒有明顯的抑菌活性，而土曲霉純培養(yǎng)提取物對副溶血弧菌、枯草芽孢桿菌或膠紅酵母均有顯著抑菌效果（表1），抑菌圈平均直徑均在18.0 mm 以上，這表明在共培養(yǎng)過程中，副溶血弧菌等添加菌在化學(xué)拮抗競爭方面處于劣勢，而土曲霉在此方面為優(yōu)勢。

表1 各粗提物的抗菌生物活性Table 1 Antimicrobial activities of the extracts mm

而共培養(yǎng)物的活性表現(xiàn)顯示，副溶血弧菌與土曲霉C23-3 共培養(yǎng)12 d 的提取物對副溶血弧菌的抑菌圈為11.3 mm，而培養(yǎng)24 d 時抑菌圈有18.3 mm；這說明在早期共培養(yǎng)下，較早在培養(yǎng)基上定植的副溶血弧菌有一定的生長，后接種的土曲霉生長受到抑制，可能存在營養(yǎng)競爭關(guān)系，但在培養(yǎng)后期副溶血弧菌生長受到土曲霉較強的抑制。而副溶血弧菌滅活菌體在與土曲霉共培養(yǎng)過程中，提取物的抗菌活性從12 d 時的18.0 mm 減弱到24 d 時的16.7 mm，這可能是由于其誘導(dǎo)物質(zhì)具有一定的半衰期。上述現(xiàn)象在枯草芽孢桿菌滅活/活菌體與土曲霉共培養(yǎng)的實驗中也被觀察到，其滅活菌體對共培養(yǎng)物抗菌活性刺激作用的衰減尤為明顯，從12 d 的20.7 mm 抑菌圈減弱到24 d 的12.0 mm。膠紅酵母的滅活菌體對共培養(yǎng)物抗菌活性刺激作用隨時間也有一定衰減，但活菌體與土曲霉的共培養(yǎng)物一直具有穩(wěn)定且顯著的抗膠紅酵母活性，這表明在共培養(yǎng)體系中，膠紅酵母一直處于受抑制的劣勢。

2.4 HPLC 指紋圖譜分析 利用HPLC 對各培養(yǎng)發(fā)酵代謝產(chǎn)物進行分析，共培養(yǎng)物中某微生物的特征代謝產(chǎn)物的存在與否及其產(chǎn)量可反映在共培養(yǎng)體系中2 種菌此消彼長的生長態(tài)勢，這與上文中的培養(yǎng)提取物抗菌活性結(jié)果可互為印證。

由圖3 中的A6、C6和D6可知，當(dāng)培養(yǎng)12 d 時，其純培養(yǎng)對應(yīng)的特征代謝產(chǎn)物在活副溶血弧菌與土曲霉共培養(yǎng)體系中仍然存在，但產(chǎn)量明顯低于純培養(yǎng)物中的含量，這表明在共培養(yǎng)體系中弧菌有一定生長；同樣，土曲霉的特征代謝產(chǎn)物丁內(nèi)酯-I 產(chǎn)量低于純培養(yǎng)對照說明其在共培養(yǎng)體系中的生長也受到抑制，雙方存在營養(yǎng)或化學(xué)競爭，這與上文抗菌活性揭示的信息一致，考慮到丁內(nèi)酯-I 的抗菌作用[12]，推測該化合物參與了土曲霉對共存菌的化學(xué)拮抗。值得注意的是，色譜峰面積顯示滅活弧菌和土曲霉共培養(yǎng)體系中丁內(nèi)酯-I 的產(chǎn)量比土曲霉純培養(yǎng)高2.2 倍，比活弧菌-土曲霉共培養(yǎng)高7.8 倍。類似菌株生長競爭及滅活菌體更能促進土曲霉產(chǎn)丁內(nèi)酯-I 的現(xiàn)象在枯草芽孢桿菌和膠紅酵母與土曲霉的培養(yǎng)實驗中也被觀察到。

當(dāng)培養(yǎng)至24 d 時，由圖3 中的E6、G6和H6可知共培養(yǎng)體系中副溶血弧菌長勢較弱，這與抑菌活性結(jié)果一致，而滅活/活菌兩種共培養(yǎng)方式都無明顯誘導(dǎo)土曲霉產(chǎn)生更多丁內(nèi)酯-I 效果，這表明原來起作用的誘導(dǎo)物質(zhì)可能已經(jīng)失效?？莶菅挎邨U菌在此時間點也有類似現(xiàn)象；而圖3-E7顯示了其純培養(yǎng)24 d 時有丁內(nèi)酯-I 色譜峰（由其保留時間16.9 min及紫外光譜確認(rèn)），由于該化合物為典型的真菌代謝產(chǎn)物，推測此峰是樣品提取時污染所致。而由圖3-G8和圖3-H8可知，在此時間點，膠紅酵母的活菌更能刺激土曲霉中丁內(nèi)酯-I 的產(chǎn)生，是土曲霉純培養(yǎng)的1.4 倍。

另外，結(jié)果也顯示，除了丁內(nèi)酯-I 之外，共培養(yǎng)對于其他一些成分包括微量成分的產(chǎn)生也具有刺激作用。如培養(yǎng)12 d 時，保留時間1.2 min、1.9 min及11.4 min（經(jīng)紫外光譜比較也為丁內(nèi)酯類代謝產(chǎn)物）的峰在滅活弧菌菌體與土曲霉共培養(yǎng)物中的含量要顯著高于活弧菌與土曲霉共培養(yǎng)以及土曲霉純培養(yǎng)物，而該物質(zhì)在弧菌純培養(yǎng)中并不存在，這表明弧菌菌體信號物質(zhì)激活了土曲霉中這些產(chǎn)物的代謝途徑。而膠紅酵母在12 d 及24 d 時，保留時間7.5 min 的峰在活酵母與土曲霉共培養(yǎng)體系中的含量要遠(yuǎn)高于滅活酵母與土曲霉共培養(yǎng)、土曲霉純培養(yǎng)及酵母純培養(yǎng)，值得注意的是在24 d 時，膠紅酵母純培養(yǎng)中也有少量該物質(zhì)產(chǎn)生，說明該物質(zhì)可能是酵母菌和霉菌兩類真菌都可產(chǎn)生的物質(zhì)，但活菌體相互作用大大促進了該物質(zhì)產(chǎn)生。

圖3 254 nm 下各粗提物的HPLC 指紋圖譜Fig.3 The HPLC fingerprints recorded at 254 nm of the extracts

3 討論

海洋微生物為適應(yīng)高鹽、低壓、低營養(yǎng)等特殊生態(tài)環(huán)境，會產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、活性顯著的化合物，但在實驗室培養(yǎng)條件下有些海洋微生物產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物的途徑不表達或者表達被抑制[3]，科研人員為最大程度開發(fā)利用海洋微生物等天然資源，通過有效微生物共培養(yǎng)技術(shù)獲得生物活性更顯著、化學(xué)成分更豐富的次生代謝產(chǎn)物。如朱峰等[17]將來自南海紅樹植物的2 株內(nèi)生海洋真菌共培養(yǎng)，從共培養(yǎng)提取物中提取分離到化合物2-甲基水楊酸和環(huán)（苯丙-苯丙）二肽，這2 種化合物在純培養(yǎng)時未能得到。丁維嘉等[18]將來自南海紅樹林的內(nèi)生真菌E33 和K38 共培養(yǎng)，從中分離純化得到9 種化合物，其中的6 種化合物在純培養(yǎng)時未能分離得到。Chen等[19]將一株淡水湖泊沉積物真菌土曲霉（Aspergillus terreus）分別與枯草芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌進行蒸餾水大米培養(yǎng)基上的共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)代謝產(chǎn)物中的真菌化合物 butyrolactones I-VI、terrein 和aspulvinone E 等12 個已知化合物產(chǎn)量相比真菌土曲霉純培養(yǎng)時提高34 倍，且從共培養(yǎng)提取物中得到2 個新化合物isobutyrolactone II、4-O-demethylisobutyrolactone II 和1 個已知化合物N-(carboxymethyl)anthranilic acid，其中N-(carboxymethyl)-anthranilic acid 只在共培養(yǎng)條件下檢測到，在真菌土曲霉單獨培養(yǎng)時并沒有檢測到。

而本研究同時選取枯草芽孢桿菌（G+）、副溶血弧菌（G-）和膠紅酵母（酵母樣真菌）等3 種不同類型的耐鹽菌株與海洋來源土曲霉在海水大米培養(yǎng)基中進行了共培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)1 個值得注意的現(xiàn)象，即將死的菌體（滅活的枯草芽孢桿菌、副溶血弧菌或膠紅酵母）與土曲霉C23-3 共培養(yǎng)組時，相較于活菌體與土曲霉C23-3 共培養(yǎng)組以及土曲霉純培養(yǎng)組，在培養(yǎng)至12 d 時土曲霉特征代謝產(chǎn)物丁內(nèi)酯-I的產(chǎn)量，滅活菌體與土曲霉共培養(yǎng)組 ＞ 土曲霉純培養(yǎng)組 ＞ 活菌體與土曲霉共培養(yǎng)組。推測滅活菌體中存在的某些信號物質(zhì)能在一定時間內(nèi)穩(wěn)定存在并誘導(dǎo)土曲霉增強丁內(nèi)酯-I 的產(chǎn)生，而活菌在此時間段內(nèi)與土曲霉共培養(yǎng)時可能由于營養(yǎng)競爭等關(guān)系抑制土曲霉的生長及丁內(nèi)酯-I 的合成。但當(dāng)共培養(yǎng)時間延長至24 d 時，滅活菌體對于土曲霉產(chǎn)丁內(nèi)酯-I 的影響因菌而異，或與活菌體效果接近（副溶血弧菌、枯草芽孢桿菌），或更弱（膠紅酵母），推測與不同菌產(chǎn)生的誘導(dǎo)物質(zhì)的半衰期或菌對大米培養(yǎng)基的生長適應(yīng)性等有關(guān)。有前人報道丁內(nèi)酯-I 是土曲霉的一種群體自感應(yīng)信號分子，在菌絲生長后期具有促進孢子形成的作用[20]，對比本實驗中12 d 的土曲霉純培養(yǎng)物與死弧菌/芽孢桿菌/酵母菌和土曲霉的共培養(yǎng)物外觀形態(tài)，可發(fā)現(xiàn)后者的孢子產(chǎn)量（棕色）要明顯高于前者，這表明滅活菌體中的誘導(dǎo)物可能向土曲霉傳遞了類似“惡劣環(huán)境”的信息，土曲霉進一步通過分泌丁內(nèi)酯增強了群體感應(yīng)作用并產(chǎn)孢抗逆。

另外，也發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)對于其他代謝產(chǎn)物包括一些微量成分的產(chǎn)生也有較顯著的激活作用，但添加枯草芽孢桿菌共培養(yǎng)誘導(dǎo)土曲霉次生代謝的整體效果沒有上述Chen 報道的顯著，這可能與所用的土曲霉及枯草芽孢桿菌菌株水平上的差異，以及培養(yǎng)的大米培養(yǎng)基成分（如鹽度、大米種類）、發(fā)酵時間、溫度等因素有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究中TLC、活性自顯影及HPLC 指紋圖譜均顯示不同類型的微生物與土曲霉共培養(yǎng)均可激活一些原本沉默的活性次級代謝產(chǎn)物。

在活菌共培養(yǎng)體系中，枯草芽孢桿菌、副溶血弧菌及膠紅酵母在與土曲霉的化學(xué)拮抗中均處于劣勢；而滅活菌體相對于活菌，在12 d 時對土曲霉特征代謝產(chǎn)物也是群體自感應(yīng)信號分子丁內(nèi)酯-I 的產(chǎn)生具有更強作用，而更長時間的死菌刺激優(yōu)勢不明顯或減弱，這可能源于某些具有一定半衰期的信號物質(zhì)，對于控制合適時間點以更有效進行誘導(dǎo)調(diào)控發(fā)酵提供了有益啟示。推測這些物質(zhì)是菌體滅活時產(chǎn)生的，但具體分子結(jié)構(gòu)還有待深入研究。

除了形態(tài)觀察外，菌株化學(xué)拮抗能力及HPLC指紋圖譜變化也可為揭示共培養(yǎng)體系中菌株之間的消長態(tài)勢提供豐富的信息，是共培養(yǎng)體系研究的有用化學(xué)手段。

綜上所述，本研究為進一步挖掘海洋真菌潛力及抗老年癡呆等活性先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)提供了基礎(chǔ)。