NLRP3炎癥小體在MS/EAE發(fā)病機制中的作用及其靶向治療*

楊一凡，劉立麗，聶作明，呂正兵，王 丹

(浙江理工大學(xué) 1浙江省家蠶生物反應(yīng)器與生物醫(yī)藥重點實驗室， 2生命科學(xué)與醫(yī)藥學(xué)院， 浙江 杭州 310018)

多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis，MS)是由免疫細胞攻擊中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)而造成的一種自身免疫性疾病，其具有神經(jīng)元脫髓鞘、神經(jīng)膠質(zhì)細胞增生和軸突損傷等病理特征[1]。NLRP3炎癥小體作為一種能識別病原體和危險信號的傳感器，近年來被發(fā)現(xiàn)與許多自身免疫性疾病的發(fā)病關(guān)系密切[2]。本文從NLRP3炎癥小體激活的主要途徑出發(fā)，綜述了NLRP3炎癥小體在MS及其動物模型——實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)發(fā)病中的作用以及靶向治療研究進展。

1 炎癥小體

1.1炎癥小體的結(jié)構(gòu) 炎癥小體是一種多蛋白復(fù)合體，典型的炎癥小體由模式識別受體(pattern-recognition receptors，PRRs)參與組裝，能夠識別胞質(zhì)中的病原微生物以及危險信號[3]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了5種主要PRR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)型受體家族，分別是位于細胞膜上的Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)和C型凝集素受體(C-type lectin receptors，CLRs)、位于胞內(nèi)的維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ樣受體[retinoic acid-inducible gene Ⅰ(RIG-Ⅰ)-like receptors，RLRs]、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體[nucleotide-binding oligomerization domain(NOD)-like receptors，NLRs]和DNA識別受體[4]，其中NLR家族的特點是中央為核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(nucleotide-binding and oligomerization domain， NACHT)，C-端通常為富含亮氨酸重復(fù)序列(leucine-rich repeats，LRRs)，N-端為含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶募集結(jié)構(gòu)域(caspase recruitment domain，CARD)和熱蛋白結(jié)構(gòu)域(pyrin domains，PYD)[2]，見圖1。在NLR炎癥小體復(fù)合體家族中，NLRP3炎癥小體的研究最為廣泛，它是控制白細胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-18成熟的關(guān)鍵信號分子。

Figure 1. The schematic diagram of NLRP3 inflammasome. The NLRP3 inflammasome is comprised of three proteins: NLRP3 scaffold, adapter protein ASC, and procaspase-1. The NLRP3 is characterized by the presence of a central NACHT domain, which is commonly flanked by C-terminal LRRs and N-terminal CARD or PYD domains.
圖1 NLRP3炎癥小體結(jié)構(gòu)示意圖

1.2NLRP3炎癥小體的激活信號 典型的NLRP3炎癥小體激活分為2步(圖2)，且在轉(zhuǎn)錄和翻譯后水平都受到嚴格調(diào)控。信號1為激活的啟動信號，由TLRs、NOD2、TNFR1或TNFR2激活NF-κB信號通路，而后上調(diào)NLRP3、pro-IL-1β和pro-IL-18的表達[5]。信號2為活化信號，當細胞受到由危險信號相關(guān)分子模式(danger-associated molecular patterns，DAMP)或病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)的信號刺激時，就會觸發(fā)NLRP3的自體寡聚化，并與接頭蛋白凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD, ASC)進行組裝，招募pro-caspase-1進而促發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)[2]。最近的研究發(fā)現(xiàn)高爾基體反面網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(trans-Golgi network，TGN)通過其膜上富集的帶負電磷脂酰肌醇四磷酸募集處于胞質(zhì)中的NLRP3，在其分散結(jié)構(gòu)dTGN上組裝成NLRP3炎癥小體[6]。同時，活化的caspase-1可作用于消皮素D(gasdermin D，GSDMD)，釋放其活化的N端，介導(dǎo)細胞焦亡[7]。

能激活NLRP3炎癥小體的PAMP信號有很多(圖2)，真菌、細菌、病毒和寄生蟲均有此功能，如肺炎支原體[8]、白色念珠菌[9]、霍亂弧菌[10]、丙型肝炎病毒[11]及曼氏血吸蟲[12]等都能激活NLRP3炎癥小體。識別DAMP信號同樣是NLRP3炎癥小體的重要生理作用，如胞外ATP就是一種廣泛存在的DAMP信號[13]。其它如尿酸鹽結(jié)晶[14]、β淀粉樣蛋白[15]，外源環(huán)境中的二氧化硅和鋁鹽[16]等也屬于能夠激活NLRP3炎癥小體的DAMP信號。

1.3NLRP3炎癥小體的激活機制 目前，普遍認為NLRP3炎癥小體的激活機制主要有以下3種：

1.3.1胞內(nèi)K+濃度的降低 K+的外流是NLRP3炎癥小體激活的特定上游條件，而Na+的流入則是非必需的[17]。當細胞受到細菌脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)刺激后，膜上的ATP通道Pannexin-1裂解，隨后ATP釋放，胞外ATP進而激活P2X7受體(P2X7 receptor, P2X7R)，同時胞外ADP激活P2Y1受體，導(dǎo)致胞內(nèi)K+濃度下降，同時，胞外K+濃度的升高以及ATP和P2X7R的結(jié)合反過來也會進一步刺激Pannexin-1通道開放[13]。

1.3.2線粒體釋放線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)、心磷脂和活性氧簇(reactive oxygen species，ROS) 線粒體受到PAMP和DAMP信號的刺激后，會釋放mtDNA、心磷脂和ROS[18]。mtDNA是一個有著大量CpG島的環(huán)形DNA，能被CpG DNA受體TLR9所感知，從而激活NF-κB信號通路，引起NLRP3炎癥小體激活[19]。在TRPM2通道介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流過程中，也會產(chǎn)生過量的ROS[20]。ROS是ATP刺激或顆粒物吞噬作用觸發(fā)NLRP3炎癥小體激活的關(guān)鍵，Li等[21]的研究發(fā)現(xiàn)ROS誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)通過誘導(dǎo)硫氧還蛋白互作蛋白(thioredoxin-interacting protein，TXNIP)而激活NLRP3炎癥小體。而且不同來源的ROS會以不同方式調(diào)節(jié)炎癥小體的激活。

Figure 2. Mechanisms of NLRP3 inflammasome activation. Both signal 1 and signal 2 are necessary for NLRP3 inflammasome activation. Signal 1 is activated by toll-like receptor (TLR) ligand, mediated by MyD88, caspase-8, FADD, and NF-κB, and leads to the upregulation of NLRP3 and pro-IL-1β. Signal 2 promotes the assembly of ASC and pro-caspase-1 and leads to activation of the NLRP3 inflammasome complex. A number of DAMP or PAMP, including K+efflux, pore-forming channels or toxins, Ca2+influx, ROS, mtDNA, have been proposed as the key mechanism of signal 2 activation. Once activated the NLRP3 inflammasome causes the activation of caspase-1 which cleaves the precursor proforms of IL-1β and IL-18 into their mature forms.
圖2 NLRP3炎癥小體激活機制

1.3.3溶酶體損傷導(dǎo)致組織蛋白酶B釋放 溶酶體損傷造成的NLRP3炎癥小體激活同樣是炎癥小體激活的主要方式之一，晶體或顆粒物等DAMP信號會誘導(dǎo)溶酶體破裂，導(dǎo)致蛋白水解酶等內(nèi)容物釋放到胞質(zhì)中[22]。其中組織蛋白酶B可以直接與NLRP3炎癥小體的PYD和NACHT結(jié)構(gòu)域相互作用以激活NLRP3[23]。

以上的機制多數(shù)情況下會同時發(fā)生，且并沒有一種單獨通用的機制來解釋炎癥小體的激活。

2 MS與EAE

一直以來，MS被認為是一種復(fù)雜且難以辨別的自身免疫性疾病，病變主要累及大腦半球白質(zhì)、小腦、腦干、脊髓和視神經(jīng)[1]，其發(fā)病普遍認為是由穿過血腦屏障(blood brain barrier，BBB)和血脊髓屏障(blood spinal cord barrier，BSCB)的CD4+T細胞所引起，免疫細胞會促進炎癥發(fā)生、神經(jīng)元脫髓鞘以及神經(jīng)膠質(zhì)增生和神經(jīng)元變性[24]。活化的CD4+T細胞存在不同的分化狀態(tài)，包括Th1、Th2、Th9、Th17、Th22和Treg細胞，所有這些CD4+T細胞亞群都參與了MS的發(fā)病，相關(guān)細胞因子IL-17A、IL-23、IL-6等也與MS的發(fā)病有著密切關(guān)系[25-26]。除此之外，Haider等[27]認為小膠質(zhì)細胞的活化、ROS的產(chǎn)生和氧化損傷也是驅(qū)動神經(jīng)元脫髓鞘和神經(jīng)退行性病變發(fā)生的關(guān)鍵。

EAE是常用的MS動物實驗?zāi)Ｐ?，?yīng)用該模型已開發(fā)了多種經(jīng)FDA批準的治療MS的藥物。EAE在發(fā)病特征等多方面都與MS相似，兩者均因BBB和BSCB受損，免疫細胞攻擊CNS，導(dǎo)致病變部位出現(xiàn)大量炎性浸潤物以及神經(jīng)元脫髓鞘、神經(jīng)膠質(zhì)細胞增生和軸突損傷等病理特征，但EAE也并非能完全模仿MS的發(fā)病，如在進行性MS患者大腦中普遍存在與灰質(zhì)和白質(zhì)彌漫性損傷有關(guān)的氧化損傷就在狨猴和小鼠的EAE中均未發(fā)生[28]。

3 NLRP3炎癥小體與MS和EAE

3.1NLRP3炎癥小體及其下游分子廣泛存在于MS和EAE中 因固有免疫系統(tǒng)最初執(zhí)行許多適應(yīng)性免疫的功能，因此，炎癥小體在MS和EAE中發(fā)揮著許多重要作用。MS患者的外周血單核細胞中caspase-1和IL-18的表達量均有所增加[29]。同樣，在EAE模型中，NLRP3、ASC、caspase-1、IL-18和IL-1β等多種NLRP3炎癥小體相關(guān)分子的表達也有所增加[30]。利用ASC-/-和caspase-1-/-小鼠建立EAE模型，結(jié)果顯示這些小鼠的發(fā)病情況同野生型小鼠相比均明顯減輕；同樣，由NLRP3-/-小鼠建立的EAE模型也表現(xiàn)出炎癥反應(yīng)減輕，髓鞘脫失情況下降的趨勢[31]，且已有研究證實NLRP3炎癥小體通過促進炎癥細胞向CNS遷移來控制疾病進展[32]。由此可見NLRP3炎癥小體在MS和EAE的發(fā)病中起著重要作用。

3.2EAE發(fā)病中影響NLRP3炎癥小體激活的細胞因子 在EAE發(fā)病中細胞因子會影響NLRP3炎癥小體的激活。由樹突狀細胞表達的胞外核苷酸酶CD39可以水解胞外ATP，使得胞外ATP造成的促炎癥環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)橄佘照T導(dǎo)的抗炎癥環(huán)境，從而抑制NLRP3炎癥小體的激活[33]。近期的一項研究顯示，阻斷CD47也能影響NLRP3在EAE中的激活，在CD47缺陷時會導(dǎo)致一氧化氮(nitric oxide，NO)增加，NO會抑制NLRP3依賴性IL-18的產(chǎn)生[34]。粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage-colony stimulating factor，GM-CSF)是炎癥小體的正向調(diào)節(jié)物，通過增強ASC和pro-IL-1β的表達來增加IL-1β的釋放，產(chǎn)生GM-CSF的B細胞亞群參與了MS的發(fā)病，并加劇了髓系炎癥反應(yīng)[35]。與GM-CSF對炎癥小體的正向調(diào)節(jié)不同的是，干擾素β(interferon β，IFN-β)會抑制NLRP3炎癥小體的激活，目前IFN-β已經(jīng)成為治療MS的一線藥物[36]。上述這些細胞因子都對NLRP3炎癥小體有重要的調(diào)控作用。

3.3IL-1β在MS和EAE中作用 在EAE的初始階段，抗原呈遞細胞誘導(dǎo)CD4+T分化為Th1和Th17，從而將固有免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)連接起來[37]。T細胞抗原受體激活pro-IL-1β表達，促使ASC從細胞核轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)，極化的Th17細胞表達IL-1受體(IL-1 receptor，IL-1R)，而后產(chǎn)生活化的IL-1β，值得注意的是，此時IL-1β是由ASC-NLRP3依賴性途徑中的caspase-8所激活[37]。IL-1β在MS和EAE的發(fā)病早期穿過BBB進入腦脊液(cerebro-spinal fluid，CSF)和CNS，并且能促進其它細胞因子和免疫細胞也穿過BBB[38]。微血管中的內(nèi)皮細胞通過對損傷刺激和細胞因子的反應(yīng)參與了神經(jīng)炎癥，受到刺激后內(nèi)皮細胞以IL-1R依賴途徑上調(diào)黏附分子的表達，使中性粒細胞黏附到內(nèi)皮細胞，并從血液遷移到CNS組織內(nèi)，而使用神經(jīng)調(diào)節(jié)素-1β可以減少中性粒細胞的黏附及IL-1β的影響[39]。在MS和EAE中IL-1β的來源并不相同，在小鼠的EAE模型中IL-1β是由浸潤病灶的單核巨噬細胞產(chǎn)生而并非小膠質(zhì)細胞；而在人和恒河猴的MS中，IL-1β似乎是由病變相關(guān)的小膠質(zhì)細胞釋放，而并非來自中性粒細胞或單核巨噬細胞[40-41]。并且MS患者CSF和血液中IL-1β的水平與疾病的易感性、病情進展和嚴重程度有關(guān)[42]，而IL-18也被認為與MS發(fā)病程度有關(guān)[43]。

4 針對NLRP3炎癥小體的治療方案

4.1使用IFN-β的治療方案 目前，F(xiàn)DA已批準十多種治療MS疾病的修飾類藥物，在5種一線藥物中，3種為IFN-β。IFN-β通過IL-10的自分泌作用減少pro-IL-1β產(chǎn)生[44]。此外，IFN-β還可作用于單核巨噬細胞的Ⅰ型干擾素受體，激活細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子 1(suppressor of cytokine signalling 1，SOCS1)，SOCS1抑制Rac1活化和ROS生成后，NLRP3炎癥小體的活性也隨之受到抑制[30]。研究顯示，MS患者接受IFN-β治療后，其單核巨噬細胞產(chǎn)生IL-1β的水平要遠低于健康人群，同時NLRP3在mRNA水平上也有下降[45]。然而也有研究表明IFN-β在MS和EAE治療的應(yīng)用中存在限制，即只有在NLRP3依賴性的MS或EAE中才能發(fā)揮治療效果[36]。

4.2針對NLRP3上游激活通路的阻斷劑 格列本脲是第1個被發(fā)現(xiàn)在體外具有抑制NLRP3激活作用的磺酰脲類藥物，它可抑制LPS和ATP誘導(dǎo)的caspase-1的激活和IL-1β的分泌[46]。JC-171作為一種羥基磺酰胺類似物，是一種特異性NLRP3炎癥小體抑制劑，具有預(yù)防和治療EAE的作用[47]。丙磺舒作為一種 Pannexin-1通道阻滯劑，普遍用于治療高尿酸血癥和痛風，但其同時可以降低大鼠星形膠質(zhì)細胞中NLRP3和caspase-1的表達[48]。青蒿素已被證實可以通過抑制NF-κB信號通路發(fā)揮抗炎作用，并且在動物模型中表現(xiàn)出對于NLRP3炎癥小體的抑制[49]。此外，β-羥丁酸通過阻止K+外流、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和ASC-NLRP3寡聚化來抑制NLRP3炎癥小體活化[50]。3，4-亞甲二氧基-β-硝基苯乙烯是一種新型酪氨酸激酶抑制劑，能特異性阻止NLRP3和ASC的寡聚化，但不能阻斷NLRP3激動劑誘導(dǎo)的K+外流[51]。

4.3以NLRP3下游效應(yīng)分子為靶點的治療 α1抗胰蛋白酶可以通過選擇性阻斷NLRP3以減少IL-1β表達[52]。Coll等[53]使用二芳基磺酰脲類化合物MCC950同樣抑制了IL-1β表達，減輕了EAE的發(fā)病程度，降低了EAE模型鼠的死亡率。Mckenzie等[54]的實驗證明用小分子藥物VX-765可以抑制caspase-1，使得CNS中炎癥小體和細胞焦亡相關(guān)蛋白表達減少，軸突損傷減輕，神經(jīng)功能有所改善，其作用原理是通過轉(zhuǎn)染GSDMD的siRNA抑制GSDMD的表達，進而抑制小膠質(zhì)細胞焦亡。此外，還可以通過骨髓源神經(jīng)干細胞[55]和牙周膜干細胞分泌物[56]設(shè)計針對EAE的治療方案。

5 小結(jié)

盡管EAE和MS并不是完全相同的疾病，但是通過對EAE的研究，依然可以為MS的治療提供一些借鑒；而且EAE模型的建立直觀地展現(xiàn)了NLRP3炎癥小體在自身免疫性神經(jīng)炎癥中的作用。雖然NLRP3炎癥小體在MS和EAE發(fā)病中的作用已被逐步認識，但是還有許多問題亟待解決：是否還有別的NLRP3炎癥小體激活物？是否有一個共同的機制來激活NLRP3炎癥小體？在不同的病灶部位NLRP3炎癥小體是如何參與發(fā)病的？能否針對NLRP3炎癥小體的自身組份(如ASC等)而不僅是針對其下游細胞因子(如IL-1β)設(shè)計治療方案？隨著我們對NLRP3炎癥小體認識的不斷深入，必將對MS和其它同類的炎性自身免疫性疾病的治療提供更有效的策略。