蒲棒浸提液機制下黑木耳發(fā)酵方法及相關檢測

平琳琳，吳亞楠，寇博翔，王謙

(河北大學 生命科學學院，河北 保定 071002)

黑木耳(Auriculariaauricula)又名黑菜、木蛾、木菌等，屬于擔子菌綱、木耳目、木耳科、木耳屬[1]，主要分布在中國東北三省、河北、河南、湖北、四川、貴州等地[2].研究表明，黑木耳發(fā)酵物能顯著降低SD大鼠血清中的總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇及低密度脂蛋白膽固醇[3]；其子實體多糖可以促進吞噬細胞的吞噬作用，從而提高機體免疫力.黑木耳不僅口味鮮美而且營養(yǎng)豐富，是中國傳統(tǒng)的藥食兩用真菌[4-6].

蒲棒，又名蒲包草，是香蒲的果穗，其茸毛可藥用，具有消炎止血功效.其上方部位的雄蕊花粉，又名蒲黃.研究表明，低劑量蒲黃煎劑和醇提取物可以使得兔和豚鼠心率減慢和血壓降低[7-9]；家兔口服蒲黃，可以有效抑制其食餌性高膽固醇的形成；其水煎劑可調節(jié)免疫功能，濃縮外敷亦有殺菌消炎作用，極具藥用價值.

隨著社會發(fā)展，人們的保健意識逐漸提高，而食用菌極具保健開發(fā)價值.因此，利用蒲棒制成蒲棒水煎劑，對食藥兼用的黑木耳進行發(fā)酵培養(yǎng)，并觀察其發(fā)酵醪液對果蠅壽命的影響，為黑木耳新型功能食品的開發(fā)提供了新思路.

1 材料與方法

1. 1 材料

1.1.1 供試菌株和果蠅

供試菌株：黑木耳，由河北大學食藥用真菌研究所提供.

供試果蠅：黑腹果蠅,由河北大學生命科學學院提供.

1.1.2 蒲棒提取液的制備

取狹葉香蒲蒲棒50 g，置于10倍蒸餾水中浸泡過夜，加熱至沸后改用文火煎30 min，趁熱過濾，濾渣再置于8倍水中，同法煎煮30 min，過濾，合并2次的濾液，放涼至室溫備用[10].

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(質量分數(shù))：馬鈴薯 20%、葡萄糖 2%、磷酸二氫鉀0.1 %、無水硫酸鎂0.1%、瓊脂2%，pH 自然.

液體菌種培養(yǎng)基(質量分數(shù))：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、磷酸二氫鉀0.1%、無水硫酸鎂0.1%，pH自然.

基礎發(fā)酵培養(yǎng)基(質量分數(shù))：蔗糖 3%、麩皮 4%、酵母膏 0.2%、磷酸二氫鉀0.1%、無水硫酸鎂0.1%，pH自然.

果蠅基礎培養(yǎng)基(質量分數(shù))：瓊脂1.5%、蔗糖10%、玉米粉15%、丙酸1%.

1.1.4 主要試劑與設備

葡萄糖、磷酸二氫鉀、 硫酸鎂、蒸餾水、乙醚、乙醇、丙酸等；電子分析天平(FA2104)，壓力蒸汽滅菌鍋，超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱，恒溫培養(yǎng)搖床等.

1.2 方法

1.2.1 黑木耳PDA斜面培養(yǎng)

將4 ℃保存的黑木耳試管菌種放置于室溫或25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中活化1～2 d，而后于超凈工作臺無菌環(huán)境下，使用接種鉤轉接黑木耳菌種至斜面培養(yǎng)基上，放入25 ℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng) 8～10 d，待菌絲長滿斜面培養(yǎng)基后進行下一步實驗[11].

1.2.2 液體菌種制備

250 mL搖瓶裝液量100 mL，接種黑木耳菌種，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置24 h后，28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)5 d，得到菌種作為一級菌種[12].

將一級菌種按照體積分數(shù)10%的接種量，接種至裝有100 mL實驗設計的不同發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)5 d[13].

1.2.3 液體培養(yǎng)基單因素實驗

1) 蒲棒提取液發(fā)酵培養(yǎng)基碳源篩選實驗

對蒲棒提取液發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源按表1進行篩選，選擇最適碳源.

2)蒲棒提取液發(fā)酵培養(yǎng)基氮源篩選實驗

對蒲棒提取液發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源按表2進行篩選，選擇最適氮源.

表1 碳源的篩選Tab.1 Screening of carbon sources

表2 氮源的篩選Tab.2 Screening of nitrogen sources

1.2.4 正交實驗

根據(jù)單因素實驗結果選擇最適的速效碳源葡萄糖、遲效碳源玉米粉和最適氮源豆餅粉、輔助氮源酵母膏作為正交實驗的4個因素，每個因素設3個水平，設計 L9(34)正交實驗因素水平表，詳見表3.按照表3的安排進行實驗，進行二級搖瓶培養(yǎng)，置于搖床28 ℃ 、160 r/min培養(yǎng)5 d.每個處理設置3個重復，在發(fā)酵結束后，測定鮮菌絲質量，分析統(tǒng)計結果，以確定最優(yōu)培養(yǎng)基配方.

表3 液體發(fā)酵培養(yǎng)基正交實驗因素水平

1.2.5 黑木耳液體發(fā)酵生長曲線的測定

將黑木耳一級菌種接入正交實驗得出的最優(yōu)配方發(fā)酵培養(yǎng)基中，進行二級發(fā)酵培養(yǎng)，以基礎發(fā)酵配方為對照組，培養(yǎng)條件同上.自發(fā)酵開始計時，每過8 h取3瓶測定鮮菌絲質量，連續(xù)至7 d停止，記錄數(shù)據(jù)并繪制生長曲線，確定最適菌齡.

1.2.6 果蠅壽命實驗

利用篩選出的最優(yōu)配方對黑木耳進行發(fā)酵培養(yǎng)5 d，將發(fā)酵醪液制成勻漿.挑選羽化后8 h內的果蠅，乙醚麻醉[14-15]后，將雌雄分開并分別分為5組，每組50只.5組分別包括1組空白對照組和4組實驗組.

對照組培養(yǎng)基選用果蠅基礎培養(yǎng)基，4組實驗組培養(yǎng)基是于果蠅基礎培養(yǎng)基內添加不同劑量的黑木耳發(fā)酵醪液勻漿.每組喂食10 g培養(yǎng)基，每5天更換1次培養(yǎng)基.記錄5組的果蠅生存情況(每組的半數(shù)死亡時間、平均壽命)，并記錄最后5只果蠅的壽命，求其平均值，得出果蠅最高壽命.此實驗在秋季進行并完成.

2 結果與分析

2.1 液體培養(yǎng)基單因素實驗結果

2.1.1 碳源篩選結果

不同碳源篩選實驗結果見表4.由表4可以得出，黑木耳發(fā)酵于葡萄糖與玉米粉培養(yǎng)基下，鮮菌絲質量較高.在P=0.01下，葡萄糖與玉米粉對發(fā)酵培養(yǎng)無極顯著差異，且菌球直徑符合液體感官指標.因此，選擇速效碳源葡萄糖與遲效碳源玉米粉作為最適復合碳源，進行后續(xù)正交實驗.

表4 碳源篩選結果

*為100 mL發(fā)酵液過濾得到的鮮菌絲質量.

2.1.2 氮源篩選結果

不同氮源篩選實驗結果見表5.由表5可以得出，在P=0.05 與P=0.01水平下，利用豆餅粉和酵母膏作為氮源培養(yǎng)黑木耳為宜，且菌球直徑符合液體感官指標.因此，選擇豆餅粉與酵母膏作為最適復合氮源，進行后續(xù)正交實驗.

表5 氮源篩選結果

*為100 mL發(fā)酵液過濾得到的鮮菌絲質量.

2.2 正交實驗結果

最優(yōu)碳氮源正交實驗結果見表6，液體培養(yǎng)基配方不同添加量下，所得的鮮菌絲質量具有差異.分析R值可知，因素A(葡萄糖)對黑木耳發(fā)酵培養(yǎng)影響最大，其次是因素B(玉米粉)，因素D(酵母膏)對黑木耳發(fā)酵培養(yǎng)效果影響最小.由表6可得，A2B2C3D1下鮮菌絲質量最大.在此配方基礎上進行重組得到A2B1C2D1配方下所得的鮮菌絲質量更高，但組合不在正交表內.因此，選取組合方式為A2B1C2D1，即培養(yǎng)基中添加質量分數(shù)3%葡萄糖、3%玉米粉、2%豆餅粉、0.5%酵母膏時，黑木耳發(fā)酵效果最好.

表6 正交實驗結果分析

*為100 mL發(fā)酵液過濾得到的鮮菌絲質量.

2.3 黑木耳液體發(fā)酵生長曲線的測定結果

黑木耳發(fā)酵生長曲線測定結果見圖1.最優(yōu)配方在120 h達到最高鮮菌絲質量(32.57 g)；較基礎發(fā)酵培養(yǎng)基提前8 h，且最高鮮菌絲質量高出1.24 g.因此選擇黑木耳在發(fā)酵時間為120 h時，制備黑木耳發(fā)酵醪液，用于后續(xù)果蠅壽命實驗.

*為100 mL發(fā)酵液過濾得到的鮮菌絲質量.

2.4 果蠅壽命實驗結果

2.4.1 雌性果蠅壽命實驗結果

黑木耳發(fā)酵醪液勻漿對雌性果蠅的半數(shù)死亡期、平均壽命及最高壽命影響見表7.由表7可以看出，與對照組相比，當在培養(yǎng)基中添加發(fā)酵醪液勻漿時，對果蠅壽命均有不同延長.當添加體積分數(shù)30%的發(fā)酵醪液勻漿時，果蠅的半數(shù)死亡期延長最大，延長率達到17.04%；平均延壽率達到13.51%；最高延壽率達到14.76%.并且，均與對照組有顯著性差異(P<0.05).

表7 雌性果蠅壽命實驗結果

與對照組比較，*P<0.05，“-”表對照.

2.4.2 雄性果蠅壽命實驗結果

黑木耳發(fā)酵醪液對雄性果蠅的半數(shù)死亡期、平均壽命及最高壽命影響見表8.由表8可以看出，與對照組相比，當在培養(yǎng)基中添加發(fā)酵醪液時，對果蠅壽命均有不同延長.當添加量增加至體積分數(shù)30%時，果蠅的半數(shù)死亡期延長最大，延長率達到18.39%；平均延壽率達到17.87%；最高延壽率達到17.91%.并且，均與對照組有顯著性差異(P<0.05).

表8 雄性果蠅壽命實驗

與對照組比較，*P<0.05，“-”表對照.

3 結論

通過研究，探索出了以蒲棒浸提液為基液下，黑木耳發(fā)酵的最優(yōu)配方.利用黑木耳最優(yōu)發(fā)酵配方，確定了其生長曲線和最佳菌齡.

初步研究表明，在普通培養(yǎng)基中，添加體積分數(shù)30%的黑木耳發(fā)酵醪液能夠使果蠅壽命顯著提高.本研究為黑木耳新型功能食品的開發(fā)提供了新思路.其中延長壽命的物質一般來說與大型真菌的多糖有關，但機理仍不能明確，有待進一步研究.