梔子油對對乙酰氨基酚致小鼠急性肝損傷的保護作用

張俊逸，羅光明,2，柴華文，劉培培，朱梓豪

(1.江西中醫(yī)藥大學 藥學院，南昌 330004； 2.江西中醫(yī)藥大學 中藥資源與民族藥研究中心,南昌 330004)

對乙酰氨基酚是一種治療普通及流行性感冒的乙酰苯胺類解熱鎮(zhèn)痛藥，因其對發(fā)熱疼痛療效好且副作用小而被廣泛用于臨床，短期低劑量使用不會對肝臟代謝造成影響，但大劑量服用對乙酰氨基酚或多種含對乙酰氨基酚的藥物聯(lián)合服用均會引起肝臟代謝有毒物質(zhì)的積累，進而導致細胞損傷、炎癥發(fā)生的藥源性肝損傷[1]。

梔子來源于茜草科植物梔子(GardeniajasminoidesEllis)的干燥成熟果實，性苦、味寒，有瀉火除煩、涼血解毒的功效，主要含有環(huán)烯醚萜類、有機酸類和梔子黃色素等成分[2-3]，具有極高的藥用價值。梔子油占梔子果實的13%左右[4]。國內(nèi)外藥理研究表明，梔子油具有鎮(zhèn)靜、提高記憶力、抗氧化、保肝等作用[5-7]。本實驗采用對乙酰氨基酚建立藥物性肝損傷模型，探討梔子油對對乙酰氨基酚所致小鼠急性肝損傷的保護機制，為梔子油保肝作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF級KM雄性小鼠，體重16～20 g ，共72只，由山東省實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號為SCXK(魯)20140007，于江西中醫(yī)藥大學實驗大樓動物房飼養(yǎng)，自由進食進水，適應3 d，動物房溫度25～28℃、濕度35%～55%。

1.1.2 原料與試劑

梔子，購自江西省九江市湖口縣順昌梔子藥材基地，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學中藥資源學科羅光明教授鑒定為茜草科植物梔子(GardeniajasminoidesEllis)的干燥成熟果實。

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT，批號20171011)、天門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶(AST，批號20171007)、白蛋白(ALB，批號20171014)、還原型谷胱甘肽(GSH，批號20171028)、超氧化物歧化酶(SOD，批號20170615)、丙二醛(MDA，批號20170610)試劑盒，蘇木素-伊紅染液(批號20170428)，南京建成生物工程研究所；聯(lián)苯雙酯滴丸(生產(chǎn)批號 170914，每丸1.5 mg)，浙江萬邦藥業(yè)股份有限公司；對乙酰氨基酚片(生產(chǎn)批號170412,每片0.5 g)，廣東環(huán)球制藥有限公司；吐溫-80。

1.1.3 儀器與設備

Sartorius bs224s 電子分析天平；DY89-II 電動勻漿機；UV-1800型紫外可見光分光光度計，島津公司(日本)；Multiskan Go酶標儀，賽默飛世爾科技公司(上海)；Allegra64R 高速冷凍離心機，Beckman 公司(USA)；JW-3021HR高速冷凍離心機；DFY-400搖擺式中藥粉碎機；TKY-BMB型石蠟包埋機及專用包埋冷臺；Vortex-Genie 2渦旋混合器，美國Scientific Industries公司；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋；RE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；XHF-D 勻漿機。

1.2 實驗方法

1.2.1 供試藥物的提取

取干燥后的梔子，經(jīng)中藥粉碎機粉碎后，過20目篩，加5倍量的石油醚，于85℃索氏提取3 h后，旋蒸回收石油醚，得梔子油，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 動物分組及給藥

將72只KM小鼠隨機分為6組，分別為正常對照組，模型對照組，聯(lián)苯雙酯陽性對照組(0.2 g/kg)，梔子油低劑量(0.3 g/kg)、中劑量(0.6 g/kg)、高劑量(1.2 g/kg)組。本實驗用0.5%吐溫-80溶液溶解聯(lián)苯雙酯和梔子油。正常對照組和模型對照組正常飲食、飲水，其余各組每天給藥1次，連續(xù)7 d，末次給藥后1 h，除正常對照組腹腔注射無菌生理鹽水外，其余各組小鼠一次性腹腔注射450 mg/kg對乙酰氨基酚制備急性肝損傷模型，禁食不禁水，24 h后摘除小鼠眼球取血，測定血清生化指標，取出肝臟用于肝臟生化指標測定和肝組織病理學檢查。

1.2.3 指標測定

全血3 000 r/min離心10 min，取上層血清，檢測 ALT、AST和ALB水平；取0.1 g肝臟組織，用4℃生理鹽水制成10%的肝勻漿，離心，取上清液，檢測SOD、MDA、GSH水平。各指標的檢測均按其試劑盒說明書進行操作。

1.2.4 肝臟組織學分析

取各組小鼠肝臟相同部位的肝組織，用10%甲醛溶液固定，之后進行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片展片、HE染色，在置光鏡下觀察肝組織的損傷程度。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 梔子油對急性肝損傷小鼠血清 ALT、AST和ALB水平的影響(見表1)

從表1可以看出，與正常組相比，模型組小鼠血清ALT和AST水平顯著升高(p<0.001)，ALB水平顯著降低(p<0.001)，說明急性藥物性肝損傷模型建造成功。與模型組相比：聯(lián)苯雙酯組小鼠血清中ALT和AST水平均顯著下降(p<0.001)，ALB水平顯著升高(p<0.001)；梔子油中、高劑量組小鼠血清中ALT和AST水平均具有顯著性降低趨勢(p<0.01、p<0.001)，ALB水平顯著降低(p<0.001)，且高劑量組優(yōu)于中劑量組，呈劑量依賴性。表明梔子油對對乙酰氨基酚所致小鼠急性肝損傷具有一定的保護作用。

表1 梔子油對小鼠血清 ALT、AST和ALB水平的影響

2.2 梔子油對急性肝損傷小鼠肝臟GSH、SOD和MDA水平的影響(見表2)

從表2可以看出，與正常組比較，模型組小鼠肝組織產(chǎn)生了明顯的氧化應激反應，表現(xiàn)在MDA水平顯著提高(p<0.001)，GSH和SOD活力顯著降低(p<0.001)。與模型組相比，聯(lián)苯雙酯組GSH和SOD活力顯著升高(p<0.001)；梔子油中、高劑量組MDA 水平顯著降低(p<0.001)，GSH和SOD活力顯著升高(p<0.05、p<0.01、p<0.001)，改善程度高劑量組優(yōu)于中、低劑量組，呈劑量依賴性。

表2 梔子油對小鼠肝臟GSH、SOD和MDA水平的影響

2.3 肝臟病理學檢查(見圖1)

圖1 小鼠肝組織掃描電鏡圖

從圖1可以看出，正常組小鼠肝組織細胞排列整齊，圍繞中央靜脈呈輻射狀且形態(tài)正常。模型組小鼠肝小葉及匯管區(qū)細胞可以看到明顯浸潤及腫脹現(xiàn)象，中央靜脈周圍細胞出現(xiàn)空泡和灶狀壞死。聯(lián)苯雙酯組小鼠肝細胞則出現(xiàn)明顯改善，腫脹及彌散情況減少，趨于健康。梔子油各劑量組細胞壞死情況均已得到改觀，炎性細胞浸潤現(xiàn)象減弱，細胞排列趨于整齊，說明梔子油對肝損傷組織具有明顯的保護作用。

2.4 討論

藥物性肝損傷是指藥物使用過程中對機體肝臟造成的損傷，輕度損傷在停藥后會慢慢恢復，重則會危及生命，所以藥物性肝損傷對藥物臨床研發(fā)及應用有著密切的影響[8]。對乙酰氨基酚導致的氧化應激反應是造成急性肝損傷的主要原因[9]。血清中ALT、AST的水平是評價肝損傷程度的敏感指標[10]，大劑量使用對乙酰氨基酚可導致ALT、AST水平在1～3 h內(nèi)升高[11]，實驗中灌胃梔子油后，小鼠ALT和AST水平顯著降低，說明梔子油在一定程度上降低了對乙酰氨基酚對肝細胞膜的損害。ALB是一種具有抗氧化和損傷修復功能的蛋白，小鼠灌胃梔子油后ALB的水平升高說明梔子油可以促進ALB的分泌與合成，進而提高肝細胞自我修復能力。GSH是一種廣泛存在于機體內(nèi)的抗氧化酶，具有高效清除脂質(zhì)過氧化物的作用[12]。部分對乙酰氨基酚進入肝臟結(jié)合細胞色素P450產(chǎn)生大量中間代謝產(chǎn)物N-乙酰對苯醌亞胺(NAPQI)，該產(chǎn)物有毒性，可與肝臟中谷胱甘肽(GSH)結(jié)合并代謝出體外[13]。梔子油可提高GSH水平進而減輕肝損傷的程度。SOD是機體清除自由基的特異性超氧化物歧化酶，SOD活力的降低直接表明機體內(nèi)自由基的增加[14]。MDA是脂質(zhì)過氧化反應的重要產(chǎn)物，可引起一系列的交聯(lián)反應，并會引起細胞損傷，其水平高低間接反映機體細胞受自由基攻擊的程度[15]。相比模型組，使用梔子油后小鼠血清中SOD活力明顯上升、MDA水平顯著下降，表明梔子油可通過清除氧自由基來產(chǎn)生對肝細胞的保護作用。

3 結(jié) 論

本實驗中通過對小鼠腹腔注射高劑量對乙酰氨基酚溶液，導致小鼠出現(xiàn)肝臟損傷現(xiàn)象，探討梔子油對對乙酰氨基酚致小鼠急性肝損傷的保護作用。結(jié)果表明，梔子油高、中劑量組小鼠血清中ALT和AST的水平均有明顯下降，ALB、GSH和SOD活性提高，MDA水平降低，肝組織切片顯示肝組織變性及壞死等病理癥狀明顯改善。說明梔子油具有清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化反應、防止細胞膜受損、減輕細胞腫脹壞死的效果，對藥物所致肝損傷具有顯著保護作用。綜上所述，梔子油對對乙酰氨基酚所致肝損傷具有一定的保護作用，其保護機制與提高抗氧化酶體系活力、抑制脂質(zhì)過氧化、維持肝細胞膜正常形態(tài)有關。