測(cè)定菜籽油中酚類(lèi)化合物樣品前處理方法的比較

宋軍鴿，曹 晨，李進(jìn)偉，徐勇將，劉元法

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

酚類(lèi)化合物在植物體內(nèi)廣泛存在，其在油菜籽中的含量較高，主要包括酚酸和單寧[1]。油菜籽在制油過(guò)程中，會(huì)有部分酚類(lèi)化合物轉(zhuǎn)移至油中，從而改善菜籽油的抗氧化性能和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。劉陽(yáng)等[2]對(duì)7種食用植物油中的微量活性成分進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)菜籽油的總酚含量最高，約為139.83 mg/kg。研究表明，酚類(lèi)化合物具有抗氧化、抗菌、抗癌、降血脂、防治心血管疾病等生理功能，對(duì)人體健康有益[3-5]。

傳統(tǒng)的植物油中酚類(lèi)化合物的提取方法主要為液液萃取(LLE)[6]和固相萃取(SPE)。Yang等[7]采用LLE對(duì)經(jīng)微波預(yù)處理的油菜籽制備的菜籽油中的酚類(lèi)化合物進(jìn)行提取，采用80%的甲醇作為提取溶劑，反復(fù)提取3次，并結(jié)合超高效液相色譜(UPLC)考察了不同微波預(yù)處理時(shí)間對(duì)菜籽油中酚類(lèi)化合物的影響。但LLE需要?jiǎng)×艺袷?，常?huì)出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，同時(shí)通常需要重復(fù)提取以盡可能提取目標(biāo)物，消耗大量有機(jī)溶劑，造成環(huán)境污染。SPE利用選擇性吸附與選擇性洗脫的液相色譜法分離原理，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的分離純化[8]。Rekas等[9]使用SPE提取菜籽油中的酚類(lèi)化合物，將菜籽油樣品通過(guò)二醇基(Diol)萃取柱，然后分別使用正己烷和正己烷- 乙酸乙酯(體積比90∶10)進(jìn)行淋洗，最后用甲醇進(jìn)行洗脫，研究微波預(yù)處理油菜籽制備的菜籽油在儲(chǔ)存過(guò)程中其所含酚類(lèi)化合物的變化規(guī)律。雖然相比于LLE，SPE更具有選擇性，且可同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的富集與純化，但是SPE小柱價(jià)格昂貴，成本較高。

QuEChERS前處理方法是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種快速樣品前處理技術(shù)，通常包括萃取和凈化兩部分。萃取一般采用溶劑萃取的方法，乙腈是最常用的有機(jī)溶劑。凈化采用分散固相萃取的方法，即向上述所得含目標(biāo)物的萃取液中加入特定的吸附劑除去雜質(zhì)，以降低后續(xù)分析時(shí)雜質(zhì)對(duì)目標(biāo)物的干擾[10]。QuEChERS前處理方法最初被應(yīng)用于高水分含量的水果和蔬菜中農(nóng)藥殘留的分析，因其具有簡(jiǎn)便、高效、有機(jī)溶劑消耗少、基質(zhì)共提物含量低等優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用范圍日益廣泛，被逐漸用于獸藥、真菌毒素、多環(huán)芳烴、色素等多種化合物分析[11-12]。本文采用LLE、SPE、QuEChERS 3種不同前處理方法提取菜籽油中的酚類(lèi)化合物，并采用LC-MS/MS技術(shù)分析比較了3種不同前處理方法對(duì)菜籽油酚類(lèi)化合物提取效果的影響。其中，利用QuEChERS前處理方法提取菜籽油中的酚類(lèi)化合物尚屬?lài)?guó)內(nèi)外首次。本研究可為菜籽油中酚類(lèi)化合物的組成和含量分析提供技術(shù)支撐，從而為菜籽油氧化穩(wěn)定性與營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

甘藍(lán)型油菜籽，購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所。無(wú)水硫酸鎂、氯化鈉、乙酸、正己烷、乙酸乙酯，均為分析純；甲醇、乙腈為色譜純，德國(guó)Merck公司；芥子堿標(biāo)準(zhǔn)品，大連美侖生物技術(shù)有限公司；咖啡酸、丁香酸、阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品，國(guó)藥化學(xué)試劑集團(tuán)；對(duì)香豆酸標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Fisher公司；芥子酸、白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物技術(shù)有限公司；Canolol標(biāo)準(zhǔn)品，烏克蘭Enamine公司；十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18，50 μm)，天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Waters ACQUITY高效液相色譜儀、Waters Xevo三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)Waters公司；5804R型高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；Sorvall LYNX 4000高速落地離心機(jī)，美國(guó)Thermo公司；紅外干燥箱；二醇基固相萃取(Diol-SPE)小柱(200 mg，3 mL)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菜籽油的制備

取適量油菜籽平整鋪于托盤(pán)(料層厚度約5 mm)，將其置于紅外干燥箱中同一位置，在120℃條件下加熱30 min后取出，冷卻至室溫。取預(yù)處理后的油菜籽1.2 kg，置于液壓榨油機(jī)中進(jìn)行壓榨，壓榨時(shí)間30 min，壓榨溫度25℃，榨機(jī)壓力60 MPa。收集油樣，在5 000 r/min條件下離心10 min，去除雜質(zhì)得菜籽油樣品，置于4℃冰箱冷藏備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

準(zhǔn)確稱(chēng)取7種酚類(lèi)化合物標(biāo)準(zhǔn)品各25.0 mg，分別溶解于25 mL甲醇，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，并用錫紙包裹置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。取一定體積的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇逐級(jí)稀釋?zhuān)渲撇煌|(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。以目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，目標(biāo)化合物與內(nèi)標(biāo)物(白藜蘆醇)的峰面積比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2.3 樣品前處理

LLE：準(zhǔn)確稱(chēng)取2.50 g菜籽油樣品溶于3 mL正己烷中，分別用甲醇溶液提取3次，每次振搖一段時(shí)間，樣品在4 000 r/min條件下離心5 min，合并3次甲醇提取液。將提取液用氮吹儀吹干，加入2.5 mL甲醇回溶，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后置于樣品瓶中用于LC-MS/MS分析。

SPE：將Diol-SPE小柱置于固相萃取裝置中，分別用5 mL甲醇和5 mL正己烷活化。準(zhǔn)確稱(chēng)取1.50 g菜籽油樣品溶于5 mL正己烷，振搖1 min后裝柱，然后分別用5 mL正己烷和5 mL正己烷-乙酸乙酯(體積比90∶10)洗柱，最后洗脫，收集洗脫液，用氮吹儀吹干，加入1.5 mL甲醇回溶，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后置于樣品瓶中用于LC-MS/MS分析。

QuEChERS：參考Song等[13]的方法。準(zhǔn)確稱(chēng)取6.00 g菜籽油樣品加入到50 mL離心管中，分別加入3 mL水和18 mL乙腈，振搖5 min。隨后，加入7.20 g無(wú)水硫酸鎂和1.80 g氯化鈉，振搖2 min。樣品在4 000 r/min條件下離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至玻璃試管中，置于-20℃冰箱中冷凍2 h后取出。移取9 mL上清液于另一15 mL離心管中，加入270 mg C18和1.80 g無(wú)水硫酸鎂，振搖2 min后在4 000 r/min條件下離心5 min。移取4.5 mL上清液用氮吹儀吹干，加入1.5 mL甲醇回溶，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后置于樣品瓶中用于LC-MS/MS分析。

1.2.4 基質(zhì)共提物含量測(cè)定

將3種不同前處理方法所得的提取液轉(zhuǎn)移至已知質(zhì)量(m0)的離心管中，用氮吹儀吹干，測(cè)定總質(zhì)量(m1)，按下式計(jì)算基質(zhì)共提物含量。

基質(zhì)共提物含量=(m1-m0)/樣品質(zhì)量

1.2.5 LC-MS/MS分析

色譜條件：Hypersil GOLD C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm，美國(guó)Thermo公司)；流動(dòng)相A為水，流動(dòng)相B為乙腈，二者均添加0.1%乙酸；梯度洗脫條件為0～0.5 min 10% B，0.5～15 min 10%～55% B，15～15.5 min，55%～100% B，15.5～17 min 100% B，17～17.5 min 100%～10% B，17.5～20 min 10% B；進(jìn)樣量2 μL；流速0.3 mL/min；柱溫35℃。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)，其中芥子堿和Canolol為正離子掃描模式，其他酚類(lèi)化合物為負(fù)離子掃描模式；毛細(xì)管電壓3 kV，離子源溫度110℃，脫溶劑溫度400℃，脫溶劑氣和錐孔氣均為N2，脫溶劑氣流速600 L/h，錐孔氣流速50 L/h。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

使用MassLynx軟件(版本4.1)對(duì)LC-MS/MS數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用Origin 8.5作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

按照1.2.5所述LC-MS/MS方法對(duì)不同質(zhì)量濃度的酚類(lèi)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)質(zhì)量濃度平行測(cè)定3次，酚類(lèi)化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程、R2和線(xiàn)性范圍見(jiàn)表1。

表1 酚類(lèi)化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程、R2和線(xiàn)性范圍

2.2 LLE條件的優(yōu)化

為了得到較好的提取效果，采用加標(biāo)量為10 μg/g的菜籽油樣品對(duì)實(shí)驗(yàn)中的幾個(gè)重要實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。每種處理均測(cè)定3個(gè)平行樣品，結(jié)果以“平均回收率±相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。

2.2.1 提取溶劑的體積分?jǐn)?shù)

酚類(lèi)化合物大多具有較強(qiáng)的極性，且具有一定的水溶性，因此一般采用有機(jī)溶劑與水的混合溶劑對(duì)其進(jìn)行提取，而甲醇為最常用的酚類(lèi)化合物提取的有機(jī)溶劑，因此本研究分別選取體積分?jǐn)?shù)為60%、70%、80%、90%、100%的甲醇作為提取溶劑進(jìn)行比較研究，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)回收率的影響

由圖1可知：當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)在60%～80%時(shí)，隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增加，酚類(lèi)化合物回收率明顯增加；當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)大于80%時(shí)，酚類(lèi)化合物回收率逐漸下降。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇作為提取溶劑。

2.2.2 提取溶劑的用量

分別選擇每次用2、3、4、5 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇溶液提取菜籽油中的酚類(lèi)化合物，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 提取溶劑用量對(duì)回收率的影響

由圖2可知：當(dāng)提取溶劑用量為2 mL時(shí)，酚類(lèi)化合物的回收率較低，說(shuō)明2 mL溶劑不足以使酚類(lèi)化合物提取完全；提取溶劑用量增加至3 mL時(shí)，酚類(lèi)化合物的回收率迅速增加；繼續(xù)增加提取溶劑用量，回收率基本保持不變。說(shuō)明3 mL溶劑足以將菜籽油中的酚類(lèi)化合物提取完全，繼續(xù)增加溶劑用量反而會(huì)造成溶劑的浪費(fèi)。因此，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中每次提取溶劑用量均設(shè)定為3 mL。

2.2.3 振搖時(shí)間

考察了振搖時(shí)間對(duì)菜籽油中酚類(lèi)化合物提取效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 振搖時(shí)間對(duì)回收率的影響

由圖3可知：當(dāng)振搖時(shí)間在3～5 min時(shí)，隨著振搖時(shí)間的延長(zhǎng)，酚類(lèi)化合物回收率迅速上升；當(dāng)振搖時(shí)間超過(guò)5 min時(shí)，回收率無(wú)明顯變化。為了節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高操作效率，綜合考慮，選擇振搖時(shí)間為5 min。

2.3 SPE條件優(yōu)化

采用加標(biāo)量為10 μg/g的菜籽油樣品對(duì)實(shí)驗(yàn)中的幾個(gè)重要實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。每種處理均測(cè)定3個(gè)平行樣品，結(jié)果以“平均回收率±相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。

2.3.1 洗脫劑的種類(lèi)

酚類(lèi)化合物一般為極性化合物，因此本研究分析比較了極性較強(qiáng)的乙腈和甲醇作為洗脫劑對(duì)目標(biāo)物的洗脫效果，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 洗脫劑種類(lèi)對(duì)回收率的影響

由圖4可知，對(duì)于咖啡酸、芥子堿和Canolol，甲醇的洗脫效果優(yōu)于乙腈，對(duì)于其他酚類(lèi)化合物，兩種溶劑洗脫能力相差不大。綜合考慮，選擇甲醇作為洗脫劑。

2.3.2 洗脫劑用量

本研究分別選擇3、4、5、6、7 mL的甲醇對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行洗脫，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 洗脫劑用量對(duì)回收率的影響

由圖5可知，當(dāng)洗脫劑用量從3 mL增加至5 mL時(shí)，酚類(lèi)化合物的回收率逐漸增加，當(dāng)洗脫劑用量超過(guò)5 mL時(shí)，回收率并沒(méi)有明顯增加，說(shuō)明繼續(xù)增加洗脫劑用量并不會(huì)提高酚類(lèi)化合物的回收率，反而會(huì)增大有機(jī)溶劑的排放量。因此，本研究選擇洗脫劑用量為5 mL。

2.4 3種不同前處理方法的比較

2.4.1 回收率

向空白菜籽油樣品中加入7種酚類(lèi)化合物標(biāo)準(zhǔn)品，加標(biāo)量為10 μg/g，分別用1.2.3中所述3種不同前處理方法處理空白樣品和加標(biāo)樣品，按照1.2.5中所述LC-MS/MS方法對(duì)樣品進(jìn)行分析。每種處理均測(cè)定3個(gè)平行樣品，結(jié)果以“平均回收率±相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同前處理方法對(duì)菜籽油中酚類(lèi)化合物的回收率 %

由表2可見(jiàn)，QuEChERS方法對(duì)7種酚類(lèi)化合物的回收率為85.16%～101.78%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.21%～6.04%，明顯優(yōu)于LLE和SPE。SPE的回收率為56.98%～83.79%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.81%～9.23%，對(duì)于咖啡酸的回收率僅為56.98%，低于QuEChERS和LLE，提取效果最不理想。這可能是SPE需要采用合適的溶劑對(duì)樣品進(jìn)行淋洗，在洗去雜質(zhì)的同時(shí)也洗去了部分酚類(lèi)化合物；另一方面，在用甲醇洗脫目標(biāo)物的過(guò)程中，由于流速較快，酚類(lèi)化合物與甲醇作用時(shí)間較短，因而沒(méi)有被完全收集，使得回收率較低。而LLE和QuEChERS由于提取溶劑可以與目標(biāo)物充分接觸，因而回收率較高。

2.4.2 基質(zhì)共提物含量

植物油是一種復(fù)雜的基質(zhì)，在對(duì)酚類(lèi)化合物進(jìn)行提取的過(guò)程中會(huì)同時(shí)伴隨著脂肪等基質(zhì)共提物，從而對(duì)后續(xù)目標(biāo)物的分析產(chǎn)生干擾，同時(shí)也會(huì)對(duì)色譜柱造成污染，縮短色譜柱的使用壽命。本研究比較了LLE、SPE和QuEChERS 3種不同前處理方法對(duì)菜籽油酚類(lèi)化合物進(jìn)行提取時(shí)基質(zhì)共提物的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同前處理方法對(duì)基質(zhì)共提物含量的影響mg/g

由表3可知，QuEChERS方法的基質(zhì)共提物含量最低，為2.04 mg/g，LLE的基質(zhì)共提物含量最高，為6.80 mg/g。這可能是因?yàn)镼uEChERS方法在傳統(tǒng)LLE的基礎(chǔ)上，通過(guò)低溫冷凍使脂肪等雜質(zhì)凝固析出[14]，同時(shí)C18吸附劑除去了脂肪等非極性干擾物[15]，大大降低了基質(zhì)共提物的含量。

3 結(jié) 論

通過(guò)LC-MS/MS分析比較了LLE、SPE、QuEChERS 3種不同前處理方法對(duì)菜籽油中酚類(lèi)化合物的提取效果。結(jié)果表明：相比于LLE和SPE，QuEChERS前處理方法的提取效果最好，對(duì)菜籽油中7種酚類(lèi)化合物的回收率可達(dá)85.16%～101.78%，基質(zhì)共提物含量最低，為2.04 mg/g；LLE的回收率為66.04%～101.11%，基質(zhì)共提物含量最高，為6.80 mg/g；SPE的回收率最低，僅為56.98%～83.79%，基質(zhì)共提物含量為2.30 mg/g。本研究證明QuEChERS方法是一種操作簡(jiǎn)便、安全可靠、準(zhǔn)確度高的樣品前處理技術(shù)，適合于菜籽油中酚類(lèi)化合物的提取。