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    一種檢測生物硫醇的熒光探針

    2020-01-15 01:16:34周柯巖楊瑜濤李華肖李瑋
    關(guān)鍵詞:硫醇半胱氨酸探針

    周柯巖,楊瑜濤, 李華肖, 李瑋

    (1.河北大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,河北 保定 071002;2.河北大學(xué) 教育部藥物化學(xué)與分子診斷重點實驗室,河北 保定 071002)

    硫醇是一種含有巰基官能團的一類非芳香族化合物.其中小分子生物硫醇主要包括半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH),它們在生物體內(nèi)參與多種生理活動,在蛋白質(zhì)的合成、氧化還原、細胞的抗氧化等重要的生理過程中發(fā)揮著重要作用[1].作為一種可以天然產(chǎn)生的氨基酸——半胱氨酸(Cys),其具有刺激造血機能,促進皮膚損傷修復(fù)的作用[1-2],細胞內(nèi) Cys 的缺失,會造成肝臟損傷、毛發(fā)減少褪色等等.人體中一個非常重要的中間代謝產(chǎn)物——高半胱氨酸(Hcy),其在人體中的含量大于 10 μmol/L 則會表現(xiàn)為臨床異常[3-8],含量過高會導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞損傷、心血管病、骨軟弱癥、精神疾病等等.細胞內(nèi)含量最高的一種硫醇——谷胱甘肽(GSH),可以參加多種機體的生化反應(yīng),其在免疫方面發(fā)揮著重要作用[9],其含量與衰老、過敏、腫瘤、脂肪肝、艾滋病等有著重要的聯(lián)系. 近年來,用來檢測生物硫醇類的小分子熒光探針受到了廣泛關(guān)注.小分子生物硫醇的熒光探針的檢測主要基于親核加成反應(yīng)[10-13]、斷鍵分解反應(yīng)[14-16]、金屬絡(luò)合物置換配位反應(yīng)[17]等反應(yīng)機理.本文成功設(shè)計并合成了一種基于色烯衍生物的熒光探針 1,該探針能夠?qū)崿F(xiàn)對生物硫醇的快速、高靈敏度和高選擇性的“關(guān)”-“開”型熒光信號響應(yīng).

    1 實驗部分

    1.1 實驗儀器和試劑

    1.1.1 主要實驗儀器

    ZF-20D 暗箱式紫外分析儀,600Hz 核磁共振儀(Bruker),Agilent Technologies Cary 60紫外-可見分光光度計,Agilent Technologies Cary Eclipse 熒光分光光度計,Agilent Technologies 質(zhì)譜儀.

    1.1.2 主要實驗試劑

    1.2 溶液配制及光譜測定

    用 DMF 制備探針的儲備液,配制溶度為 2×10-3mol/L,各種氨基酸和陰離子均用去離子水配制,濃度為 2×10-3mol/L.紫外和熒光光譜在 PBS-DMF(10 mmol/L,體積比1∶1,pH=7.4)中檢測獲得,熒光光譜激發(fā)波長為 395 nm,光柵狹縫 5 nm /5 nm,電壓為 600 V 條件下獲得.

    1.3 熒光探針的制備與表征

    熒光探針的合成路線見圖1.

    化合物2∶5-氯-2-羥基-1,3-(亞苯基)二甲醇;化合物3∶5-氯-2-羥基-3-(羥甲基)苯甲醛;化合物4∶色烯衍生物.

    1.3.1 化合物4(色烯衍生物)的合成

    將化合物3(0.372 g,2 mmol)、環(huán)戊烯酮(0.164 g,4 mmol)以及咪唑(0.136 g,2 mmol)加入到圓底燒瓶中,用溶劑V(THF)∶V(H2O)=1∶1進行溶解,在 30 ℃下緩慢攪拌 72 h,點板監(jiān)測,直至反應(yīng)完畢,得到深棕色溶液.用乙酸乙酯萃取3次,合并有機相,用無水硫酸鈉干燥,通過真空濃縮,除去溶劑,粗產(chǎn)物通過硅膠柱色譜(V(PE)∶V(EA)=2∶1)分離得到黃色固體(0.25 g,質(zhì)量分數(shù)50%).

    1.3.2 化合物3(5-氯-2-羥基-3-(羥甲基)苯甲醛)的合成

    將化合物2(20 g,106 mmol)和二氧化錳(20 g,230 mmol)加入到圓底燒瓶中,將其溶解于 300 mL 氯仿中,在0 ℃下攪拌反應(yīng) 1 h,點板監(jiān)測,直至反應(yīng)完畢. 將反應(yīng)液通過真空過濾,收集濾液,將其真空干燥,除去溶劑,粗產(chǎn)物通過硅膠柱色譜(V(PE) ∶V(EA)=15∶1)分離得到白色晶體(11.04 g,質(zhì)量分數(shù)56%).

    1.3.3 化合物2((5-氯-2-羥基-1、3-(亞苯基)二甲醇)苯甲醛的合成

    將氫氧化鈉(6 g,150 mmol)溶解在 20 mL 水中,向其溶液中加入對氯苯酚(19 g,150 mmol),緩慢攪拌至溶解,且溶液變?yōu)榻瘘S色,再向其中加入多聚甲醛(9 g,300 mmol),加熱到 50 ℃,反應(yīng) 1 h,至有黃色固體產(chǎn)生,停止反應(yīng),將其溶解于熱水100 mL中,用HCl調(diào)至 pH 1~2,真空過濾,真空干燥,得到淺黃色固體(26.89 g,質(zhì)量分數(shù)98%).

    1.3.4 探針1的合成

    將化合物4(0.32 g,1.5 mmol)和氧化劑 PCC(0.32 g,1.5 mmol),溶解于二氯甲烷中,室溫攪拌,點板監(jiān)測,直至反應(yīng)完畢,停止反應(yīng),真空濃縮除去溶劑,粗產(chǎn)物通過硅膠柱色譜(V(PE)∶V(EA)=7∶1)得到黃色固體(0.11g,46%質(zhì)量分數(shù)).探針的核磁表征如圖2.1H NMR(CDCl3,600 MHz)δ:10.40(s,1H),7.76(d,J=2.5 Hz,1H),7.4(d,J=2.5 Hz,1H),7.14(d,J=2.4 Hz,1H),5.42~5.39(m,1H),2.83~2.78(m,1H),2.69~2.64(m,1H),2.44~2.37(m,1H),2.28~2.21(m,1H),13C NMR(CDCl3,150 MHz)δ:200.3,187.2,155.9,135.0,133.4,129.6,127.8,125.3,125.1,124.6,76.4,36.9,27.9.

    1H NMR(CDCl3,600 MHz);13C NMR(CDCl3,150 MHz).

    2 結(jié)果與討論

    2.1 探針1對生物硫醇的光譜研究

    首先,筆者進行了探針 1 識別生物硫醇的滴定光譜研究,在含有探針 1 (50 μmol/L) 的PBS-DMF(體積比1∶1,pH 7.4,10 mmol/L)緩沖體系中展開,以 GSH 為例進行研究.如圖3a 所示,將 GSH 加入到探針 1 的溶液中,隨著 GSH 的加入,最大吸收峰的波長不斷增加,直至加入50 μmol/L當(dāng)量的 GSH,最大吸收峰的波長不再增加.此時,最大吸收峰的波長發(fā)生了 47 nm的紅移.如圖 3b 所示,是與之相對應(yīng)的熒光滴定光譜,探針 1 對生物硫醇有較強的響應(yīng),隨著 GSH(50 μmol/L)的加入,在 514 nm 處的熒光強度不斷增加.與空白體系相比,飽和體系的熒光強度是空白體系的 56 倍.

    2.2 探針1對識別生物硫醇的選擇性研究

    圖4 探針1對生物硫醇的(a)紫外-可見吸收光譜選擇性實驗和(b)熒光光譜選擇性實驗

    2.3 探針1對生物硫醇檢出限的研究

    筆者根據(jù)探針 1 對 GSH 的熒光光譜數(shù)據(jù)分析計算得出檢出限.首先通過對探針1溶液(50 μmol/L)掃描 10 次,測定其在 514 nm 處的熒光強度,計算出標準偏差σ,然后通過探針1在不同濃度的 GSH 在 514 nm 處熒光強度與 GSH 濃度的做出工作曲線,其線性方程為Y=14.583 87c(GSH)+30.372 53,R2為 0.990 02,根據(jù)檢出限計算公式 3σ/k、經(jīng)過計算得出探針1對GSH的檢出限低達0.12 μmol/L,表明探針1對生物硫醇的檢測有較高的靈敏度(圖 5).

    2.4 探針1對生物硫醇的動力學(xué)研究

    筆者進行了探針1與生物硫醇的動力學(xué)研究,以GSH為例進行研究.如圖 6 所示,探針1(50 μmol/L)溶液中加入GSH(50 μmol/L)后,熒光強度明顯增加,直到 2 min 后不再增加. 結(jié)果表明,探針1能夠快速檢測生物硫醇.

    圖5 514 nm處熒光強度與不同濃度GSH的工作曲線

    圖6 探針1與GSH的反應(yīng)時間

    2.5 探針1的pH研究

    研究了 pH 對探針 1 識別生物硫醇的影響,選擇不同(3~12)pH 的PBS-DMF(體積比1∶1,10 mmol/L)作為緩沖條件,以GSH為例進一步展開.如圖7所示,探針1本身在pH處于3~10內(nèi),探針基本維持不變;而加入GSH后,pH在6~12內(nèi)熒光強度明顯增加. 結(jié)果表明,探針 1 對生物硫醇的響應(yīng)可以在較寬的范圍內(nèi)進行.

    圖7 pH對探針1識別 GSH 的影響

    3 總結(jié)

    成功合成一種色烯衍生物類的小分子熒光探針 1 用于生物硫醇的選擇性檢測.通過核磁對其結(jié)構(gòu)進行了表征,并且紫外可見光譜和熒光光譜實驗表明,該探針能夠?qū)崿F(xiàn)對生物硫醇的快速檢測(2 min),檢測限為 0.12 μmol/L. 因此,探針 1 可對細胞中的硫醇濃度進行檢測.

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