人附睪蛋白4通過上調(diào)MMP9及VEGF降低順鉑對卵巢癌細(xì)胞增殖和遷移的影響

汪義泳，陳友國，管玉宇，李亞梅，杜景云

(1.寶山區(qū)羅店醫(yī)院/復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院寶山分中心婦產(chǎn)科,上海 201908；2.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇蘇州 215002)

卵巢惡性腫瘤是三大女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一。因卵巢位于女性盆腔深處，早期病變通常難以察覺。70%患者初診時(shí)已是晚期，而晚期卵巢癌惡性腫瘤患者5年生存率僅為30%，遠(yuǎn)低于早期卵巢癌患者的5年生存率(80%)[1-2]。因此，有效的早期診斷，卵巢癌治療后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的有效監(jiān)控并進(jìn)行早期干預(yù)至關(guān)重要。

自2009年開始，財(cái)政部、水利部在繼續(xù)組織開展面上小型農(nóng)田水利建設(shè)的同時(shí)，決定啟動(dòng)小型農(nóng)田水利重點(diǎn)縣建設(shè)工作，年投入超過50億元。全國各地以小農(nóng)水重點(diǎn)縣建設(shè)為平臺，開展高標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)田水利工程建設(shè)。調(diào)研發(fā)現(xiàn)，由于地域差異，各地區(qū)高標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)田水利基本建設(shè)發(fā)展?fàn)顩r參差不齊，既有共性的問題，也有典型的值得相互借鑒的成功經(jīng)驗(yàn)。

已被食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)用于臨床的人附睪蛋白4(HE4)是一種新型的血清免疫標(biāo)志物，在卵巢癌早期診斷中越來越被重視。HE4屬于乳酸蛋白(WAP)結(jié)構(gòu)域家族蛋白，是一種小分子分泌性蛋白。在正常卵巢組織中極少表達(dá)，而在卵巢上皮癌細(xì)胞中，HE4呈現(xiàn)高表達(dá)[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，漿液性腺癌和子宮內(nèi)膜樣腺癌兩類常見的上皮性卵巢癌組織中HE4的陽性率高達(dá)90%～100%。HE4在漿液性上皮性卵巢癌組織中的陽性表達(dá)率在93%～100%，在子宮內(nèi)膜樣上皮性卵巢癌組織中陽性表達(dá)率約為80%～100%，在透明細(xì)胞癌組織中陽性表達(dá)率約50%～83%[4]。當(dāng)前，血清糖類抗原125(CA125)是臨床常用的卵巢癌檢測腫瘤標(biāo)記物。然而，由于較多良性病變中CA125也呈高表達(dá)，導(dǎo)致很多假陽性產(chǎn)生[5-6]。盡管眾多研究表明HE4相對CA125等指標(biāo)而言是一個(gè)更合適的卵巢上皮性癌腫瘤標(biāo)記物[7-8]，對于卵巢癌的診斷、監(jiān)測和預(yù)后均具有較高的臨床價(jià)值。但是目前尚無法明確卵巢癌發(fā)展中HE4的作用和機(jī)制。國內(nèi)關(guān)于HE4在卵巢癌中生物學(xué)行為的相關(guān)研究報(bào)道非常少見。HE4是一種與卵巢癌相關(guān)的差異表達(dá)基因，HE4具有蛋白酶抑制劑的活性。本研究在細(xì)胞株中表達(dá)HE4，旨在探討HE4基因?qū)β殉舶┘?xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移作用的影響及其意義。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株 實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞株為人上皮性卵巢癌(EOC)細(xì)胞系HO8910PM，購買自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所。培養(yǎng)液為RPMI-1640(Gibco，美國)，添加10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清(Gibco，美國)和雙抗(100 U/mL，青霉素和100 μg/mL鏈霉素)。置于37 ℃，5% CO2及加濕條件下的培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。

1.2實(shí)驗(yàn)材料 CCK-8試劑盒購于日本Dojindo公司。順鉑購買自Sigma公司，Matrigel基質(zhì)購買自美國BD公司?？菇饘倩|(zhì)蛋白酶9(MMP9)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、HE4抗體和β-actin抗體購買自Santa Cruz公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞接種6孔板，待細(xì)胞密度為70%～80%后，按lip2000質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作，轉(zhuǎn)染6 h后吸出含質(zhì)粒和脂質(zhì)體Lipofectamine 2000的培養(yǎng)液，更換新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h或48 h。蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，-80 ℃保存，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

在實(shí)際工程中考慮熱源方案時(shí)，運(yùn)行費(fèi)用是不可忽視的因素.基于青島市氣象條件及能源價(jià)格體系，提出耦合供熱系統(tǒng)運(yùn)行費(fèi)用平衡點(diǎn)的概念.

1.3.1實(shí)驗(yàn)分組 (1)對照組：未作處理的細(xì)胞。(2)HE4過表達(dá)組：HE4基因PcDNA3.1/HFA載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。(3)空載體組。

當(dāng)然，目前市面上在售的8K電視非常稀少，僅來自夏普、三星等，而且價(jià)格異常昂貴。以夏普的第二代曠視系列8K電視為例，60吋在日本市場的價(jià)格約合人民幣4.6萬元。

這種方法的優(yōu)點(diǎn)是，只根據(jù)一口井的資料就可以確定出平面上氣水內(nèi)外邊界線的作圖深度，不同人按照此方法計(jì)算會(huì)得到同樣的結(jié)果，比較客觀。誤差主要來自于兩方面的假設(shè)：一方面假設(shè)氣水過渡帶附近儲層厚度相等，另一方面假設(shè)圖3中AFE近似為直線。

1.3.3Western blot檢測 一抗及稀釋度分別為HE4抗體(1∶500)、抗α-tubulin抗體(1∶200)、MMP9抗體(1∶200)和VEGF抗體(1∶200)。

2.1HE4高表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株HO8910PM的構(gòu)建 HE4基因載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HO8910PM細(xì)胞后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h后，如圖1所示，對照組的HE4蛋白相對表達(dá)量為0.81±0.13，空載體組24 h HE4的相對表達(dá)量為0.97±0.15，過表達(dá)組24 h HE4的相對表達(dá)量為6.75±0.83和過表達(dá)組48 h HE4的相對表達(dá)量為9.41±0.96?？蛰d體24 h組HE4蛋白的相對表達(dá)量與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.360，P>0.05)，而HE4過表達(dá)組24 h(t=12.231，P<0.01)和HE4過表達(dá)組48 h(t=15.362，P<0.01)的HE4蛋白相對表達(dá)量明顯高于對照組，HE4蛋白相對表達(dá)量分別是對照組的8.32倍和11.59倍，說明HE4轉(zhuǎn)染已經(jīng)成功?？紤]到24 h和48 h的HE4相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞進(jìn)行。

第一，規(guī)范上機(jī)程序，明確上機(jī)任務(wù)。教師應(yīng)事先制定好完整的上機(jī)計(jì)劃及每次的訓(xùn)練項(xiàng)目，確保學(xué)生在上機(jī)練習(xí)時(shí)有的放矢。

2 結(jié) 果

1.3.4CCK-8細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) 按試劑盒說明書操作，細(xì)胞按照1 000/孔/100 μL的密度接種96孔板，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后作用24 h，在各組細(xì)胞按1∶10比例加入CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h。酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度值A(chǔ)450，按下列公式計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對照組-A空白組)× 100%。

他漲紅了臉，前傾的身體頓時(shí)僵在原地，動(dòng)彈不得，“不……不……不需要了，我先走了?！彼砹藥紫乱路?，狠狠掃了一眼蘑菇，悻悻而去。

注：與對照比較，**P<0.001。

圖1在HO8910PM細(xì)胞中通過Westernblot及RT-PCR驗(yàn)證HE4過表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建成功

2.3HE4過表達(dá)顯著減弱順鉑對細(xì)胞遷移的影響 與對照組[(3.16±0.68)%]比較，60 μmol/L順鉑可顯著抑制HO8910PM細(xì)胞遷移，空載體組+順鉑的抑制率為(52.34±12.65)%，較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.724，P<0.01)；HE4過表達(dá)組+順鉑遷移抑制率為(23.65±8.65)%，較空載體組+順鉑明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.243，P<0.05)。見圖3。

1.3.5Transwell遷移實(shí)驗(yàn) 在Transwell小室的上室中加入200 μL細(xì)胞懸液，Matrigel置于小室下層，濃度1∶50，置于常溫培養(yǎng)箱內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出細(xì)胞板。4%多聚甲醛固定后，結(jié)晶紫染色，晾干后于200倍視野下隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，計(jì)算穿出小室的細(xì)胞數(shù)。

表1 HE4過表達(dá)顯著降低順鉑對細(xì)胞增殖的影響

注：與空載體組24 h比較，**P<0.01。

圖2空載體組及過表達(dá)HE4組細(xì)胞在不同濃度順鉑處理下的細(xì)胞存活率

2.2HE4過表達(dá)顯著降低順鉑對細(xì)胞增殖的影響 從表1和圖2可知，低濃度順鉑(10 μmol/L)對HE4過表達(dá)組和空載體組細(xì)胞的增殖抑制作用不明顯，兩組間細(xì)胞存活率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。高濃度順鉑(30、60、100 μmol/L)處理后，細(xì)胞增殖出現(xiàn)明顯的抑制，HE4過表達(dá)組和空載體組比較細(xì)胞存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，HE4過表達(dá)使順鉑對細(xì)胞的增殖抑制作用明顯緩解。

注：A表示遷移出transwell小室后細(xì)胞結(jié)晶紫染色圖片；B表示細(xì)胞遷移抑制率統(tǒng)計(jì)圖；與對照組比較，**P<0.01;與空載體組比較，#P<0.05。

圖3HE4過表達(dá)對順鉑處理細(xì)胞遷移的影響

2.4HE4過表達(dá)后遷移相關(guān)蛋白表達(dá)改變 在HE4過表達(dá)組，MMP9及VEGF相對表達(dá)量比對照組顯著升高(P<0.05)，見圖4。由此可見，HE4通過促進(jìn)MMP9及VEGF表達(dá)起到削弱順鉑對細(xì)胞增殖和遷移的抑制影響。

注：與對照組比較，**P<0.01。

圖4HE4過表達(dá)對MMP9及VEGF蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

HE4基因首次在人的附睪遠(yuǎn)端上皮細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)。隨后，國內(nèi)外的研究表明，HE4與卵巢癌的早期診斷及預(yù)測復(fù)發(fā)方面具有重要的臨床價(jià)值[9-10]?；诖?，筆者提出血清中HE4檢測可以用于卵巢癌，尤其是上皮性卵巢癌早期診斷和復(fù)發(fā)的監(jiān)測。

關(guān)于血HE4在卵巢癌診斷中的應(yīng)用價(jià)值及組織學(xué)方面臨床研究較多。但對HE4基因表達(dá)與卵巢癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的相關(guān)性的研究較少見。國內(nèi)學(xué)者陳瑤等[11]和KONG等[12]采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法分別在 HO8910和SKOV3卵巢癌細(xì)胞系中過表達(dá)HE4蛋白，陳瑤等[11]的研究顯示HE4過表達(dá)對細(xì)胞增殖無明顯影響，而KONG等[12]研究發(fā)現(xiàn)HE4過表達(dá)顯著抑制SKOV3細(xì)胞增殖，結(jié)論不一致。研究還發(fā)現(xiàn)HE4通過抑制PI3K/AKT和ERK1/2/MAPK細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，參與抑制細(xì)胞增殖，此外，JNK/SAPK和p38/MAPK信號通路也可能參與這一過程。LU等[13]通過沉默SKOV3細(xì)胞HE4表達(dá)和過表達(dá)HE4，研究了HE4對卵巢癌細(xì)胞增殖及黏附能力的影響，結(jié)果表明HE4能夠影響ERK1/2的磷酸化水平。以上研究均證明，HE4表達(dá)與卵巢癌細(xì)胞增殖有直接關(guān)系。

研究顯示，低濃度順鉑對HE4過表達(dá)組細(xì)胞增殖抑制不明顯，而相比于對照組，高濃度順鉑對細(xì)胞增殖產(chǎn)生明顯的抑制，而HE4過表達(dá)HO8910PM細(xì)胞的增殖抑制作用明顯的緩解。這表明HE4可明顯降低順鉑對細(xì)胞的抑制，促進(jìn)HO8910細(xì)胞的增殖。該結(jié)果與MOORE等[14]研究結(jié)果較一致。微陣列分析顯示，HE4過表達(dá)抑制順鉑介導(dǎo)的Egr1/MAPK上調(diào)，該信號通路參與促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控。

MMP9基因位于染色體20q11.1～13.1、26～27 kbp，具有13個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子，屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族主要功能是降解和重塑細(xì)胞外基質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡。MMP9可通過促進(jìn)VEGF釋放參與細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和血管形成[15]。腫瘤細(xì)胞分泌VEGF和MMP9，可促毛細(xì)血管形成，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤快速生長及轉(zhuǎn)移[16]。本研究首次觀察到HE4高表達(dá)的同時(shí)，VEGF和MMP9均有高表達(dá)的現(xiàn)象。具體機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究確認(rèn)。有研究通過對卵巢癌患者血清中VEGF，HE4和CA125水平檢測發(fā)現(xiàn)，CA125聯(lián)合HE4可以作為卵巢癌早期診斷的指標(biāo)。而VEGF對早期卵巢癌診斷無參考價(jià)值，僅對原位有癥狀而未發(fā)生轉(zhuǎn)移的卵巢癌有診斷價(jià)值[17]。本次研究中，筆者對HE4高表達(dá)削弱順鉑對細(xì)胞增殖和遷移影響的機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。結(jié)果研究發(fā)現(xiàn)，在HE4過表達(dá)HO8910PM細(xì)胞中，MMP9及VEGF表達(dá)水平顯著升高。表明HE4通過促進(jìn)MMP9及VEGF表達(dá)削弱了順鉑對細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用。

4 結(jié) 論

HE4在卵巢癌組織中有特異性高表達(dá)，HE4過表達(dá)后拮抗順鉑對細(xì)胞增殖的抑制作用，同時(shí)對順鉑引起的細(xì)胞遷移抑制也有減弱作用。HE4過表達(dá)的同時(shí)，新生血管形成相關(guān)的蛋白VEGF和MMP9也有相應(yīng)的高表達(dá)，表明HE4可能有促血管生成活性。潛在作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究確定。