α-亞麻酸通過提高GSH 水平、降低ROS 水平促進(jìn)綿羊卵母細(xì)胞抗氧化與氧化平衡能力

張 博，宋玉坤，努日比婭姆?麥麥提托合提，阿爾曼?海熱，趙 茜，阿布力孜?吾斯曼

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）

卵母細(xì)胞體外成熟（IVM）培養(yǎng)時(shí)要完成胞質(zhì)成熟，體外受精（IVF）才能成功，早期胚胎才能正常發(fā)育。IVM 過程中卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)部會經(jīng)歷一系列生理生化過程，通常采用如三磷酸腺苷（ATP）、谷胱甘肽（GSH）、活性氧（ROS）、Ca2+等生化指標(biāo)對卵母細(xì)胞發(fā)育能力進(jìn)行準(zhǔn)確、客觀的評價(jià)。在胚胎體外生產(chǎn)（IVP）過程中，特別在20% O2下，會產(chǎn)生許多對卵母細(xì)胞成熟[1]和胚胎發(fā)育有害的ROS[2]。高水平ROS 會誘導(dǎo)氧化應(yīng)激導(dǎo)致卵母細(xì)胞線粒體內(nèi)膜電位的降低、紡錘體的破壞和細(xì)胞質(zhì)ATP 水平的降低[3]。胚胎細(xì)胞中ROS水平的增加可導(dǎo)致胚胎發(fā)育缺陷和胚胎停滯[4]。GSH 是哺乳動(dòng)物體內(nèi)一種重要的非蛋白巰基三肽，為了防止過多ROS 引起氧化損傷，許多哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞成熟過程中會合成GSH。GSH 含量會隨著成熟時(shí)間而逐漸積累，到第2 次減數(shù)分裂中期（M Ⅱ期）時(shí)GSH 含量最高[5-6]。此時(shí)高水平的GSH 代表高質(zhì)量的胞質(zhì)成熟，因?yàn)楦咚降腉SH 可以使卵母細(xì)胞免受ROS 的氧化損傷[7]、促進(jìn)雄原核形成[5]、促進(jìn)胚胎發(fā)育[8]。綜上，卵母細(xì)胞內(nèi)GSH、ROS 的水平反映細(xì)胞質(zhì)成熟的程度，可作為胞質(zhì)質(zhì)量特征性指標(biāo)。ALA 常溫下性狀為淡黃色油狀液體，高度不飽和，它存在于種子油、豆類、核桃和葉類蔬菜中。ALA 是哺乳動(dòng)物2 種必需脂肪酸之一，也是生物體組織生物膜的結(jié)構(gòu)材料。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究綿羊卵母細(xì)胞IVM 培養(yǎng)基中添加100 μmol/L ALA[9]對成熟后胞質(zhì)GSH、ROS 水平的影響，探究ALA 對改善卵母細(xì)胞胞質(zhì)質(zhì)量的作用效果。

1 材料與方法

1.1 材料藥品 促卵泡素（FSH）、促黃體素（LH）、表皮生長因子（EGF）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、肝素鈉、透明質(zhì)酸酶、無脂肪酸牛血清白蛋白（FA-BSA）購自Solarbio 公司，其余藥品均購自美國Sigma 公司。綿羊卵巢采自烏魯木齊草綠天藍(lán)畜牧公司華凌屠宰場。

1.2 試劑配制 卵巢保存液：0.9%生理鹽水+8 mmol/L葡萄糖+0.2 g/L MgCl2+0.2 g/L CaCl2+100 mg/L 青霉素+100 mg/L 鏈霉素。

采卵液：9.5 g/L TCM199 +5 mmol/L NaHCO3+10 mmol/L HEPES+10 mmol/L HEPES-Na+2 500 U/L 肝素鈉+4 g/L BSA +0.01 g/L 酚紅+100 mg/L 青霉素+100 mg/L 鏈霉素。

卵母細(xì)胞基礎(chǔ)成熟液：9.5 g/L TCM199+6 g/L BSA+25 mmol/L NaHCO3+500 U/L FSH+500 U/L LH+1 mg/L E2+25 μg/L EGF+5 μg/L VEGF+1.5 mmol/L 葡萄糖+5.5 mmol/L 乳酸鈉+2 mmol/L 丙酮酸鈉+1 mmol/L 谷氨酰胺+0.1 mmol/L 半胱氨酸+100 mg/L 青霉素+100 mg/L鏈霉素。

100 μmol/L ALA 卵母細(xì)胞成熟液：卵母細(xì)胞基礎(chǔ)成熟液中添加100 μmol/L ALA。

0.1%透明質(zhì)酸酶：1 g/L 透明質(zhì)酸酶＋9.5 g/L TCM 199+2.1 g/L NaHCO3。

DPBS：8 g/L NaCl +0.2 g/L KCl+0.05 g/L KH2PO4+2.17 g/L Na2HPO4?7H2O+0.13 g/L CaCl2?2H2O+0.1 g/L MgCl2?6H2O。

Tyrodes medium（TLH）：8 g/L NaCl+0.2 g/L KCl+0.2 g/L CaCl2?2H2O +0.1 g/L MgCl2?6H2O+0.05 g/L NaH2PO4+1 g/L NaHCO3+1 g/L 葡糖糖。

0.1%DPBS-PVA：1 g 聚乙烯醇（PVA）熱溶于1 L DPBS 中。

0.1%TLH-PVA：1 g PVA 熱溶于1 L TLH 中。

H2DCFDA 母液：4.87 mg H2DCFDA 溶于1 mL DMSO中，配成10 mmol/L 母液。

CMF2HC 母液：2.47 mg CMF2HC 溶于1 mL DMSO中，配成10 mmol/L 母液。

10 μmol/L H2DCFDA 工作液：1 μL H2DCFDA 母液溶于1 mL TLH-PVA 中，現(xiàn)配現(xiàn)用。

10 μmol/L CMF2HC 工作液：1 μL CMF2HC 母液溶于1 mL TLH-PVA 中，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 離體卵巢收集 綿羊被屠宰后30 min 內(nèi)將卵巢無菌采集，放置于20～25℃的卵巢保存液中，2～4 h 內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。為防止卵巢被污染，浸泡卵巢的生理鹽水中應(yīng)加入青霉素、鏈霉素。

1.3.2 卵母細(xì)胞采集 采用抽吸法進(jìn)行卵母細(xì)胞收集。用帶有21 G 針頭的10 mL 注射器在卵巢上抽吸2～6 mm卵泡并在抽吸前吸取2 mL 采卵液，從而將卵母細(xì)胞吸出流入采卵液。

1.3.3 卵母細(xì)胞選擇 將采卵液注入培養(yǎng)皿，在體視顯微鏡下檢出帶有卵丘細(xì)胞的卵子，通常選擇A、B 級卵母細(xì)胞進(jìn)行成熟培養(yǎng)。A 級卵母細(xì)胞要求有3 層以上卵丘細(xì)胞緊密包圍，而且A 級的卵丘細(xì)胞擴(kuò)張充分；B 級要求卵母細(xì)胞質(zhì)均勻，卵丘細(xì)胞低于3 層或部分包圍卵母細(xì)胞。

1.3.4 卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng) 培養(yǎng)溫度為38.5℃時(shí)卵母細(xì)胞的成熟率最高，體外培養(yǎng)時(shí)間以24 h 為宜。二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)卵母細(xì)胞，氣相環(huán)境：5%CO2、95%空氣、100%濕度。

1.3.5 測定細(xì)胞內(nèi)GSH 和ROS 水平 卵母細(xì)胞裸露處理：每個(gè)處理組含8～15 個(gè)COCs 用0.1% 透酶處理去除卵丘細(xì)胞，0.1%DPBS-PVA 洗滌3 次。通過H2DCFDA/CMF2HC 熒光染料測定細(xì)胞內(nèi)ROS/GSH 水平。將裸露的卵母細(xì)胞在含有10 μmol/L H2DCFDA/CMF2HC 的TLH-PVA 中（37℃、5%CO2、95%空氣、100% 濕度二氧化碳培養(yǎng)箱）孵育30min。0.1%DPBSPVA 洗滌3 次，置于10 μL DPBS 液滴中，在裝有藍(lán)光/紫外線濾光片的熒光倒置顯微鏡上觀察熒光。記錄綠色/藍(lán)色熒光圖像作為TIFF 格式文件，通過Image J 軟件分析卵母細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 添加100 μmol/L ALA 對IVM 綿羊卵母細(xì)胞胞質(zhì)ROS 水平的影響 使用含ALA（0、100 μmol/L）的IVM 培養(yǎng)基孵育綿羊卵母細(xì)胞24 h，透酶去除顆粒細(xì)胞后，H2DCFDA 進(jìn)行胞質(zhì)ROS 染色，Image J 軟件統(tǒng)計(jì)分析并歸一化至對照組卵母細(xì)胞。將COCs 隨機(jī)分配到每個(gè)組中，實(shí)驗(yàn)4 次重復(fù)。

1.4.2 添加100 μmol/L ALA 對IVM 綿羊卵母細(xì)胞胞質(zhì)GSH 水平的影響 使用含ALA（0、100 μmol/L）的IVM 培養(yǎng)基孵育綿羊卵母細(xì)胞24 h，透酶去除顆粒細(xì)胞后，CMF2HC 進(jìn)行胞質(zhì)GSH 染色，Image J 軟件統(tǒng)計(jì)分析并歸一化至對照組卵母細(xì)胞。將COCs 隨機(jī)分配到每個(gè)組中，實(shí)驗(yàn)4 次重復(fù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 使用SPSS21.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，多組比較滿足正態(tài)性和方差齊性的采用單因素方差分析，以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示數(shù)據(jù)。顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，極顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.01。

2 結(jié)果

2.1 添加100 μmol/L ALA 對IVM 綿羊卵母細(xì)胞胞質(zhì)GSH 水平影響 如表1 和圖1 所示，相較0 μmol/L 組，添加100 μmol/L ALA 可顯著提高綿羊卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)GSH 水平，即可以顯著增強(qiáng)IVM 綿羊卵母細(xì)胞的抗氧化能力。

表1 100 μmol/L ALA 對IVM 后綿羊卵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi)GSH 的影響（n=4）

2.2 添加100 μmol/L ALA 對IVM 綿羊卵母細(xì)胞胞質(zhì)ROS 水平的影響 如表2 和圖2 所示，相較0 μmol/L 組，添加100 μmol/L ALA 可極顯著降低綿羊卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)ROS 水平，即可以顯著改善IVM 綿羊卵母細(xì)胞氧化還原狀態(tài)。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，添加100 μmol/L ALA 可顯著提高綿羊卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)GSH 水平，這與Lee 等[10]研究添加100 μmol/L ALA 顯著增加豬卵母細(xì)胞內(nèi)GSH水平的結(jié)果一致。但Veshkini 等[11]研究顯示，添加50 μmol/L ALA 對山羊卵母細(xì)胞內(nèi)GSH 水平無顯著影響，可能在于山羊卵泡液的ALA 生理濃度范圍為64.6～100.6 μmol/L[11]，而實(shí)驗(yàn)中ALA 添加水平偏低。添加ALA 提高IVM 后卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)GSH 水平的可能作用途徑尚未見報(bào)道。本研究推測可能是添加ALA促進(jìn)GSH 的合成和/ 或減緩GSH 的消耗提高了IVM后卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)GSH 水平。半胱氨酸作為GSH 合成的限速底物[12]，通過在含有100 μmol/L ALA 的成熟培養(yǎng)基中添加不同濃度的半胱氨酸或者胱氨酸來驗(yàn)證ALA 是否通過半胱氨酸途徑促進(jìn)GSH 合成；γ谷氨酰半胱氨酸合成酶是GSH 合成的限速酶，通過在含有100 μmol/L ALA 的成熟培養(yǎng)基中添加或者不添加丁硫氨酸磺酰亞胺（γ谷氨酰半胱氨酸合成酶的特異性抑制劑）來驗(yàn)證ALA 是否通過限速酶途徑促進(jìn)GSH 合成。卵母細(xì)胞IVM 22 h 時(shí)在含有100 μmol/L ALA 的成熟培養(yǎng)基中添加或者不添加H2O2并接著培養(yǎng)2 h，通過測定24 h 時(shí)GSH 水平推測ALA 是否通過減緩GSH 的消耗從而提高IVM 后卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)GSH 水平[13]。

表2 100 μmol/L ALA 對IVM 后綿羊卵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi)ROS 的影響（n=4）

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，添加100 μmol/L ALA 可極顯著降低綿羊卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)ROS 水平，與添加50 μmol/L ALA 顯著降低牛[14]、水牛[15]卵母細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的結(jié)論一致。Wfa 等[15]在水牛卵母細(xì)胞IVM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中也添加了100 μmol/L 半胱胺，半胱胺作為GSH合成底物促進(jìn)ROS 水平降低，這可能是造成ALA 降低ROS 水平不顯著的原因。Cetica 等[16]認(rèn)為在牛卵母細(xì)胞中酶促抗氧化系統(tǒng)在IVM 期間調(diào)節(jié)ROS 水平，SOD、GSH-Px 和CAT 活性的上升能夠控制ROS 的積累。Corrêa 等[17]研究表明，牛胚胎中SOD、GSH-Px和CAT 基因表達(dá)的上升能夠改善高氧環(huán)境造成的胚胎質(zhì)量不佳。為了確認(rèn)ALA 降低IVM 24 h 后卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)ROS 水平是否通過抗氧化酶活性的增加和/ 或者抗氧化酶基因表達(dá)的上升，需要做進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)證明，綿羊卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基中添加100 μmol/L ALA 可以顯著改善IVM 后卵母細(xì)胞氧化平衡狀態(tài)、顯著增強(qiáng)卵母細(xì)胞抗氧化能力。