水力負(fù)荷與有機(jī)負(fù)荷協(xié)同作用對(duì)人工濕地微生物群落結(jié)構(gòu)的影響*

丁海靜 游俊杰 王敦球, 王榮華 劉 良 白少元,#

(1.桂林理工大學(xué)廣西礦冶與環(huán)境科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，廣西 桂林 541004；2.桂林理工大學(xué)廣西環(huán)境污染控制理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林 541004；3.廣西恒晟水環(huán)境治理有限公司，廣西 桂林 541004)

在人工濕地系統(tǒng)中，微生物對(duì)不同污染物的凈化起重要作用，在物質(zhì)轉(zhuǎn)化、能量流動(dòng)中也占有重要的位置，微生物的種群結(jié)構(gòu)及多樣性直接影響到濕地系統(tǒng)的凈化功能[1-2]。為更好地了解濕地系統(tǒng)中微生物的多樣性，前人對(duì)此展開(kāi)了大量的研究。李新慧等[3]研究了多種氟喹諾酮對(duì)人工濕地凈化能力和微生物群落的影響，通過(guò)在人工濕地進(jìn)水中添加氧氟沙星、諾氟沙星和環(huán)丙沙星等，監(jiān)測(cè)水質(zhì)變化和微生物群落變化。裘湛[4]綜述了濕地植物種類、光照條件、基質(zhì)特性等對(duì)植物根際效應(yīng)的影響，進(jìn)一步闡釋分析了濕地植物對(duì)根際微生物活性、降解性能和種群組成的影響機(jī)理。在人工濕地系統(tǒng)工藝設(shè)計(jì)中，通過(guò)篩選人工濕地植物種類和優(yōu)化工藝條件來(lái)強(qiáng)化人工濕地植物根際效應(yīng)，有助于提高人工濕地工藝的處理效率。陳慧萍等[5]采用高通量測(cè)序和網(wǎng)絡(luò)分析對(duì)電解強(qiáng)化人工濕地系統(tǒng)中的功能微生物群落進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，電解強(qiáng)化人工濕地中有大量的自養(yǎng)型反硝化功能菌，保障了在低碳氮比下污水處理廠尾水中氮的脫除。

綜上可知，人工濕地基質(zhì)微生物的研究至關(guān)重要，鑒于此，本研究以3種基質(zhì)結(jié)構(gòu)構(gòu)建人工濕地系統(tǒng)，分別在不同水力負(fù)荷、不同有機(jī)負(fù)荷運(yùn)行條件下，利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)人工濕地系統(tǒng)基質(zhì)表面的微生物進(jìn)行測(cè)序，分析不同填充結(jié)構(gòu)形成不同流場(chǎng)分布的人工濕地床體中微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性，最后分析不同基質(zhì)結(jié)構(gòu)與微生物群落結(jié)構(gòu)分布的相關(guān)性[6-7]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置

本研究模擬水平潛流人工濕地系統(tǒng)，濕地系統(tǒng)長(zhǎng)、寬、高分別為2.0、1.2、0.7 m，均由厚度為3 mm的不銹鋼材構(gòu)建而成。濕地基質(zhì)填充深度0.6 cm，表層預(yù)留10 cm的超高區(qū)域，床體種植濕生挺水植物美人蕉，種植密度為20株/m2。濕地的布水區(qū)和集水區(qū)寬度均為20 cm，均用滲透系數(shù)為500 m/d的鵝卵石進(jìn)行填充，床體其余區(qū)域均用石英砂填充。構(gòu)建3個(gè)小型人工濕地裝置：(1)單層基質(zhì)結(jié)構(gòu)人工濕地系統(tǒng)，記為CW1，該濕地基質(zhì)用粒徑為4.75～8.00、2.00～3.35 mm的石英砂以1∶1的質(zhì)量比混合填充，基質(zhì)滲透系數(shù)為65 m/d；(2)3層基質(zhì)結(jié)構(gòu)人工濕地系統(tǒng)，記為CW3，該人工濕地系統(tǒng)基質(zhì)石英砂粒徑分布為第1層0.20～0.40 mm，第2層0.40～0.60 mm，第3層0.90～2.00 mm，基質(zhì)滲透系數(shù)從上到下依次為26、36、64 m/d；(3)6層基質(zhì)結(jié)構(gòu)人工濕地系統(tǒng)，記為CW6，該人工濕地系統(tǒng)基質(zhì)石英砂粒徑分布為第1層0.40～0.80 mm，第2層0.40～0.60 mm，第3層0.40～0.90 mm，第4層1.00～2.00 mm，第5層2.00～4.00 mm，第6層4.00～6.00 mm，其滲透系數(shù)從上到下依次為38、36、43、55、75、176 m/d。

1.2 進(jìn)水水質(zhì)

實(shí)驗(yàn)裝置位于桂林理工大學(xué)污水處理站，原水來(lái)自調(diào)節(jié)池，實(shí)驗(yàn)采用連續(xù)進(jìn)水運(yùn)行方式，儲(chǔ)水箱容積為2 m3，以乙酸鈉為氮源，氯化銨為碳源，磷酸二氫鉀為磷源，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的水力負(fù)荷和有機(jī)負(fù)荷配置模擬污水，調(diào)節(jié)污水C∶N∶P(質(zhì)量比)=80∶6∶1。

1.3 運(yùn)行參數(shù)

實(shí)驗(yàn)設(shè)置2個(gè)水平的水力負(fù)荷及4個(gè)水平的有機(jī)負(fù)荷，實(shí)驗(yàn)運(yùn)行參數(shù)設(shè)置見(jiàn)表1。為降低有機(jī)負(fù)荷變化對(duì)濕地基質(zhì)的影響，實(shí)驗(yàn)過(guò)程逐步提高進(jìn)水有機(jī)負(fù)荷，在低、高水力負(fù)荷交替下運(yùn)行，即依次為L(zhǎng)1、H1、L2、H2、L3、H3、L4、H4，運(yùn)行過(guò)程中監(jiān)測(cè)濕地進(jìn)水和出水的COD和總懸浮固體(TSS)，待出水監(jiān)測(cè)指標(biāo)穩(wěn)定時(shí)視為實(shí)驗(yàn)結(jié)束，將儲(chǔ)水箱殘留物進(jìn)行清理，然后進(jìn)行下一運(yùn)行條件的實(shí)驗(yàn)。

表1 實(shí)驗(yàn)運(yùn)行參數(shù)設(shè)置

1.4 采樣及測(cè)試

實(shí)驗(yàn)運(yùn)行期間每周測(cè)定人工濕地進(jìn)出水COD、TSS，于高負(fù)荷運(yùn)行條件(H4)下對(duì)床體的進(jìn)水端(距布水區(qū)30 cm處)和出水端(距集水區(qū)30 cm)的基質(zhì)進(jìn)行取樣，分別采集基質(zhì)表層(0.1 m)、基質(zhì)中層(0.3 m)、基質(zhì)底層(0.5 m)樣品，進(jìn)水端表層、中層、底層基質(zhì)樣品分別標(biāo)記為A1、A2、A3，出水端表層、中層、底層基質(zhì)樣品分別標(biāo)記為B1、B2、B3，以CW3為例，人工濕地結(jié)構(gòu)圖及取樣點(diǎn)布置情況如圖1所示。

圖1 CW3實(shí)驗(yàn)裝置及采樣點(diǎn)布置Fig.1 CW3 experimental setup and sampling point

1.5 樣品預(yù)處理和高通量測(cè)序

稱取0.5 g基質(zhì)樣品采用Mag-Bind Soil DNA Kit的試劑盒進(jìn)行DNA初步提取，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：在2 mL離心管中加入0.8 mL Buffer SLX Mlus，振蕩混勻5 min，加入80 μL Buffer DS并振蕩混勻，接著在恒溫金屬浴70 ℃下裂解10 min，13 000 r/min室溫離心5 min，吸取600 μL上層液體，加入200 μL Buffer SP2，振蕩混勻，加入100 μL HTR Reagent，混勻10 s，冰浴5 min，13 000 r/min室溫離心5 min，吸取400 μL上清液體，加入450 μL Binding Buffer和40 μL MagSi Particles振蕩混勻，室溫靜置2 min，放置在磁力架上吸附5 min，棄上層清液；加入500 μL Binding Buffer，振蕩混勻，室溫放置2 min，放置在磁力架上吸附5 min，棄上層清液；加入1 000 μL Buffer PHB，振蕩混勻，放置在磁力架5 min，棄上層清液；加入1 000 μL SPM Wash Buffer，混勻放置在磁力架5 min，棄上層清液；重復(fù)加入1 000 μL SPM Wash Buffer，混勻放置在磁力架5 min，棄上層清液，置于55 ℃烘箱10 min，使SPM Wash Buffer中殘留的酒精完全揮發(fā)，加入60 μL Elution Buffer到離心管中，充分振蕩混勻，65 ℃金屬浴10 min，磁力架吸附5 min，吸取上清DNA液體到1.5 mL離心管中。

對(duì)18個(gè)基質(zhì)樣品進(jìn)行DNA初步提取，然后用1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA完整性。對(duì)16s RNA基因的V4高變區(qū)片段進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，引物序列為515F引物：CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTN (barcode) GTGCCAGCMGCCGCGGTAA和805R引物GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGGAC TACHVGGGTATCTAATCC。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；接著94 ℃變性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，進(jìn)行5個(gè)循環(huán)；然后94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行20個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72 ℃最終延伸5 min。PCR結(jié)束后，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)，利用Qubit 2.0 DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)回收的DNA精確定量，隨后進(jìn)行高通量測(cè)序分析，對(duì)97%相似水平的可操作分類單元(OTUs)代表序列進(jìn)行分類分析，并在各個(gè)分類水平上統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的群落組成[8]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用軟件Excel 2010和SPSS 20.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并使用Origin 8.0畫(huà)圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同負(fù)荷條件下人工濕地的凈化效果

3個(gè)人工濕地系統(tǒng)對(duì)COD、TSS的去除效果見(jiàn)圖2至圖5?？梢钥闯?，3個(gè)人工濕地系統(tǒng)對(duì)COD、TSS都有明顯的去除效果，不同水力負(fù)荷條件下，隨著有機(jī)負(fù)荷的提高，COD、TSS的去除率均表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)；總體看來(lái)，相同運(yùn)行條件下，CW6對(duì)COD、TSS的去除率最高，低水力負(fù)荷條件下，CW6在較低有機(jī)負(fù)荷水平(L2)時(shí)的凈化效果最好，COD、TSS去除率分別為88.8%±1.4%、85.8%±1.4%；高水力負(fù)荷條件下，CW6在較高有機(jī)負(fù)荷水平(H3)時(shí)的凈化效果最好，COD、TSS去除率分別為80.4%±2.2%、82.4%±4.0%。CW6從床體表層到底層滲透系數(shù)逐漸升高，這種分層結(jié)構(gòu)可強(qiáng)化人工濕地對(duì)COD、TSS的去除能力，這可能是由于不同滲透系數(shù)分層結(jié)構(gòu)使床體流場(chǎng)分布趨于均勻，有利于基質(zhì)及基質(zhì)上附著的微生物與污染物充分接觸，提高凈化性能。

圖2 低水力負(fù)荷條件下CW1、CW3和CW6的COD去除率Fig.2 COD removal rate of CW1,CW3 and CW6 under low hydraulic loading conditions

圖3 高水力負(fù)荷條件下CW1、CW3和CW6的COD去除率Fig.3 COD removal rate of CW1,CW3 and CW6 under high hydraulic loading conditions

圖4 低水力負(fù)荷條件下CW1、CW3和CW6的TSS去除率Fig.4 TSS removal rate of CW1,CW3 and CW6 under low hydraulic loading conditions

圖5 高水力負(fù)荷條件下CW1、CW3和CW6的TSS去除率Fig.5 TSS removal rate of CW1,CW3 and CW6 under high hydraulic loading conditions

2.2 微生物群落結(jié)構(gòu)

2.2.1 門(mén)水平群落結(jié)構(gòu)組成

在H4運(yùn)行條件下采集各人工濕地系統(tǒng)基質(zhì)樣品，利用高通量測(cè)序方法分析18個(gè)基質(zhì)樣品，得到615 845條高質(zhì)量序列和12 001個(gè)OTUs，包括40門(mén)、71綱、147目、236科及763屬。對(duì)樣品中相似度97%以上的OTUs在門(mén)水平上進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，CW1、CW3、CW6中各基質(zhì)樣品的微生物在門(mén)水平上的群落結(jié)構(gòu)組成如圖6所示。可以看出，所有基質(zhì)樣品中鑒定出的優(yōu)勢(shì)菌主要為變形菌門(mén)(Proteobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)。由圖7可見(jiàn)，3個(gè)人工濕地系統(tǒng)中的主要菌門(mén)均為變形菌門(mén)，其在CW1中相對(duì)豐度為55.9%，在CW3、CW6中的相對(duì)豐度分別為50.8%、57.6%，變形菌門(mén)是生活污水中的主要優(yōu)勢(shì)菌[9]，大多數(shù)為異養(yǎng)菌，它們代謝途徑很多，不同類型的有機(jī)物經(jīng)過(guò)其消化和分解均能有所去除。已有研究表明，變形菌門(mén)中包含許多與有機(jī)物和無(wú)機(jī)物代謝(如碳循環(huán)、氮循環(huán)和硫循環(huán))有關(guān)的菌屬，其在人工濕地中廣泛分布[10-11]，有助于發(fā)揮出人工濕地對(duì)污染物的去除作用。擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)在CW1中的相對(duì)豐度分別為18.0%、7.6%，在CW3中的相對(duì)豐度分別為13.6%、20.6%，在CW6中的相對(duì)豐度分別為18.8%和6.9%。擬桿菌門(mén)主要優(yōu)勢(shì)菌為化能營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌，能夠?qū)⒌矸?、纖維素最終水解為氨基酸、有機(jī)酸等，所以對(duì)有機(jī)物的降解同樣具有重要作用[12-13]，促進(jìn)了人工濕地對(duì)污染物的去除效果。厚壁菌門(mén)同樣是以化能營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌為主的菌門(mén)，在其生長(zhǎng)環(huán)境中都會(huì)有其內(nèi)生孢子，也是生活污水中常有的菌群[14-15]。連續(xù)進(jìn)水方式使人工濕地系統(tǒng)復(fù)氧能力減弱，導(dǎo)致系統(tǒng)基質(zhì)處于還原狀態(tài)，不利于有機(jī)物的降解，影響微生物正常生命活動(dòng)，進(jìn)而使運(yùn)行后期各污染物的去除率降低。

圖6 3個(gè)人工濕地中微生物OTUs分布Fig.6 OTUs distribution of microorganisms in 3 constructed wetlands

圖7 3個(gè)人工濕地中各菌門(mén)相對(duì)豐度Fig.7 The proportion of each phylum in 3 constructed wetlands

2.2.2 綱水平群落結(jié)構(gòu)組成

對(duì)CW1、CW3、CW6中各基質(zhì)樣品微生物在綱水平上的相對(duì)豐度進(jìn)行分析。變形菌門(mén)中的優(yōu)勢(shì)菌群為γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)和β-變形菌綱(Betaproteobacteria)，其中，不同濕地系統(tǒng)的γ-變形菌綱的相對(duì)豐度具有相似性，并且在所有綱類上占比最高，而β-變形菌綱差異性最為明顯，在CW1、CW3和CW6濕地床體中相對(duì)豐度分別為12.9%、15.3%和20.3%，β-變形菌綱經(jīng)常利用有機(jī)物分解產(chǎn)生的氨氣、甲烷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，β-變形菌綱的相對(duì)豐度越高，表明微生物群落結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定[16-17]。WARKENTIN等[18]研究了水環(huán)境中細(xì)菌對(duì)溶解性有機(jī)污染物(DOP)的降解性，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌對(duì)瓦爾諾河水體中的DOP具有生物再礦化作用，特別是原放線菌、β-變形菌、噬纖維菌和黃桿菌對(duì)DOP具有趨化性優(yōu)勢(shì)。擬桿菌門(mén)中相對(duì)豐度較高的菌群有鞘脂桿菌綱(Sphingobacteriia)、黃桿菌綱(Flavobacteriia)和擬桿菌綱(Bacteroidia)，它們?cè)?個(gè)濕地系統(tǒng)中的相對(duì)豐度均有一定的差異性，其中以鞘脂桿菌綱相對(duì)豐度最高，在CW1、CW3和CW6中相對(duì)豐度分別為9.5%、5.3%、7.1%；芽胞菌綱(Bacilli)和梭菌綱(Cytophagia)屬于厚壁菌門(mén)，兩者在不同濕地系統(tǒng)中表現(xiàn)出明顯的差異性，其中芽胞菌綱相對(duì)豐度較高，其在CW3中的相對(duì)豐度最高，達(dá)到13.1%，而在CW1、CW6中的相對(duì)豐度僅有4.9%、4.5%。由此看出，由于污水中污染物組成相同，因此CW1、CW3和CW6中的微生物結(jié)構(gòu)存在相似性，但濕地床體的分層結(jié)構(gòu)不同對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，因此微生物結(jié)構(gòu)也有不同程度的差異性，總的來(lái)說(shuō)，分層填充的人工濕地系統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定，對(duì)污染物的去除效果較好。

3 結(jié) 論

(1) 不同水力負(fù)荷條件下，隨著有機(jī)負(fù)荷的提高，CW1、CW3和CW6濕地系統(tǒng)COD、TSS的去除率均表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)；總體來(lái)看，相同運(yùn)行條件下，CW6對(duì)COD、TSS的去除率最高，可見(jiàn)不同滲透系數(shù)分層結(jié)構(gòu)使床體流場(chǎng)分布趨于均勻，有利于基質(zhì)及基質(zhì)上附著的微生物與污染物充分接觸，提高凈化性能。

(2) CW1、CW3、CW6濕地系統(tǒng)微生物在門(mén)水平上主要優(yōu)勢(shì)菌門(mén)有變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)，它們都對(duì)污水中有機(jī)物分解和利用具有重要作用，其中以變形菌門(mén)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。

(3) 對(duì)基質(zhì)樣品微生物在綱水平上的相對(duì)豐度進(jìn)行分析，γ-變形菌綱在變形菌門(mén)中占主導(dǎo)地位，在不同濕地系統(tǒng)中具有相似性，而β-變形菌綱差異性最為明顯，在CW1、CW3和CW6濕地床體中占比分別為12.9%、15.3%和20.3%。擬桿菌門(mén)中鞘脂桿菌綱相對(duì)豐度最高，在CW1、CW3和CW6中相對(duì)豐度分別為9.5%、5.3%、7.1%，厚壁菌門(mén)中芽胞菌綱相對(duì)豐度較高，CW1、CW3、CW6中的相對(duì)豐度為4.9%、13.1%、4.5%。

(4) 濕地系統(tǒng)基質(zhì)結(jié)構(gòu)對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)具有不同程度的影響，分層填充的濕地系統(tǒng)形成的均勻流場(chǎng)有助于微生物群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。