反向遺傳學(xué)技術(shù)可快捷改善口蹄疫疫苗株的酸穩(wěn)定性

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起豬、牛、羊等多種偶蹄動(dòng)物感染的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，被OIE 列為必報(bào)疫病之首，我國(guó)將其規(guī)定為一類(lèi)動(dòng)物傳染病。目前，疫苗接種與撲殺結(jié)合的綜合措施是防治和根除FMD 的最經(jīng)濟(jì)有效的技術(shù)手段。

FMDV 病毒沒(méi)有囊膜包裹，對(duì)物理化學(xué)物質(zhì)的刺激非常敏感。FMDV 的全病毒粒子（146S）是制造滅活疫苗的最有效抗原，但是在稍低于中性pH 值的環(huán)境中，146S 是極端酸不穩(wěn)定的，導(dǎo)致FMDV 的衣殼蛋白解聚為12S 五聚體亞單位，嚴(yán)重影響滅活疫苗的有效抗原含量，降低疫苗的免疫效力。

近期，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所劉在新博士研究組在《Applied Microbiology and Biotechnology》發(fā)表了“Engineering viable foot-and-mouth disease viruses with increased acid stability facilitate the development of improved vaccines”的研究論文。為了增強(qiáng)O型疫苗毒株O/HN/CHN/93 的酸穩(wěn)定性，該團(tuán)隊(duì)利用反向遺傳技術(shù)，將文獻(xiàn)報(bào)道的能夠提高FMDV 酸穩(wěn)定性的氨基酸殘基突變以及該實(shí)驗(yàn)室在酸性環(huán)境中篩選到的氨基酸殘基突變（VP1N17D、 VP2H145Y、VP2 D86H、VP3 H141D、VP3 H141G 和VP1N17D+VP2H145Y）分別引入O/HN/CHN/93 株的全長(zhǎng)感染性cDNA 克隆中，成功構(gòu)建出6 個(gè)突變?nèi)L(zhǎng)質(zhì)粒，線化后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BSR/T7 細(xì)胞進(jìn)行病毒拯救。

間接免疫熒光結(jié)果顯示拯救出4 株FMDVs（rN17D、rD86H、rH145Y 和rN17D+H145Y），而VP3H141G/D 突變是致死性的，表明該位置的氨基酸殘基對(duì)O/HN/CHN/93 株的存活非常重要。RT-PCR和序列測(cè)定結(jié)果顯示，拯救病毒rN17D 和rD86H 中引入的突變能夠穩(wěn)定傳代，而rH145Y 和rN17D+H145Y 在第1 代發(fā)生回復(fù)突變和伴隨突變，說(shuō)明VP2H145 殘基對(duì)FMDV 功能的實(shí)現(xiàn)具有重要作用。隨后對(duì)拯救病毒rN17D、rD86H 和rN17D+H145Y（rN17D2）進(jìn)行一系列的理化及生物學(xué)特性分析。拯救病毒的理化性質(zhì)研究表明，VP1N17D 和VP2D86H突變均可以各自增強(qiáng)親本病毒O/HN/CHN/93 的酸、熱和堿穩(wěn)定性。生物學(xué)特性分析結(jié)果證明，與rN17D 相比，拯救病毒rD86H 表現(xiàn)出高的復(fù)制能力和稍強(qiáng)的乳鼠致病力。豚鼠血清中和試驗(yàn)表明，拯救病毒rN17D 和rD86H 的免疫原性與親本病毒相似。該研究還利用同源模建的方法，分析引入的氨基酸殘基突變對(duì)FMDV 蛋白衣殼上分子間作用力的影響，發(fā)現(xiàn)VP1N17 突變?yōu)閂P1D17 后，VP1T1 與VP1D17 新形成了一個(gè)氫鍵，增強(qiáng)了衣殼蛋白的穩(wěn)定 性； VP2D86 突 變 為VP2H86 后， VP2H86 與VP1N143 重新形成了氫鍵，也有利于增強(qiáng)FMDV 衣殼的穩(wěn)定性，這與實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。綜上所述，該研究第一次證明，VP2D86H 突變可以提高拯救病毒的酸穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，而不改變FMDV 的遺傳穩(wěn)定性、感染能力和抗原性；同時(shí)也驗(yàn)證了，在FMDV 疫苗毒株O/HN/CHN/93 中引入VP2D86H 突變比VP1N17D 突變效果更好，可以使拯救病毒具有更好的綜合性能，更適合作為制備耐酸和耐熱滅活疫苗的候選毒株。該研究還表明，同一個(gè)氨基酸替換引入不同血清型和血清亞型的FMDV 中，可以導(dǎo)致不同的效果。

病毒粒子的結(jié)構(gòu)和功能之間的相互制約決定了酸穩(wěn)定性逐漸增加的FMDV 突變株不容易自然產(chǎn)生。因此，獲得理化性質(zhì)穩(wěn)定的、感染性和其它功能不受影響的FMDV 突變株是很困難的。該研究將增強(qiáng)FMDV 酸穩(wěn)定性的經(jīng)典突變位點(diǎn)與新發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)、單位點(diǎn)突變與雙位點(diǎn)突變、以及不同位置的突變相結(jié)合，拯救出4 株基因工程修飾病毒，最終確定rD86H 可以作為FMDV 酸穩(wěn)定性的滅活疫苗候選株，這對(duì)改良生產(chǎn)用FMDV疫苗毒株具有重要意義。