反棕櫚油酸對人肝細胞脂質(zhì)的影響

陶 林，鄧澤元，范亞葦，李 靜

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，南昌330047)

心血管疾病是目前世界上危害最大的疾病，心血管疾病造成的死亡率最高[1]，而高血脂和肥胖是與心血管疾病聯(lián)系最緊密的癥狀[2]。在我們的飲食中過量的反式脂肪酸是造成高血脂的重要原因[3]。反式脂肪酸分為工業(yè)來源和反芻動物來源兩大類，食用大量工業(yè)來源反式肪酸被證實會產(chǎn)生高血脂進而引發(fā)動脈粥樣硬化[4]，而對反芻動物來源反式脂肪酸的研究還不是很清晰，需要更深入研究。近年來，人們對肉制品和奶制品的需求提高，而反芻動物反式脂肪酸主要來源于這兩者，因此人們攝入的反芻動物反式脂肪酸也越來越多，研究反芻動物反式脂肪酸對人體健康主要是對心血管疾病的作用尤為重要。

反棕櫚油酸(9t16∶1)是主要的反芻動物反式脂肪酸之一，人體不能從頭合成反棕櫚油酸，需要通過飲食或者體內(nèi)其他脂肪酸發(fā)生反應(yīng)轉(zhuǎn)化得到，因此其在人體內(nèi)含量很少。對于9t16∶1的作用報道很少，僅國外有過少數(shù)相關(guān)研究。有研究表明9t16∶1與腰圍和內(nèi)臟指數(shù)呈正相關(guān)，但與皮下脂肪層呈負相關(guān)[5]。Mozaffarian 等[6]報道9t16∶1 有降低血脂，降低甘油三酯含量，升高高密度脂蛋白膽固醇水平，減少動脈粥樣硬化發(fā)病率等作用。Kleber等[7]通過臨床實驗也發(fā)現(xiàn)9t16∶1具有降低心血管疾病發(fā)病率的作用。Labonte等[8]報道了紅細胞膜TFA指數(shù)與10年冠心病風(fēng)險概率的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)9t16∶1水平在健康人群血漿紅細胞膜中高于冠心病患者。這些研究大都是臨床研究或前瞻性調(diào)查，用9t16∶1進行具體的細胞或動物實驗探討其生物學(xué)功能的很少，而以9t16∶1為原料對其影響脂質(zhì)的探索比臨床調(diào)查更有實際意義。

人肝細胞LO2是研究脂質(zhì)代謝常用的細胞之一，可以作為體外研究脂質(zhì)對人體影響的良好模型[9]。本實驗采用LO2細胞為研究對象，研究不同濃度反棕櫚油酸對細胞脂質(zhì)代謝的影響，為進一步研究反棕櫚油酸對人體肥胖和心血管健康的影響提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人肝細胞株LO2，購自武漢普諾賽生命科技有限公司；胎牛血清(FBS)、RPMI1640培養(yǎng)基，均購自以色列Biolnd公司；青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶和噻唑藍(MTT)，均購自北京索萊寶科技有限公司；反棕櫚油酸標準品，購自上海安譜實驗科技股份有限公司；油酸標準品，購自上海阿拉丁試劑有限公司；牛血清白蛋白(BSA)，購自美國Sigma公司；脂質(zhì)氧化(MDA)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒、活性氧(ROS)檢測試劑盒、BCA檢測試劑盒，均購自碧云天生物技術(shù)研究所；甘油三酯檢測試劑盒、膽固醇檢測試劑盒、油紅O染液，均購自南京建成科技有限公司。

AL104型電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；HH-1恒溫水浴鍋；DGG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；LDZX-50KBS立式壓力滅菌器；37XC型倒置顯微鏡；BHC-1300A/B3型生物安全柜；GPST200型CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱；DSY-Ⅳ型水浴氮吹儀；6890N型氣相色譜儀，美國Agilent公司；全波段酶標儀，美國BioTek公司；Nikon ECLIPSE Ti-U熒光倒置顯微鏡，日本Nikon公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 LO2細胞培養(yǎng)

將解凍后的LO2細胞加入含10%FBS、1%青霉素和1%鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞長至90%時，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞兩次，加入1 mL含0.125%胰蛋白酶、0.02%EDTA的消化液消化1 min，去掉消化液加入培養(yǎng)基將細胞吹至單細胞懸液，分裝到新的培養(yǎng)瓶，放置到5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，傳至兩代后用于實驗。

1.2.2 MTT法檢測細胞活力

待按1.2.1方法培養(yǎng)的LO2細胞長至80%，消化吹至單細胞懸液，將細胞濃度稀釋到105個/mL，接種于96孔板，每孔加入200 μL，每個濃度設(shè)置6個平行。將96孔板放至5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中12 h，然后加入反棕櫚油酸至不同濃度(5、25、50、100、200 μmol/L)，脂肪酸儲存液是與不含脂肪酸的BSA結(jié)合配制，稀釋成不同濃度用于實驗，另外設(shè)置與實驗組BSA濃度相同的對照組。處理24 h后加入20 μL MTT溶液(5 μg/mL)，繼續(xù)置于37℃處理4 h，最后去掉處理液加入150 μL DMSO，振蕩混勻10 min，于490 nm測定各組OD值。細胞存活率=實驗組OD/對照組OD×100%。

1.2.3 細胞脂肪酸組成的測定

將LO2細胞接種于15 cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)12 h后加入反棕櫚油酸至不同濃度(25、50、100 μmol/L)，每個濃度重復(fù)3個平行，另外設(shè)置對照組。作用24 h后去掉培養(yǎng)基，用PBS清洗，采用Folch法并進行修改以提取細胞中脂質(zhì)[10]，將細胞刮下用氯仿-甲醇(體積比2∶1)提取，離心取氯仿層，氮氣吹干得總脂肪。采用三氟化硼-甲醇法進行甲酯化，C13作為內(nèi)標，用氣相色譜測定脂肪酸組成。

氣相色譜條件：色譜柱為CP-Si188熔融石英毛細管柱(100 m×0.25 mm×0.2 μm)；燃氣和載氣分別為H2、N2；進樣口溫度250℃，F(xiàn)ID溫度250℃；升溫程序為45℃保持4 min，以13℃/min升溫至175℃，保持27 min，再以4℃/min升溫至215℃，保持35 min。

1.2.4 脂肪變性肝細胞模型的建立

1.2.4.1 油酸對LO2細胞活力的影響

將LO2細胞接種于96孔板，加入油酸至不同濃度(50、125、250、500、1 000 μmol/L)，同時設(shè)置對照組檢測其對細胞活力的影響，具體檢測方法同1.2.2。

1.2.4.2 油酸對LO2細胞甘油三酯的影響

將LO2細胞接種于6 cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)12 h后加入油酸至不同濃度(50、125、250、500、1 000 μmol/L)，同時設(shè)置對照組，每個濃度設(shè)置3個平行，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，去掉處理液，用PBS清洗兩遍，加入裂解液裂解細胞，按甘油三酯試劑盒和BCA試劑盒說明書測定甘油三酯和蛋白含量。

1.2.5 油紅O染色觀察脂質(zhì)堆積

將LO2細胞接種于6孔板，在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后加入不同組藥物作用：油酸組、不同濃度反棕櫚油酸(5、25、50、100 μmol/L)和油酸混合組，同時設(shè)置對照組。作用24 h后，用PBS洗滌細胞兩次，用4%多聚甲醛固定細胞10 min，棄掉固定液用PBS洗一次，用油紅O工作液染色10～15 min，PBS洗5～20 s。再加入蘇木素復(fù)染3～5 min，PBS洗30～60 s，最后在倒置顯微鏡下觀察細胞染色情況。

1.2.6 甘油三酯和膽固醇的測定

將LO2細胞接種于6 cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)12 h后加入不同組藥物作用：油酸組、不同濃度反棕櫚油酸(5、25、50、100 μmol/L)和油酸混合組，同時設(shè)置對照組，每個濃度設(shè)置3個平行。處理24 h后用裂解液裂解細胞，按照甘油三酯試劑盒、膽固醇試劑盒和BCA試劑盒說明書測定甘油三酯、膽固醇和蛋白含量。

1.2.7 細胞內(nèi)MDA、SOD的測定

將LO2細胞分別接種于10 cm培養(yǎng)皿和6 cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)12 h后加入不同組藥物作用：油酸組、不同濃度反棕櫚油酸(5、25、50、100 μmol/L)和油酸混合組，同時設(shè)置對照組，每個濃度設(shè)置3個平行。作用24 h后10 cm培養(yǎng)皿細胞用裂解液裂解，按照MDA試劑盒說明書測定MDA含量，6 cm培養(yǎng)皿細胞用試劑盒中配制液處理細胞并按照SOD試劑盒說明書測定SOD含量，均采用BCA試劑盒測定蛋白含量。

1.2.8 細胞內(nèi)ROS測定

將LO2細胞接種于黑色底部透明96孔板中，培養(yǎng)12 h后加入不同組藥物作用：油酸組、不同濃度反棕櫚油酸(5、25、50、100 μmol/L)和油酸混合組，同時設(shè)置對照組，每個濃度設(shè)置6個平行。去掉含處理藥物培養(yǎng)基，PBS洗兩遍，加入用無血清配制的DCFH-DA探針，37℃處理20 min，然后去掉有探針的培養(yǎng)基，PBS洗3遍，加入200 μL PBS于488 nm激發(fā)波長、525 nm發(fā)射波長下測定OD值，ROS相對含量=實驗組OD/對照組OD×100%[11]。

1.2.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果與討論

2.1 反棕櫚油酸對LO2細胞存活率的影響(見圖1)

注：圖中不同字母表示組間有顯著性差異(P<0.05)，下同。

由圖1可知，與對照組相比，在一定濃度范圍內(nèi)(5、25、50、100 μmol/L)反棕櫚油酸對細胞存活率無顯著影響，但是當(dāng)反棕櫚油酸濃度提高到200 μmol/L時，細胞存活率顯著下降到87%(P<0.05)。說明反棕櫚油酸濃度在100 μmol/L以內(nèi)對LO2細胞存活率沒有影響，但是當(dāng)濃度大于200 μmol/L后會對細胞造成損傷。因此，本文主要研究5、25、50、100 μmol/L反棕櫚油酸對LO2細胞的影響。

2.2 反棕櫚油酸對LO2細胞脂肪酸組成的影響

表1為3種不同濃度的反棕櫚油酸(25、50、100 μmol/L)作用LO2細胞24 h對細胞脂肪酸組成及含量的影響。從表1可以看出，加入不同濃度反棕櫚油酸后，LO2細胞脂肪酸組成發(fā)生了明顯變化，與對照組相比，加入反棕櫚油酸組中，飽和脂肪酸16∶0、18∶0和24∶0含量顯著降低，細胞內(nèi)反棕櫚油酸(9t16∶1)的含量隨著作用細胞的反棕櫚油酸濃度的增加顯著提升，呈濃度依賴性。9t16∶1在肝細胞內(nèi)會轉(zhuǎn)化為單不飽和脂肪酸11t18∶1，不同濃度(25、50、100 μmol/L)反棕櫚油酸組其轉(zhuǎn)化率分別為4.05%、17.85%、17.50%。但是單不飽和脂肪酸油酸9c18∶1含量的變化與加入反棕櫚油酸的濃度總體呈負相關(guān)，反棕櫚油酸濃度越大，油酸含量顯著減少。與對照組相比可以明顯看到加入反棕櫚油酸后細胞內(nèi)生成了共軛亞油酸(CLA)，不同濃度(25、50、100 μmol/L)反棕櫚油酸組其轉(zhuǎn)化率分別為37.45%、18.36%、16.42%。加入反棕櫚油酸后細胞內(nèi)飽和脂肪酸(SFA)含量均下降，都小于對照組中SFA含量(103.87 μg/mg)，不同濃度(25、50、100 μmol/L)反棕櫚油酸組SFA含量分別降低25.04%、14.70%、34.89%；單不飽和脂肪酸(MUFA)含量與對照組相比，25 μmol/L反棕櫚油酸組降低25.73%，50、100 μmol/L反棕櫚油酸組分別升高1.5%和16.44%；多不飽和脂肪酸(PUFA)含量變化趨勢與MUFA一樣，與對照組相比，25 μmol/L反棕櫚油酸組降低4.35%，50、100 μmol/L反棕櫚油酸組分別升高18.94%和30.50%。通過氣相色譜測定細胞脂肪酸組成可以知道反棕櫚油酸對細胞脂肪酸組成造成了較大改變，使飽和脂肪酸含量減少，不飽和脂肪酸含量增加，同時轉(zhuǎn)化生成了反異油酸(11t18∶1)和共軛亞油酸(CLA)，且其含量都隨著反棕櫚油酸濃度的增加而升高，這與Kadegowda等[12]研究結(jié)果一致，即牛脂肪細胞中有50%的9t16∶1 通過碳鏈延長酶生成11t18∶1，并且在牛脂肪細胞中9t16∶1 會內(nèi)源性生成9c11t共軛亞油酸。

表1 不同濃度反棕櫚油酸對LO2細胞脂肪酸組成及含量(以蛋白質(zhì)量計)的影響

注：表中小寫字母表示不同處理組間脂肪酸含量有顯著性差異(P<0.05)。

2.3 脂肪變性LO2細胞模型的建立

脂肪變性肝細胞LO2可以作為研究人脂肪肝疾病的體外模型，脂肪肝疾病是現(xiàn)代社會中危害很大的疾病，脂肪肝疾病繼續(xù)惡化嚴重的會患肝癌[13]，因此本研究從反芻動物反式脂肪酸的角度探討對人體有利的反式脂肪酸是否能改善脂肪變性LO2細胞狀態(tài)。本實驗采用油酸作用LO2細胞使其產(chǎn)生脂肪變性，通過測定相應(yīng)甘油三酯含量的變化判定脂肪變性模型建立是否成功。圖2為不同濃度的油酸對LO2細胞存活率的影響。從圖2可以看出,油酸在500 μmol/L以內(nèi)對細胞存活率無明顯影響，但在1 000 μmol/L時細胞存活率顯著降低為62.64%。

圖3為不同濃度的油酸(50、125、250、500、1 000 μmol/L)作用LO2細胞24 h后甘油三酯含量的變化。

圖2 不同濃度油酸對LO2細胞存活率的影響

圖3 不同濃度油酸對LO2細胞甘油三酯(TG)的影響

由圖3可知,隨著油酸濃度的增加，細胞內(nèi)甘油三酯含量顯著上升，呈濃度依賴性，說明用油酸建造脂肪變性模型方法可靠。在500 μmol/L油酸組中甘油三酯的含量是對照組的3倍左右，且相對于1 000 μmol/L油酸組該組對細胞無明顯毒性作用。因此，后續(xù)實驗采用500 μmol/L油酸對LO2細胞建立脂肪變性模型。

2.4 反棕櫚油酸對脂肪變性LO2細胞脂質(zhì)含量的影響

圖4為油紅O染色觀察反棕櫚油酸對脂肪變性LO2細胞脂質(zhì)堆積的影響。

由圖4可知，與對照組相比，油酸造模組紅色脂滴數(shù)量多且明顯，對照組無紅色脂滴。5 μmol/L反棕櫚油酸混合組紅色脂滴明顯，但25、50、100 μmol/L反棕櫚油酸混合組紅色脂滴較油酸組數(shù)量減少。

圖4 油紅O染色觀察反棕櫚油酸對脂肪變性LO2細胞脂質(zhì)堆積的影響

圖5、圖6分別為反棕櫚油酸對脂肪變性LO2細胞中甘油三酯和膽固醇含量的影響。

圖5 反棕櫚油酸對脂肪變性LO2細胞甘油三酯(TG)的影響

由圖5可以看出，加入油酸后細胞內(nèi)甘油三酯含量顯著上升，但與單獨油酸作用組相比，油酸與反棕櫚油酸混合組隨著反棕櫚油酸的加入甘油三酯的含量顯著下降(P<0.05)，在100 μmol/L反棕櫚油酸混合組中甘油三酯含量下降最明顯，下降了61.76%。

圖6 反棕櫚油酸對脂肪變性LO2細胞膽固醇(TC)的影響

由圖6可以看出，加入油酸和反棕櫚油酸后細胞內(nèi)膽固醇的含量變化與甘油三酯含量變化類似，單獨油酸組膽固醇含量較對照組顯著上升，隨著混合組中反棕櫚油酸濃度的增加膽固醇含量下降，與單獨油酸作用組相比，100 μmol/L反棕櫚油酸混合組膽固醇含量下降37.80%。甘油三酯和膽固醇含量變化可以說明，反棕櫚油酸具有降低脂肪變性細胞中脂質(zhì)的作用，這與王皖婧等[14]的研究結(jié)果類似。

由反棕櫚油酸對細胞脂肪酸組成的影響和對甘油三酯、膽固醇含量的影響可以推測，反棕櫚油酸能降低脂質(zhì)的原因可能是反棕櫚油酸在脂肪變性LO2細胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為共軛亞油酸，共軛亞油酸具有調(diào)節(jié)血液膽固醇和甘油三酯水平，促進脂肪分解，防止動脈粥樣硬化的作用。反棕櫚油酸通過轉(zhuǎn)變?yōu)楣曹梺営退釓亩哂泄曹梺営退岬淖饔?，不過具體的機理還需要對其調(diào)節(jié)脂肪代謝通路蛋白和基因進行研究，以便了解反棕櫚油酸在細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)化和調(diào)節(jié)作用。

2.5 反棕櫚油酸對脂肪變性LO2細胞氧化的影響

圖7為反棕櫚油酸對脂肪變性LO2細胞脂質(zhì)氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量的影響。

圖7 反棕櫚油酸對脂肪變性LO2細胞MDA的影響

由圖7可以看出，油酸組與對照組相比MDA含量無顯著變化，混合組中隨著反棕櫚油酸濃度的增加細胞內(nèi)MDA含量呈上升趨勢，在100 μmol/L時MDA含量最高，為2.8 nmol/mg，與單獨油酸作用組相比上升45.36%。

圖8為反棕櫚油酸對脂肪變性LO2細胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活力的影響。

圖8 反棕櫚油酸對脂肪變性LO2細胞SOD活力的影響

從圖8可以看出，加入油酸后細胞內(nèi)SOD活力有所下降，且隨著混合組中反棕櫚油酸濃度的增加SOD活力下降顯著，呈濃度依賴性，其中100 μmol/L反棕櫚油酸混合組下降了74.42%。圖7、圖8說明反棕櫚油酸會使脂肪變性LO2細胞內(nèi)脂質(zhì)氧化增加，產(chǎn)生更多的丙二醛，同時使SOD活力下降?？赡茉蚴欠醋貦坝退釙{(diào)節(jié)細胞內(nèi)脂質(zhì)代謝通路使脂質(zhì)氧化分解增加，從而使細胞內(nèi)脂質(zhì)氧化產(chǎn)物丙二醛含量較油酸組和對照組顯著提高，SOD活力下降。

通過對反棕櫚油酸作用的脂肪變性LO2細胞脂質(zhì)氧化指標進行檢測，發(fā)現(xiàn)反棕櫚油酸在降低脂質(zhì)的同時會產(chǎn)生丙二醛，降低SOD活力。這進一步說明反棕櫚油酸會增加脂肪變性細胞內(nèi)脂質(zhì)氧化分解，對于這方面的研究目前還未見報道，不過Bolsoni-Lopes等[15]發(fā)現(xiàn)反棕櫚油酸異構(gòu)體9c16∶1能通過PPAR-α受體增加脂肪細胞中脂肪酶的含量并增加脂肪分解。本研究表明反棕櫚油酸可能與其異構(gòu)體有類似作用，通過促進脂肪分解從而降低脂肪總含量。

圖9為反棕櫚油酸對脂肪變性LO2細胞內(nèi)ROS相對含量的影響。

圖9 反棕櫚油酸對脂肪變性LO2細胞ROS相對含量的影響

由圖9可以看出，與對照組相比，油酸組ROS相對含量顯著增加，混合組中ROS相對含量與油酸組無顯著差異，說明反棕櫚油酸對脂肪變性LO2細胞內(nèi)ROS無明顯影響。

3 結(jié) 論

反棕櫚油酸作為反芻動物反式脂肪酸之一，對人肝細胞中脂質(zhì)代謝有重要作用。本研究數(shù)據(jù)表明反棕櫚油酸可以使脂肪變性肝細胞內(nèi)高脂狀態(tài)有所改善，減少飽和脂肪酸，增加脂質(zhì)氧化程度，降低細胞內(nèi)的高脂質(zhì)水平，說明反棕櫚油酸可能是脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)因子之一。對于其調(diào)節(jié)機理需要進一步地對脂質(zhì)代謝通路上相關(guān)酶和蛋白進行檢測，從而對反棕櫚油酸的作用進行更深入研究。