lncRNA 在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中作用的研究進(jìn)展

焦亞飛，劉樹林，葉 升，石德順，黃 奔

（廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530004）

在人的基因組文庫(kù)研究中，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)已經(jīng)揭示了人類基因組文庫(kù)，并且在其中發(fā)現(xiàn)了大量非編碼基因[1]。非編碼RNA 根據(jù)其長(zhǎng)度可以分為小RNA和lncRNA，它曾被認(rèn)為是基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程的“噪音”，是RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物。在lncRNA 的研究中發(fā)現(xiàn)，相比編碼蛋白的基因，lncRNA 更具有組織特異性，且lncRNA 在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后的修飾都發(fā)揮著重要的功能[2]。有關(guān)lncRNA 的研究已經(jīng)發(fā)表論文超過(guò)3 000 篇，涉及細(xì)胞分化、個(gè)體發(fā)育、人類疾?。ㄈ绨柶澓ＤY、癌癥等）研究領(lǐng)域[3-6]。

卵母細(xì)胞是生殖醫(yī)學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、物種保護(hù)等領(lǐng)域的重要研究對(duì)象，與雄性配子不同，卵母細(xì)胞可以在體外培養(yǎng)成熟[7]。卵母細(xì)胞體外成熟的質(zhì)量對(duì)卵母細(xì)胞的孤雌激活、體外受精、核移植、胞質(zhì)注射等胚胎發(fā)育具有重要影響。然而，體外成熟的卵母細(xì)胞與體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞相比，存在著核質(zhì)成熟不同步、囊胚率低、多精受精率高等問(wèn)題。探究卵母細(xì)胞體外成熟存在的問(wèn)題，需要了解卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制，尤其是通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)探究卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中RNA 表達(dá)情況，這一技術(shù)已經(jīng)在生物學(xué)研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，lncRNA 參與卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中的各個(gè)階段。本文綜述了動(dòng)物繁殖相關(guān)lncRNA 的研究進(jìn)展，以期通過(guò)lncRNA 的調(diào)控作用解釋卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中存在的問(wèn)題，為深入探究家畜繁殖機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 lncRNA 的作用機(jī)制及生物學(xué)功能

1.1 lncRNA 的作用機(jī)制 lncRNA 作為基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵因子，通過(guò)不同方式對(duì)基因進(jìn)行調(diào)節(jié)[8]，其作用機(jī)制主要有5 種形式：①lncRNA 可以作為信號(hào)分子與轉(zhuǎn)錄因子相緊密結(jié)合，或在特定時(shí)間和空間上通過(guò)信號(hào)通路調(diào)控基因表達(dá)；② lncRNA 可以作為誘導(dǎo)分子阻礙轉(zhuǎn)錄因子與其他蛋白類物質(zhì)、染色體相結(jié)合或是阻礙蛋白因子與細(xì)胞核相結(jié)合，如lncRNA 可以與miRNA 相結(jié)合；③lncRNA 作為引導(dǎo)分子引導(dǎo)染色質(zhì)修飾酶或目的基因，通過(guò)順式或反式結(jié)構(gòu)與遠(yuǎn)距離靶基因相結(jié)合；④lncRNA 可以作為支架分子使許多復(fù)雜的蛋白質(zhì)形成核糖體蛋白復(fù)合物，這種復(fù)合物可以在染色質(zhì)中影響組蛋白修飾；⑤ lncRNA 也可以作為增強(qiáng)子，起到啟動(dòng)子與增強(qiáng)子之間連接蛋白的作用。

1.2 lncRNA 的生物學(xué)功能 根據(jù)lncRNA 的調(diào)控方式可以將其在生物學(xué)上的功能分為表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控3 種層面[9]：①表觀遺傳調(diào)控，lncRNA 可以通過(guò)募集染色質(zhì)重塑復(fù)合物結(jié)合至特定基因位點(diǎn)，在轉(zhuǎn)錄前發(fā)揮基因的調(diào)控作用；②轉(zhuǎn)錄中調(diào)控，lncRNA 可以對(duì)控制蛋白編碼基因的啟動(dòng)子進(jìn)行直接或間接的調(diào)控，這類lncRNA 可能會(huì)與基因轉(zhuǎn)錄蛋白相結(jié)合，從而影響轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程，lncRNA 也可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性，對(duì)靶基因的表達(dá)產(chǎn)生影響；③轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，lncRNA 可以通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則對(duì)蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基因進(jìn)行加工和修飾。此外，lncRNA 也可以像ceRNA（competing endogenous RNA）結(jié)合miRNA 的作用方式，對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程進(jìn)行調(diào)控[10]。

2 lncRNA 對(duì)動(dòng)物卵母細(xì)胞成熟的調(diào)控

卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量對(duì)受精和胚胎發(fā)育的潛力具有重要作用。目前體外成熟的卵母細(xì)胞質(zhì)量低于體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞，應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)體外成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)成熟過(guò)程中存在大量差異表達(dá)的lncRNA，表明lncRNA 與卵母細(xì)胞成熟具有潛在聯(lián)系[11]。lncRNA 廣泛參與卵母細(xì)胞成熟的生物學(xué)過(guò)程，在卵丘顆粒細(xì)胞擴(kuò)展、激素水平、卵母細(xì)胞核質(zhì)成熟方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

2.1 lncRNA 參與卵丘顆粒細(xì)胞擴(kuò)展的調(diào)控 卵丘細(xì)胞對(duì)卵母細(xì)胞的成熟起到至關(guān)重要的作用，卵丘細(xì)胞主要通過(guò)胞質(zhì)磷酸化、去磷酸化、氨基酸攝入以及相關(guān)第二信使IP3、cAMP 作用來(lái)調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞成熟，同時(shí)卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展也可以減少成熟分裂的抑制因子，從而解除其對(duì)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯的束縛[12]。

Bouckenheimer 等[13]利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)人卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞為卵母細(xì)胞運(yùn)輸大量的營(yíng)養(yǎng)和物質(zhì)，包括mRNA 和lncRNA，表明lncRNA 通過(guò)卵丘細(xì)胞對(duì)卵母細(xì)胞的成熟具有重要作用。研究表明，質(zhì)量差的人卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體中顯著下調(diào)的基因lncRNA-Y00062參與對(duì)靶基因NEK7 的調(diào)控[14]，而NEK7 是一個(gè)在紡錘體組裝和有絲分裂過(guò)程中發(fā)揮重要作用的基因，表明lncRNA-Y00062對(duì)卵母細(xì)胞成熟具有調(diào)控作用[15]。Warzych 等[16]研究也發(fā)現(xiàn)，lncRNAENST00000502390在質(zhì)量差的卵丘細(xì)胞復(fù)合體中表達(dá)量高，其與超長(zhǎng)鏈脂肪酸延伸酶5（Elongation of Very-Long-Chain Fatty Acids Protein5，ELOVL5）共同參與調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞成熟及排卵過(guò)程的發(fā)生。

通過(guò)多人多囊卵巢綜合征（Polycystic Ovary Syndrome，PCOS）的卵丘細(xì)胞復(fù)合體的研究揭示了lncRNA 對(duì)卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的調(diào)控關(guān)系。Xin 等[17]選取XLOC_011402、ENST00000454271、ENST00000433673、ENST00000450294、ENST000004324315 個(gè)差異lncRNA采用QRT-PCR 對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)許多差異表達(dá)的lncRNA 都是從2 號(hào)染色體轉(zhuǎn)錄而來(lái)，可能作為增強(qiáng)子調(diào)控其臨近的蛋白編碼基因。與正常女性相比，PCOS 患者的卵丘細(xì)胞中有623 個(gè)lncRNA 和260 個(gè)mRNA 顯著上調(diào)或下調(diào)，提示PCOS 患者和正常女性中l(wèi)ncRNA 的差異表達(dá)可能是PCOS 發(fā)生的原因之一，可能影響卵母細(xì)胞發(fā)育[17]。

Yerushalmi 等[18]在緊湊型和擴(kuò)張型卵丘細(xì)胞之間鑒定了1 746 個(gè)差異表達(dá)基因，這些基因大多參與細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)和相互作用及細(xì)胞外基質(zhì)和類固醇生成；在差異表達(dá)的基因中，發(fā)現(xiàn)89 個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA，其中12 個(gè)lncRNA 參與顆粒細(xì)胞發(fā)育過(guò)程的基因內(nèi)含子中，其中整合素α6 反義RNA（Integrin Alpha6 Antisense RNA，ITGA6-AS）的表達(dá)在MII 期卵母細(xì)胞-放射冠-卵丘復(fù)合體（Oocyte-Corona-Cumulus Complex，OCCC）的卵丘細(xì)胞中顯著上調(diào)，而其靶基因ITGA6則顯著下調(diào)。整合素α6β1 是顆粒細(xì)胞層黏連蛋白的受體，它們?cè)陬w粒細(xì)胞中的相互作用能夠增強(qiáng)細(xì)胞的存活和增殖能力并調(diào)節(jié)類固醇生成[19]。但I(xiàn)TGA6-AS是否直接調(diào)節(jié)ITGA6目標(biāo)基因的表達(dá)需要進(jìn)一步研究。Yerushalmi 等[18]實(shí)驗(yàn)表明，lncRNA 轉(zhuǎn)錄可能有助于調(diào)節(jié)卵丘的擴(kuò)張和卵母細(xì)胞的成熟。

2.2 lncRNA 參與激素水平的調(diào)控 激素對(duì)卵母細(xì)胞成熟、受精以及胚胎發(fā)育都起著重要的促進(jìn)作用。絕大多數(shù)卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)體系中都會(huì)添加各種激素。Singh等[20]研究發(fā)現(xiàn)，豬卵母細(xì)胞成熟體系中加入雌二醇（E2）和卵泡刺激素（FSH）可降低胚泡損傷率。

抗繆勒氏激素（AMH）對(duì)哺乳動(dòng)物雄性分化過(guò)程中繆勒氏管的退化起重要作用，主要作用于成年動(dòng)物卵巢顆粒細(xì)胞、睪丸支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞[21]。AMH 的特異性作用是通過(guò)其受體AMH II 型受體（Amhr2）發(fā)揮的，但Amhr2基因被特異性激活的機(jī)制尚不完全清楚。Kimura 等[22]在卵巢顆粒細(xì)胞和睪丸支持細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA-lncRNA-Amhr2，是從Amhr2基因上游轉(zhuǎn)錄而來(lái)的，在原代顆粒細(xì)胞中，lncRNAAmhr2的下調(diào)導(dǎo)致Amhr2messnger RNA 水平下降，瞬時(shí)報(bào)告基因檢測(cè)顯示，lncRNA-Amhr2激活增加了Amhr2啟動(dòng)子活性，該活性與lncRNA-Amhr2在小鼠顆粒細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的OV3121 細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄有關(guān)。此外，通過(guò)Tet-on 系統(tǒng)，lncRNA-Amhr2轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)顯著提高了OV3121 細(xì)胞中Amhr2啟動(dòng)子活性。這些結(jié)果表明，lncRNA-Amhr2通過(guò)增強(qiáng)啟動(dòng)子活性，在卵巢顆粒細(xì)胞的Amhr2基因激活中發(fā)揮作用。脯氨酰寡肽酶（Prolyl Oligopeptidase，POP）是一種能特異性水解多肽鏈中脯氨酸殘基羧基端肽鍵的絲氨酸蛋白酶，POP參與肽類激素和神經(jīng)肽的成熟與降解[23]。Matsubara等[24]比較了小鼠POP 的基因組序列，在相鄰的基因間發(fā)現(xiàn)6 個(gè)保守的非編碼序列（Conserved Non-Coding Sequences，CNSs），從這些CNSs 中轉(zhuǎn)錄出4 個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA，其中LncPrep+96kb 的表達(dá)模式與POP的表達(dá)模式相關(guān)。lncPrep+96kb 由于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的不同而被轉(zhuǎn)錄為2 種形式，定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，但細(xì)胞核中存在較多的lncPrep+96kb。當(dāng)將lncPrep+96kb敲入小鼠卵巢原發(fā)性顆粒細(xì)胞和肝細(xì)胞時(shí)，2 個(gè)細(xì)胞的POP 表達(dá)均下降，相反，lncPrep+96kb 的過(guò)表達(dá)僅在顆粒細(xì)胞中增加了POP 的表達(dá)，由于lncPrep+96kb在激素處理的卵巢中上調(diào)的時(shí)間與POP 相同，表明lncRNA 可能在顆粒細(xì)胞的POP 基因激活中發(fā)揮作用，通過(guò)一些激素的合成從而影響了卵母細(xì)胞的成熟[24]。

Liu 等[25]通過(guò)PCOS 患者和健康女性的GCs 的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)lincRNA HCG26在POCS 患者的卵巢顆粒細(xì)胞中呈高表達(dá)，其表達(dá)水平與卵巢竇卵泡數(shù)相關(guān)，通過(guò)在人卵巢顆粒細(xì)胞系KCN 中下調(diào)HCG26的表達(dá)抑制了細(xì)胞增殖，增加芳香化酶基因表達(dá)和E2的產(chǎn)生，提示lincRNA HCG26可能在調(diào)控PCOS 顆粒細(xì)胞增殖和卵泡生長(zhǎng)具有重要作用。

2.3 lncRNA 參與卵母細(xì)胞核質(zhì)成熟的調(diào)控 在整個(gè)卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中，涉及的過(guò)程主要可以分為細(xì)胞質(zhì)成熟和細(xì)胞核成熟。細(xì)胞質(zhì)成熟主要包括細(xì)胞器的形態(tài)、卵母細(xì)胞骨架以及成熟過(guò)程中需要的RNA 轉(zhuǎn)錄和蛋白合成；核成熟主要包括生發(fā)泡破裂、染色體復(fù)制、同源染色體分離等過(guò)程[26]。

Karlic 等[27]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA 在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中同樣發(fā)揮巨大作用，卵母細(xì)胞內(nèi)含有休眠狀態(tài)的lncRNA，當(dāng)mRNA 在卵母細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄功能、調(diào)控細(xì)胞質(zhì)聚腺苷酸化時(shí)，可以激活卵母細(xì)胞內(nèi)的lncRNA，lncRNA 在促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)聚腺苷酸化的過(guò)程中表現(xiàn)為與mRNA 協(xié)同狀態(tài)，因此lncRNA 可能在調(diào)控卵母細(xì)胞成熟尤其是胞質(zhì)成熟方面發(fā)揮重要作用。Bouckenheimer 等[28]分析了公開(kāi)可用的RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)，以識(shí)別在減數(shù)分裂中期（MII）卵母細(xì)胞（BCAR4、C3orf56、TUNAR、ooeg-as1、CASC18和LINC01118）和卵丘細(xì)胞（NEAT1、MALAT1、ANXA2P2、MEG3、IL6STP1和VIM-AS1）中大量存在的lncRNA，這些數(shù)據(jù)通過(guò)使用獨(dú)立卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞的QRT-PCR 分析得到驗(yàn)證。通過(guò)構(gòu)建lncRNA-mRNA 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)所鑒定的lncRNA 的功能。這一分析表明MII 期卵母細(xì)胞lncRNA 可能參與染色質(zhì)重構(gòu)和驅(qū)動(dòng)胚胎早期發(fā)育。

果蠅Oskar（Osk）mRNA 具有不同尋常的編碼和非編碼功能。Osk是一種信使RNA，它編碼1 種蛋白，這種蛋白特別表達(dá)于卵母細(xì)胞的后部。這種空間受限的部署依賴于mRNA 的定位程序以及翻譯的抑制和激活，所有這些都依賴于主要位于mRNA 的3' untranslation region（UTR）的調(diào)控元件[29]。3' UTR 還介導(dǎo)了Osk的非編碼功能，招募各種調(diào)控因子影響卵子形成后期極性的建立，這對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)生的進(jìn)展至關(guān)重要[30]。在哺乳動(dòng)物中還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)類似果蠅Osk的lncRNA，因此在哺乳動(dòng)物中可能存在類似的lncRNA 在卵子發(fā)生過(guò)程中起著重要的作用。

3 展 望

lncRNA 是調(diào)控生殖細(xì)胞命運(yùn)和功能的一類重要基因。目前與繁殖有關(guān)的lncRNA 的研究處于初始階段，lncRNA 的作用及機(jī)制不斷被發(fā)現(xiàn)。已有研究開(kāi)始逐步揭示lncRNA 在卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟、早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控作用，研究主要積集中于人和小鼠方面，與大動(dòng)物繁殖相關(guān)的lncRNA 的功能和機(jī)制還處于未知狀態(tài)，還需要不斷地深入研究和完善。通過(guò)模式動(dòng)物的lncRNA 相關(guān)研究，將為家畜繁殖的機(jī)制和優(yōu)化家畜繁殖力提供理論參考。