海洋弧菌鑒定與分類相關(guān)功能基因研究進(jìn)展

陳 星，唐金利，姜宮凌俠，亢振軍，李 楠

（1.南寧師范大學(xué)北部灣環(huán)境演變與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530001；2.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004；3.北部灣大學(xué)海洋學(xué)院，廣西 欽州 535011）

海洋弧菌（Vibrio）是一類菌體短小的異養(yǎng)型革蘭陰性細(xì)菌，兼性厭氧，廣泛分布于海水及海洋動(dòng)物體內(nèi)，多有好鹽性、運(yùn)動(dòng)性及氧化酶陽性，可在硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖（Thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose，TCBS）瓊脂培養(yǎng)基上生長[1]。海洋弧菌中，重氮營氧弧菌（Vibriodiazotrophicus）、需鈉弧菌（V.natriegens）和海利斯頓氏菌（V.pelagius）等異養(yǎng)型固氮菌可將空氣中的氮分子還原成氨態(tài)氮，參與海洋無機(jī)氮循環(huán)[2]。多糖降解性弧菌可降解幾丁質(zhì)等復(fù)雜糖類，可用于處理海洋污染物[1]。費(fèi)希爾弧菌（V.fischeri）、哈維氏弧菌（V.harveyi）和火神弧菌（V.logei）等少數(shù)幾種以浮游、附存（含附著、寄生、腐生）和共生方式生活的弧菌可以發(fā)光，其發(fā)光程度與毒性濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，可用于水環(huán)境樣品的生物毒性檢測[3]。除有固氮、降解多糖、發(fā)光等能力外，以霍亂弧菌（V.cholera）、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、哈維氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌（V.vulnificus）和溶藻弧菌（V.alginolyticu）為主的多種海洋弧菌還有致病性，除可感染魚蝦外，還可引發(fā)人類霍亂、胃腸炎和炎癥等多種疾病[4]。不同鹽度、深度、溶氧和pH 的海水中均有大量弧菌群，它們不僅在海洋生態(tài)系統(tǒng)元素循環(huán)中發(fā)揮重要作用，還關(guān)乎水產(chǎn)養(yǎng)殖發(fā)展和人類健康。

目前，弧菌科包含弧菌屬、發(fā)光桿菌屬、另類弧菌屬、腸弧菌屬、鹽弧菌屬、格里蒙氏菌屬、海膽單胞菌屬和鏈狀球菌屬等8 屬，150 多種[5-6]。早期的傳統(tǒng)表型鑒定分類方法是對弧菌進(jìn)行純培養(yǎng)，再根據(jù)包括菌落形態(tài)、生理特征以及免疫學(xué)特性等弧菌表型進(jìn)行分類鑒定。Vandenberghe 等[7-8]使用Biolog GN 系統(tǒng)對各類水產(chǎn)養(yǎng)殖生物體內(nèi)所有分離物進(jìn)行表型鑒定，發(fā)現(xiàn)弧菌屬是一個(gè)表型多樣化的群體，在不同生長周期與環(huán)境下呈現(xiàn)不同的表型和理化特征。隨著弧菌新種的增加，僅通過簡單的表型分類難以對弧菌科種類進(jìn)行合理分類[8-9]。如豚鼠氣單胞菌（Aeromonas caviae）通常被鑒定為河流弧菌（V.fluvialis）[10]，在未進(jìn)行完整的形態(tài)特征篩選試驗(yàn)時(shí)，嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）和類志賀毗鄰單胞菌（Plesiomonas shigelloides）會(huì)被誤認(rèn)為是弧菌[11]。當(dāng)前，TCBS 培養(yǎng)基是常用弧菌分離篩選培養(yǎng)基之一，Cleland 等[12]報(bào)道，海水、蛤和牡蠣樣品在TCBS培養(yǎng)基上分離出的53%的菌落可被鑒定為弧菌，Bolinches 等[13]從TCBS 培養(yǎng)基中挑取的83%的河口水樣分離株是弧菌。但有研究顯示，用表面熒光顯微鏡直接計(jì)數(shù)的活菌數(shù)始終高于相應(yīng)的TCBS 平板計(jì)數(shù)，表明部分弧菌會(huì)進(jìn)入不可培養(yǎng)狀態(tài)[14]。所以依靠表型鑒定的分類學(xué)方法僅針對可培養(yǎng)弧菌，卻無法有效篩選鑒定不可培養(yǎng)的弧菌類群。因此，人們開始轉(zhuǎn)向利用現(xiàn)代分子生物學(xué)方法。從20 世紀(jì)60 年代開始，分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展使弧菌分類學(xué)研究進(jìn)入分子生物學(xué)時(shí)代，許多新技術(shù)和方法在弧菌分類學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用?；【?6S rRNA 基因和其他功能基因等分子生物學(xué)方法已成為海洋弧菌分類鑒定的重要手段。筆者根據(jù)已有的弧菌分類學(xué)研究成果，闡述海洋弧菌鑒定與分類相關(guān)功能基因（表1）及其應(yīng)用研究進(jìn)展。

表1 常見功能基因的引物序列Table 1 Primer sequence of common functional genes

表1 續(xù)（Continued）

1 16S rRNA 基因

細(xì)菌的核糖體RNA 有3 種類型，即23S rRNA、16S rRNA 和5S rRNA，16S rRNA 基因?yàn)榧?xì)菌、藍(lán)藻、放線菌和支原體等原核生物所共有，其功能同源且最為古老，既含有保守序列，又含可變序列。保守序列區(qū)可反映生物物種的親緣關(guān)系，為系統(tǒng)發(fā)育重建提供線索；可變序列區(qū)可揭示生物物種的特征核酸序列，是屬種水平鑒定的重要分子依據(jù)。16S rRNA 基因的序列長度約1 500 bp，分子大小適合操作，序列變化與進(jìn)化距離相適應(yīng)[43]。通過比較各類原核生物16S rRNA 基因的序列，利用序列差異計(jì)算它們之間的進(jìn)化距離，可繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，從而鑒定樣本中的分類信息[43]。Kim 等[44-45]從16S rRNA 基因序列中尋找弧菌屬保守但特異于其他菌屬的可變區(qū)位點(diǎn)，在該可變區(qū)位點(diǎn)設(shè)計(jì)創(chuàng)傷弧菌的特異性引物，建立一種檢測和鑒別創(chuàng)傷弧菌菌株的PCR 方法來代替?zhèn)鹘y(tǒng)表型鑒定法。盡管16S rRNA基因的生物信息學(xué)提供了鑒定弧菌菌株較為客觀和可靠的方法，但它在種的水平上有一定局限性，16S rRNA 基因序列幾近相同也不能保證兩個(gè)弧菌菌株屬于同一物種[46]，因此，不能鑒定到種。人們開始嘗試用其他的功能基因和特異性毒力基因進(jìn)行海洋弧菌的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，這些功能基因可與16S rRNA 基因相結(jié)合，對同屬不同物種作系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析。

2 管家基因（Housekeeping gene）

管家基因被認(rèn)為是揭示高等分類學(xué)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的潛在標(biāo)記，可為弧菌系統(tǒng)發(fā)育結(jié)構(gòu)尋找新的鑒定標(biāo)記，提高弧菌分類的準(zhǔn)確性。常用的弧菌物種鑒定基因分析方法包括擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）、重復(fù)性外源回文元件PCR（rep-PCR）、DNA-DNA 雜交和多位點(diǎn)序列分析（MLSA），弧菌科的分類很快從使用單一基因發(fā)展到使用多個(gè)基因序列進(jìn)行鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析[47]。例如，同時(shí)用8 個(gè)管家基因序列（ftsZ、gapA、gyrB、mreB、pyrH、recA、rpoA、topA）和16S rRNA 基因的MLSA 方案，為弧菌科鑒定和分類提供更高分辨率[48]。

2.1 recA

recA基因產(chǎn)物是一種多功能蛋白，有水解LexA阻遏蛋白的活性，最早發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌（Escherichia coli），參與調(diào)控多種重要的細(xì)胞功能，包括同源重組、抗紫外線和X 射線以及SOS 修復(fù)DNA 損傷介導(dǎo)的突變[49]。Llyod 首先嘗試用recA進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究[50]。1995 年Eiesn[51]分別以recA和16S rRNA基因?yàn)橄到y(tǒng)學(xué)標(biāo)記，從 Genbank 中選擇來自不同物種的DNA 序列，用相同NJ 建樹方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，發(fā)現(xiàn)二者的進(jìn)化枝模式及分辨率極為相似，在系統(tǒng)發(fā)生樹的變形細(xì)菌（Proteobacteria）、棲熱菌屬（Thermus）和耐輻射異常球菌屬（Deinococcus radiodurans）等進(jìn)化枝，recA分辨率優(yōu)于16S rRNA基因。近年來，有研究表明recA基因作為系統(tǒng)學(xué)標(biāo)記可有效地對弧菌屬進(jìn)行種的鑒定，結(jié)果顯示，當(dāng)弧菌菌株之間的16S rRNA 基因序列相似性大于98%時(shí)，弧菌recA基因之間的相似性為83%～ 99%，表明recA基因序列比16S rRNA 基因有更強(qiáng)的辨別力[52]。因此，相比于16S rRNA 基因，recA的某些區(qū)段有較高的物種專一性。

2.2 gyrB

gyrB基因常見于細(xì)菌中，編碼DNA 促旋酶B亞基蛋白，是一個(gè)單拷貝基因，也具有PCR 引物開發(fā)的保守區(qū)域，在DNA 復(fù)制過程中起重要作用[53]。gyrB基因序列已用于假單胞菌(Pseudomonades)[54]、分枝桿菌（Mycobacterium）[55]、小單孢菌（Micromonospora）[56]的分類研究，表明gyrB是一個(gè)合適的系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記，也可用于研究弧菌物種水平的系統(tǒng)發(fā)育和分類學(xué)關(guān)系[35]。Luo 等[34]對9 株溶藻弧菌的gyrB片段（約1.2 kb）進(jìn)行測序，并分析它們與其它相似弧菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，發(fā)現(xiàn)所有溶藻弧菌在系統(tǒng)發(fā)育樹中分成一個(gè)強(qiáng)支持的簇，表明gyrB是溶藻弧菌成員鑒定和分類學(xué)分析的有效靶標(biāo)，并成功開發(fā)了基于gyrB基因的PCR 方法。此外，gyrB基因也可與16S rRNA 基因序列結(jié)合進(jìn)行燦爛弧菌（V.splendidus）相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析[57]。副溶血弧菌和溶藻弧菌的16S rRNA 基因序列幾近相同，僅基于16S rRNA 基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系難以對物種進(jìn)行鑒定分類，但將它們的gyrB基因之間的系統(tǒng)發(fā)育距離放大后則可鑒定為不同物種[35]。通過gyrB序列數(shù)據(jù)分析弧菌新分離株的系統(tǒng)發(fā)育位置，每一群弧菌新分離株均滿足序列多樣性的閾值標(biāo)準(zhǔn)，為弧菌不同種屬間的序列多樣性提供了新依據(jù)[35]。

rpoA和rpoB分別編碼RNA 聚合酶的α 亞基和β 亞基，核糖核酸亞基通過二聚作用啟動(dòng)α 聚合酶的組裝，形成β 亞基相互作用的平臺(tái)[58]。該序列比16S rRNA 基因進(jìn)化更快，目前已有學(xué)者提出rpoB基因序列可作為細(xì)菌鑒定方法[59]，已被認(rèn)為適合于區(qū)分衣原體（Chlamydia）[60]、大腸桿菌（Escherichia coli）[61]和乳桿菌（Lactobacillus）[62]，并用于鑒定許多分類群中的細(xì)菌分離物，包括假單胞菌屬(Pseudomonas)[63]、棒狀桿菌（Corynebacterium）[64]和葡萄球菌（Staphylococcus）[65]。此外，該基因還可用于弧菌的分類鑒定，Dalmasso 等[40]通過設(shè)計(jì)rpoA的特異性引物，比對所有弧菌屬的rpoA基因序列，建立一種基于rpoA基因的弧菌屬PCR 檢測方法，并引入靶向16S rRNA 基因的細(xì)菌特異性引物作為非競爭性內(nèi)部擴(kuò)增對照來消除假陰性結(jié)果，結(jié)果表明，該rpoA和16S rRNA 基因結(jié)合的PCR檢測方法專屬性強(qiáng)、快速、可靠，為分離菌落中弧菌屬的鑒定提供一種常規(guī)的篩選技術(shù)[40]。對于rpoB基因，Ki 等[41]通過對從沿海水域分離到的29 株表型不同的弧菌進(jìn)行rpoB和16S rRNA 基因序列測定以及系統(tǒng)發(fā)育比較成功將29 株菌劃分為11 個(gè)不同的種，表明rpoB在弧菌屬系統(tǒng)發(fā)育樹上的分辨率約為16S rRNA 基因的3 倍。多重PCR 主要針對保守管家基因的變異，Tarr 等[42]建立一個(gè)弧菌的rpoB參考數(shù)據(jù)庫，確定rpoB基因的870 bp 部分核苷酸序列，并結(jié)合其他管家基因，鑒定無法基于表型或多重PCR分類的弧菌分離物，認(rèn)為多重PCR和rpoB的組合測序可快速準(zhǔn)確地鑒定出對人類有致病性的主要弧菌物種，rpoB可為弧菌屬的其他種提供鑒定工具。

2.4 pyrH

pyrH是編碼鳥苷酸激酶的管家基因，參與生物體內(nèi)嘧啶核苷酸從頭合成重要嘧啶代謝活動(dòng)，一般與rpoA、recA等管家基因聯(lián)合作為分子標(biāo)記，在弧菌鑒定中起重要作用[37]。Thompson[39]利用rpoA、recA和pyrH的分子標(biāo)記位點(diǎn)，包括16S rRNA 基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹均與以往的多相分類研究基本一致，從而確定三個(gè)位點(diǎn)間的種間變異，發(fā)現(xiàn)弧菌種（Vibriospp.）、發(fā)光細(xì)菌（Photobacteria）、腸弧菌（Enterovibrio）和鹽弧菌（Salinivibrio）在各分子標(biāo)記位點(diǎn)上均有不同程度的分化，每個(gè)物種明顯地形成了依基因序列相似性而分開的簇，同一弧菌屬的不同菌株rpoA、recA和pyrh基因序列的一致性分別為98%、94%和94%，說明這三個(gè)基因位點(diǎn)在物種間的區(qū)分能力比16S rRNA 基因序列更強(qiáng)。霍亂弧菌和擬態(tài)弧菌（Vibriomimicus）的表型和基因組相似，兩者難以快速分離鑒定，但同時(shí)利用管家基因pyrh、recA和rpoA的特定序列對45 株來自不同地理區(qū)域和寄主的代表性菌株進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)霍亂弧菌和擬態(tài)弧菌在每個(gè)基因的基礎(chǔ)上形成了單獨(dú)的種群，同時(shí)在這三個(gè)位點(diǎn)上，擬態(tài)弧菌比霍亂弧菌有更多的異質(zhì)性，其中pyrH基因?qū)^(qū)分霍亂弧菌和擬態(tài)弧菌的分辨率最高[66]。這些結(jié)果表明，采用rpoA、recA和pyrh基因的多位點(diǎn)序列分析方法可用于這兩種弧菌的鑒定。此外，González-Castillo 等[67]除利用16S rRNA 基因和管家基因pyrH的測序外，還通過包括表型特征以及DNA-DNA雜交多相分類學(xué)方法，分離鑒定出Vibrio toranzoniae。

3 毒力基因（Virulence gene）

弧菌通常由于其毒力基因的表達(dá)而具有致病性，在水產(chǎn)養(yǎng)殖和疾病診斷中，致病性弧菌的快速檢測顯得尤為重要，然而毒力菌株的生長特性并不明顯，且與其他細(xì)菌相比，它們的種群數(shù)量極低，所以傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法難以在臨床和食品樣品中檢測到毒力菌株[68]。因此基于毒力基因的PCR 測定法在鑒定弧菌病原體的特異性標(biāo)記物方面有較高的應(yīng)用價(jià)值。

3.1 tdh、trh 和tlh

溶血素（hemolysin）是一種外毒素，可攻擊血細(xì)胞膜并導(dǎo)致細(xì)胞破裂，可能是致病性弧菌中分布最廣的毒素，在感染過程中發(fā)揮多種作用。而編碼熱穩(wěn)定直接溶血素 (thermostable direct hemolysin)、熱穩(wěn)定直接溶血素相關(guān)溶血素（thermostable direct hemolysin-related hemolysin）和不耐熱溶血素（thermolabile hemolysin）的毒力因子基因tdh、trh和tlh與人類病原體副溶血弧菌的毒力強(qiáng)烈相關(guān)，被認(rèn)為是副溶血弧菌的特征分子標(biāo)記，也是最簡單和最常用的致病性診斷基因[16]。針對三種溶血素基因tlh、tdh和trh的多重PCR 方法已用于檢測墨西哥灣海水中的副溶血弧菌，tlh基因是種特異性的標(biāo)記物，而tdh和trh基因是致病性菌株的標(biāo)記基因，結(jié)果顯示三種靶向基因具有高度特異性，58%的牡蠣樣品有tlh陽性，表明存在副溶血弧菌，而58%的牡蠣樣品中21%為tdh陽性，0.7%為trh陽性，表明存在牡蠣樣品中的副溶血弧菌是致病性菌株[16]。2010 年還報(bào)道了同時(shí)針對tlh、tdh和trh三種靶基因的單一反應(yīng)，利用SYBRGreenTM的實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)檢測貝類和海灣水中總副溶血弧菌和致病性副溶血弧菌，該方法快速、特異、敏感和經(jīng)濟(jì)高效，有助于減少與海產(chǎn)品相關(guān)的副溶血弧菌疾病暴發(fā)[16]。需要指出的是，因?yàn)樵谝恍┓侵虏⌒跃曛胁⒉淮嬖谶@些毒力基因，這意味著這些毒力基因不能作為所有副溶血弧菌的特異性靶標(biāo)，因此，準(zhǔn)確鑒定副溶血弧菌需要更新和更準(zhǔn)確靶標(biāo)。

3.2 toxR

toxR基因雖然廣泛分布于弧菌科細(xì)菌，但在不同弧菌中調(diào)控機(jī)制不盡相同。toxR基因最先在霍亂弧菌中發(fā)現(xiàn)，由它編碼的跨膜轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白ToxR參與調(diào)控霍亂弧菌的一些主要毒力基因和外膜蛋白的表達(dá)[69-70]。在創(chuàng)傷弧菌中的ToxR 蛋白可正調(diào)控高毒性溶血素vvh 基因的表達(dá)，使其表達(dá)量提高五倍[71]。而編碼副溶血弧菌的主要致病因子——熱穩(wěn)定直接溶血素的tdh基因也受ToxR 蛋白調(diào)控[72]?；魜y弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌之間toxR基因核苷酸序列的相似性為50%～ 60%[69,71-72]。這種在弧菌科中廣泛分布而種間相似性較低的特性使toxR基因成為弧菌科菌種鑒定的良好分子靶標(biāo)。Franco等[73]采用PCR 方法擴(kuò)增哈維氏弧菌的toxR基因片段，其序列分析和比對結(jié)果表明，哈維氏弧菌toxR基因與副溶血弧菌的toxR基因序列同源性為87%，與河流弧菌（Vibrio fluvialis）的同源性為84%，與創(chuàng)傷弧菌的同源性為83%，與坎氏弧菌（Vibrio campbellii）的部分序列相似；與16S rRNA 基因相比，toxR基因的系統(tǒng)發(fā)育樹差異更大，易將哈維氏弧菌、坎氏弧菌和副溶血弧菌區(qū)分開。另外，將toxR基因序列和毒力基因（tdh和trh）結(jié)合，有助于快速檢測從臨床標(biāo)本中分離的疑似副溶血弧菌菌株，從而特異性鑒定副溶血弧菌[24]。Fu 等[74]建立了一種基于環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)的快速診斷方法，對靶向溶藻弧菌的toxR基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，成功鑒定來自105 種不同細(xì)菌分離物的93 種溶藻弧菌菌株，并通過16S rRNA 基因測序證實(shí)它們的同一性。

3.3 ctxA 和hlyA

霍亂毒素和溶血素是霍亂弧菌產(chǎn)生致病性的主要原因，ctxA和hlyA是產(chǎn)生這兩種毒素的編碼基因，通過PCR 擴(kuò)增霍亂毒素A 亞基基因（ctxA）的部分片段（564 bp）可鑒定產(chǎn)毒霍亂弧菌O1 類群菌株[75]，亦可與ctxA毒素調(diào)節(jié)因子基因（toxR）、60 ku 伴侶蛋白產(chǎn)物基因（groEL）等其他多種致病相關(guān)基因結(jié)合作為檢測的靶序列，對各種環(huán)境水樣中產(chǎn)毒霍亂弧菌進(jìn)行快速檢測和鑒定[76]。此外，Shangkuan 等[77]用擴(kuò)增ctxA2-B 基因片段的引物和針對hlyA基因的三個(gè)引物建立了多重PCR 技術(shù)，用于產(chǎn)毒素霍亂弧菌和O1 型霍亂弧菌的鑒定。

4 其他基因

Wang 等[78]以編碼毒力調(diào)節(jié)蛋白irgB的基因?yàn)槟繕?biāo)，建立了針對irgB、tdh和trh基因的多重PCR檢測副溶血弧菌分離株和毒力菌株的方法，結(jié)果表明，irgB基因是一種新的、有效的副溶血弧菌檢測標(biāo)記。hsp60基因可作為海洋弧菌系統(tǒng)發(fā)育分析和物種鑒定的一個(gè)有用的替代目標(biāo)，以補(bǔ)充更常規(guī)的鑒定系統(tǒng)[11]。hsp60基因在不同弧菌種屬間的序列同源性為71%～ 82%，同種弧菌菌株之間的序列同源性為96%～100%，可明確區(qū)分目前研究中的絕大多數(shù)弧菌物種，以及經(jīng)常被傳統(tǒng)的生化方法誤認(rèn)為是弧菌的嗜水氣單胞菌和類志賀毗鄰單胞菌[11]。編碼熱休克蛋白的groESL在細(xì)菌中普遍存在且高度保守，groESL基因中的基因間隔區(qū)（ISR）不僅可檢測弧菌種，還可特異性地檢測副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌[79]。與其他管家基因相比，dnaJ基因在區(qū)分溶珊瑚弧菌（Vibriocoralliilyticus）和海神弧菌（Vibrio neptunius）、哈維氏弧菌和半滑舌鰨病原菌輪蟲弧菌（Vibrio rotiferianus）方面優(yōu)于recA和rpoA，可作為鑒定弧菌種類的新工具[80]。Nhung 等[81]還利用dnaJ基因建立了一種適用于常規(guī)診斷實(shí)驗(yàn)室的PCR 方法，用于鑒定霍亂弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、擬態(tài)弧菌和溶藻弧菌等5 種人類病原體；除這5 種弧菌和非弧菌菌株外，其他所有菌株均無特異性PCR 片段。Machado 等[69]利用基于103 個(gè)弧菌科菌株基因組的數(shù)據(jù)平臺(tái)，發(fā)現(xiàn)fur基因的種內(nèi)相似性大于95%，與16S rRNA 基因和MLSA 分析結(jié)果一致，證明fur基因在鑒定弧菌科物種中的高分辨率及其作為一個(gè)系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記的作用。fur基因系統(tǒng)發(fā)育能力的發(fā)現(xiàn)和PCR 方法的發(fā)展可用于該基因的擴(kuò)增和測序，無論是單獨(dú)使用，還是和MLSA中的位點(diǎn)一起使用，都是人們普遍關(guān)注的問題。除上述功能基因外，還有tnaA、vhhA和luxR等基因正在逐漸被用于海洋弧菌的鑒定分類[28,82-83]。

5 展望

16S rRNA 基因的分子鑒定技術(shù)已較成功地用于弧菌分類鑒定，但該方法在特定情況下無法很好地鑒定弧菌種間差異。目前，一般采用recA、gyrB、pyrH等管家基因，tdh、tlh、trh等毒力基因和16S rRNA 基因相結(jié)合進(jìn)行特定弧菌的系統(tǒng)鑒定與分類研究。此外，近年來，MLSA 技術(shù)分子等標(biāo)記技術(shù)也常用于弧菌種類鑒定，盡管提高了弧菌屬系統(tǒng)發(fā)育的分辨率，但此類技術(shù)需進(jìn)行多個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增和測序，不僅提高了研究成本，其鑒定結(jié)果也存在一定誤差?；蚪M測序技術(shù)的快速發(fā)展和微生物基因組大數(shù)據(jù)的爆炸式增長將更有利于研究人員針對弧菌基因組信息，深入發(fā)掘可用于弧菌分類鑒定的功能性基因和管家基因資源，通過不斷探索新型基因分子靶標(biāo)和特異性引物，實(shí)現(xiàn)弧菌屬精準(zhǔn)鑒定，完善分類系統(tǒng)，從而促進(jìn)海洋弧菌的多樣性研究?？傊瑐鹘y(tǒng)的弧菌檢測方法，已無法滿足當(dāng)前海洋弧菌的多樣性研究和致病性弧菌的監(jiān)測和防控工作需要，采用PCR 技術(shù)，研發(fā)新型特異種屬的功能基因檢測勢在必行。