p62 介導(dǎo)傳染性法氏囊病病毒VP2 蛋白自噬降解以抑制病毒復(fù)制的機制研究

傳染性法氏囊病病毒（IBDV）是一種禽雙鏈RNA 病毒，能夠引起雞的急性高度接觸性傳染病-傳染性法氏囊病（IBD）。該病引起雞群嚴(yán)重的免疫抑制，導(dǎo)致免疫失敗和其他病原體的感染。目前，IBDV 感染過程的免疫機制還不清楚。IBDV 感染細(xì)胞后，細(xì)胞的免疫系統(tǒng)被激活，包括細(xì)胞的自噬降解。選擇性自噬是真核生物細(xì)胞內(nèi)高度保守的自我降解的生物學(xué)過程，可以降解細(xì)胞內(nèi)多余或異常蛋白質(zhì)及細(xì)胞器，不僅是細(xì)胞抵抗內(nèi)外應(yīng)激的重要機制，而且是機體一種重要的免疫機制。選擇性自噬可以通過降解某些病毒的不同成分而抑制病毒的復(fù)制。其中，p62 是選擇性自噬重要的受體蛋白，參與細(xì)胞的多種選擇性自噬過程，可以單獨或協(xié)同其他自噬受體完成自噬的降解過程。

近期，《Journal of Virology》發(fā)表了“Cytoplasmic cargo receptor p62 inhibits avibirnavirus replication by mediating autophagic degradation of viral protein VP2”的論文研究。

該研究結(jié)果顯示，自噬激活劑可以下調(diào)IBDV VP2 蛋白的表達(dá)水平；自噬抑制劑可以上調(diào)VP2 蛋白的表達(dá)水平；而且敲低自噬蛋白ATG5，可以上調(diào)VP2 蛋白的表達(dá)水平。這些結(jié)果表明VP2 可以通過自噬途徑降解。為了探究自噬降解VP2 的分子機制，該研究利用免疫共沉淀和間接免疫熒光試驗（IFA）發(fā)現(xiàn)，在分別過表達(dá)VP2 蛋白和感染IBDV 后，VP2 均可以和自噬受體p62 相互作用。而且，激活或促進(jìn)細(xì)胞的自噬均可以增強VP2 與p62 的相互作用。IFA結(jié)果顯示，p62可以介導(dǎo)VP2與自噬標(biāo)志蛋白LC3的共定位。從這些結(jié)果推測p62 可能介導(dǎo)VP2 的自噬降解過程。為了證實這一推測，該研究通過構(gòu)建p62敲除的細(xì)胞系檢測VP2 蛋白的表達(dá)水平。Western blot 結(jié)果顯示，敲除p62 后，VP2 蛋白的表達(dá)水平顯著提高，且放線菌酮試驗結(jié)果表明，敲除p62，VP2蛋白的穩(wěn)定性顯著增強；回補p62，VP2 蛋白的穩(wěn)定性明顯降低。這些結(jié)果證實，p62 確實介導(dǎo)VP2的自噬降解。為了進(jìn)一步探究自噬受體p62 介導(dǎo)病毒蛋白VP2 自噬降解的機制，該研究構(gòu)建了缺失泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（UBA）的p62 缺失突變體。免疫共沉淀和放線菌酮等試驗結(jié)果顯示，p62 的UBA 結(jié)構(gòu)域缺失后，不僅p62 與VP2 的相互作用顯著減弱，而且p62 對VP2 蛋白穩(wěn)定性的影響也消失，表明p62 的UBA結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)p62對VP2的自噬降解。該結(jié)果還提示VP2可能發(fā)生泛素化修飾。為了證實上述推測，利用泛素化修飾試驗鑒定結(jié)果顯示VP2可以發(fā)生以K63泛素鏈為主的泛素化修飾。為了鑒定VP2的泛素化修飾位點，根據(jù)6 個潛在賴氨酸（lysine，K）泛素化修飾位點，構(gòu)建了6 個VP2 的KXR（R，arginine，精氨酸）突變體。泛素化修飾試驗結(jié)果顯示，K411突變?yōu)镽后，VP2 的泛素化修飾消失；表明VP2 的K411發(fā)生了泛素化修飾。免疫共沉淀和western blot 結(jié)果顯示，K411突變?yōu)镽 后，p62 不再與VP2 相互作用，且p62 對VP2 的降解作用消失。這些結(jié)果表明VP2 K411泛素化修飾介導(dǎo)VP2 與p62 的相互作用以及p62 對VP2 的自噬降解作用。為了探究p62對IBDV復(fù)制的作用，利用反向遺傳操作技術(shù)拯救了VP2 K411的突變株。通過測定野生型和VP2 K411突變型IBDV 的生長曲線，結(jié)果顯示敲除或過表達(dá)p62，可以促進(jìn)或抑制野生型IBDV 的復(fù)制；但是，敲除或過表達(dá)p62，對VP2 K411突變株卻無明顯影響。在此基礎(chǔ)上，該研究得出自噬受體p62通過UBA結(jié)構(gòu)域識別被泛素鏈修飾的病毒蛋白VP2，進(jìn)而將VP2 運輸?shù)阶允审w進(jìn)行降解，最終抑制IBDV 的復(fù)制。該研究闡述了細(xì)胞自噬抑制IBDV復(fù)制的抗病毒機制，為研究新的抗IBDV藥物提供了新思路。