不同COPD 動(dòng)物模型特點(diǎn)及應(yīng)用的研究進(jìn)展

陳美鳳,加慧,夏書(shū)月

(沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院,沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院,呼吸與危重癥醫(yī)學(xué),沈陽(yáng) 110020)

慢性阻塞性肺疾病( chronic obstructive pulmonary disease,COPD)以不完全可逆的持續(xù)性進(jìn)行性氣流受限為特點(diǎn),是呼吸系統(tǒng)最常見(jiàn)慢性疾病,主要表現(xiàn)為氣道慢性炎癥,氣道阻塞、結(jié)構(gòu)重塑,肺泡結(jié)構(gòu)改變和相關(guān)并發(fā)癥[1]。 據(jù)國(guó)際慢阻肺疾病(the Burden of Obstructive Lung Diseases,BOLD)等研究顯示,預(yù)計(jì)到2020 年,慢阻肺將成為全球第三大死因[2]。 據(jù)報(bào)道,我國(guó)40 歲以上慢阻肺患病率為9.9%,患病人數(shù)高達(dá)1 億,整體疾病負(fù)擔(dān)位列急慢性疾病第3 位[3]。 建立標(biāo)準(zhǔn)化且切合臨床COPD 特征的動(dòng)物模型對(duì)探究其發(fā)生發(fā)展、病理生理、形態(tài)功能學(xué)改變及新的治療途徑具有重大意義。 近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了許多相關(guān)研究,但目前尚缺乏最佳模型的COPD 動(dòng)物模式構(gòu)建方法。 在本文中,對(duì)用于建立COPD 模型的動(dòng)物類(lèi)型及各模型優(yōu)缺點(diǎn)做了詳細(xì)比較并闡述了其應(yīng)用。

1 動(dòng)物品種的選擇

目前建立COPD 動(dòng)物模型常用的動(dòng)物包括小鼠、大鼠、豚鼠、小型豬、兔子、犬、非靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物等,其中應(yīng)用最為廣泛的為鼠類(lèi)。

1.1 小鼠和大鼠

鼠類(lèi)品種豐富,體形較小,繁殖周期短,飼養(yǎng)及藥物使用成本較低,可操作性較強(qiáng)。 由于目前對(duì)鼠的基因組研究比較明確,多用于研究特定基因和蛋白質(zhì)在COPD 病理生理學(xué)中的作用[4];同時(shí),鼠存在多種酶與抗體,可用于鑒定抗原、細(xì)胞流式實(shí)驗(yàn)并直接定位和測(cè)量[5]。 但小鼠氣管內(nèi)纖毛分布較少,其氣管黏膜下腺體不發(fā)達(dá)且無(wú)杯狀細(xì)胞;單足氣道分叉與人類(lèi)的氣道解剖結(jié)構(gòu)不同,并且缺乏有呼吸功能的細(xì)支氣管;氣道較小,若進(jìn)行肺泡灌洗難度較大;同時(shí)鼠屬于專(zhuān)性鼻呼吸的動(dòng)物,鼻纖毛對(duì)煙的濾過(guò)功能較低[6],這與人類(lèi)上呼吸道不同。 研究顯示鼠對(duì)外源性刺激敏感差異性[7],對(duì)COPD 癥狀的發(fā)展也具有一定的抵抗力,只能復(fù)制早期COPD 癥狀,復(fù)制嚴(yán)重的 COPD 模型十分困難。

1.2 豚鼠

豚鼠的肺部解剖結(jié)構(gòu)類(lèi)似于人類(lèi)二分叉細(xì)支氣管結(jié)構(gòu),可最大化減少吸入肺內(nèi)的顆粒形成差異性分布[8]。 與小鼠相比,豚鼠的氣管上皮排列更均勻,并且大氣道中含粘液腺和杯狀細(xì)胞,被廣泛應(yīng)用于呼吸系統(tǒng)疾病領(lǐng)域的研究。 Ramírez-Ramírez等[9]發(fā)現(xiàn)豚鼠炎癥反應(yīng)與人類(lèi)相似,可建立呈進(jìn)行性發(fā)展的肺氣腫模型[10],符合臨床COPD 發(fā)展特點(diǎn)。 該模型的主要缺點(diǎn)為豚鼠的大部分肺損傷反應(yīng)為軸突反射,但軸突反射在人類(lèi)肺損傷中作用并不明顯[11]。 豚鼠價(jià)格較小鼠及大鼠相對(duì)昂貴,目前用于豚鼠的細(xì)胞因子和免疫標(biāo)記物也較少;同時(shí)豚鼠缺乏尾巴,皮膚厚實(shí),使血樣的采集和給藥具有一定的難度。

1.3 中型動(dòng)物—小型豬,兔子,犬,羊

豬的肺組織比大鼠等動(dòng)物更發(fā)達(dá),肺部結(jié)構(gòu)與人類(lèi)相似度較高,為左側(cè)兩葉、右側(cè)三葉[12];具有呼吸性細(xì)支氣管,可形成小氣道阻力升高COPD 動(dòng)物模型;豬呼吸道黏膜下腺體較發(fā)達(dá),誘導(dǎo)COPD 發(fā)病模型相對(duì)容易[13]。 兔子從解剖學(xué)、生理學(xué)、遺傳學(xué)和生物學(xué)的相似性看,在系統(tǒng)發(fā)育上比其他嚙齒類(lèi)動(dòng)物更接近人類(lèi)[14],但它們?cè)诜菬o(wú)菌過(guò)程中易感染細(xì)菌和病毒,建造模型過(guò)程中易發(fā)生死亡。 實(shí)驗(yàn)性犬的呼吸道較大,可將致病試劑或治療藥物有針對(duì)性地傳遞到肺部,并可將另一肺部作為對(duì)照;嘴較寬,可進(jìn)行肺輸送系統(tǒng)研究;肺泡數(shù)量多且存在咳嗽反射,符合COPD 的生理癥狀[15]。 羊十分溫順且氣道結(jié)構(gòu)為二分支,研究發(fā)現(xiàn)煙霧暴露后產(chǎn)生的粘液和上皮細(xì)胞分布類(lèi)似于人的氣道炎癥反應(yīng)[16]。

中型動(dòng)物體形較大,抗應(yīng)激能力較強(qiáng);但兔子、犬的氣道均為單足分支,粘液成分與人類(lèi)不同。 同時(shí)飼養(yǎng)成本較高,物種具有特異性及一定危險(xiǎn)性,市售可用試劑和測(cè)量手段也有限,這為造模增加了一定難度且實(shí)驗(yàn)成本較高。

1.4 非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(nonhuman primate,NHP)

非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物在解剖學(xué),生理學(xué),遺傳學(xué)和生物學(xué)角度最接近人類(lèi),其中猴常被用作研究動(dòng)物,尤其是恒河猴(Macaca mulatta)具有與人類(lèi)極其相似的肺部結(jié)構(gòu),細(xì)支氣管為二分支,肺泡分布廣泛[17],纖毛,杯狀細(xì)胞和基底細(xì)胞排列方式與人類(lèi)氣道類(lèi)似。 其基因組與人類(lèi)高度相似,可增加物種之間的關(guān)聯(lián)性和可比性[18],用作COPD 患者發(fā)生氣道疾病的模型并可以進(jìn)行縱斷面采樣,這對(duì)于評(píng)估COPD 的新型生物標(biāo)志物或療法可能有用。 但靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物模型需要專(zhuān)門(mén)的設(shè)備和技術(shù)來(lái)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行麻醉和操作,對(duì)成本和倫理要求較高。

2 COPD 體外模型的建立

COPD 體外模型可在受控環(huán)境中研究特定的生理病理過(guò)程[19]。 COPD 涉及多個(gè)系統(tǒng),要了解疾病的發(fā)生發(fā)展,需研究各系統(tǒng)的細(xì)胞,以更準(zhǔn)確地模擬個(gè)體體內(nèi)環(huán)境。 目前常用的體外模型有保留肺結(jié)構(gòu)和組織特性的離體肺切片[20],允許細(xì)胞外基質(zhì)和組織因子參與的灌注模型[21],三維(3D)類(lèi)器官模型及涉及未分化的支氣管上皮細(xì)胞模型[22-23]。但使用體外培養(yǎng)細(xì)胞需要注意細(xì)胞從炎性細(xì)胞外基質(zhì)和環(huán)境中移出是可能會(huì)發(fā)生一些改變從而影響研究結(jié)果,導(dǎo)致臨床應(yīng)用價(jià)值欠佳。 盡管體外/離體方法提供了許多優(yōu)勢(shì),但由于人體組織/細(xì)胞的變化,有限的可用性及實(shí)驗(yàn)室間的差異,使可重復(fù)性受到限制。 但隨著3D 打印技術(shù)的不斷發(fā)展和對(duì)干細(xì)胞生物學(xué)的深入研究,建立標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)室人體組織的前景可觀。

3 COPD 動(dòng)物模型的建立

COPD 的病因、發(fā)病機(jī)制及病理改變復(fù)雜,用于研究COPD 的動(dòng)物模型應(yīng)符合人類(lèi)COPD 誘導(dǎo)刺激的一系列相似的解剖和生理病理反應(yīng),從分子,細(xì)胞,器官和個(gè)體等多個(gè)層面展開(kāi),在建模中選擇符合致病因素的誘導(dǎo)條件建立COPD 模型。

3.1 單因素誘導(dǎo)

3.1.1 吸入有害氣體/細(xì)顆粒物

目前常用的有害氣體/細(xì)顆粒物為煙霧,PM2.5,二氧化硫,二氧化氮,臭氧等。 由于吸煙和空氣污染為COPD 發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素[1],所以煙霧暴露(CS)和PM2.5 在建模中較常使用。 吸入有害氣體及細(xì)顆粒物的效應(yīng)隨暴露時(shí)間的長(zhǎng)短,頻率,次數(shù),暴露類(lèi)型(局部煙熏,全身暴露,腹腔注射)和煙霧產(chǎn)生方式(吹氣或吸氣行為產(chǎn)生的主流煙霧,卷煙燃燒產(chǎn)生的側(cè)流煙霧)的不同而差異較大[24],Fr?hlich 等[25]發(fā)現(xiàn)全身或經(jīng)鼻系統(tǒng)的煙霧暴露方法的差異為誘導(dǎo)COPD 表型變異的潛在來(lái)源。Zhao 等[26]將 C57BL/6 J 小鼠暴露于 PM2.5 48 周后出現(xiàn)肺功能下降,氣腫性病變和氣道炎癥,造模成功。 同時(shí)種間差異影響CS 暴露后肺氣腫表型的發(fā)育時(shí)間,一般單純煙霧暴露 2 個(gè)月即出現(xiàn)早期COPD 肺部改變,6 個(gè)月出現(xiàn)典型的 COPD 肺部表現(xiàn)[27]。 需要注意的是某些物種(例如鼠)對(duì)CS 誘導(dǎo)的嗜中性炎癥和肺損害具一定的抵抗力,這種抵抗在中斷CS 暴露后就會(huì)停止甚至恢復(fù)[28]。 因此,單純CS 暴露的小鼠模型無(wú)法符合臨床COPD 的復(fù)雜性及嚴(yán)重性特點(diǎn),適用于研究早期COPD 疾病特征,需將結(jié)合多個(gè)不同的模型進(jìn)行對(duì)比分析。

3.1.2 氣道滴注彈性蛋白酶

目前常用的蛋白酶包括豬胰蛋白酶,木瓜彈性蛋白酶,人嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶,基質(zhì)金屬蛋白酶。 彈性蛋白酶可誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生肺氣腫,該模型的優(yōu)點(diǎn)在于經(jīng)氣管內(nèi)滴注可免受血液中彈性蛋白酶抑制因子的滅活,單劑量彈性蛋白酶即可導(dǎo)致肺泡壁結(jié)構(gòu)短期喪失并可誘導(dǎo)并維持炎癥反應(yīng)的發(fā)生[29]。 但彈性蛋白酶的給藥窗口狹窄,低于推薦劑量濃度不足以引起肺部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,而高于閾值水平的濃度會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物嚴(yán)重肺出血和死亡,研究表明彈性蛋白酶誘導(dǎo)嚙齒類(lèi)動(dòng)物出現(xiàn)COPD 病理改變需21 ～45 d[30],Longhini 等[31]制備了使用抗彈性蛋白自身免疫性鼠模型引起的肺氣腫,可用于檢查免疫耐受在COPD 中的作用,增加基于彈性蛋白酶模型的臨床相關(guān)性。 彈性蛋白酶不但破壞肺泡間隔的彈性纖維,同時(shí)也引起氣管壁及血管壁等組織的破壞,這與人類(lèi)COPD 肺氣腫的病理表現(xiàn)接近。

3.1.3 氣管內(nèi)注入脂多糖

脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁成分,存在于空氣污染和有機(jī)粉塵中。 LPS 暴露會(huì)引起嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞大量聚集,導(dǎo)致肺部炎癥的發(fā)生,長(zhǎng)期暴露會(huì)引起肺部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,這種變化在LPS 接觸停止后仍會(huì)持續(xù)。 研究表明LPS 鼻內(nèi)滴注的最佳時(shí)間為72 h,28 d 即可形成COPD 模型[32]。 脂多糖動(dòng)物模型存在肺功能下降、肺氣腫、小氣道重塑、肺部炎癥等現(xiàn)象[33]。 De Oliveira 等[34]利用LPS 成功制備了急性肺氣腫加重模型以進(jìn)行COPD 急性加重期相關(guān)研究。 與其他模型相比,使用LPS 誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥和纖維化模型以實(shí)現(xiàn)COPD的病理學(xué)特征所需時(shí)間相對(duì)較短且與人類(lèi)COPD 的臨床特點(diǎn)接近。

3.1.4 細(xì)菌/病毒感染

感染是發(fā)生COPD 急性加重最重要的誘因,可導(dǎo)致病情進(jìn)展及病死率增加。 目前常用的細(xì)菌/病毒有銅綠假單胞菌,肺炎克雷伯桿菌,流感嗜血桿菌,肺炎鏈球菌,大腸桿菌,流感病毒,鼻病毒,人免疫缺陷病毒(HIV)等。 此模型適用于研究細(xì)菌感染導(dǎo)致肺組織損傷的機(jī)理,但實(shí)踐中要注意選取細(xì)菌的種類(lèi)及控制細(xì)菌的數(shù)量。 單純應(yīng)用細(xì)菌/病毒建立COPD 模型的情況較少,多與其他因素聯(lián)合使用建立AECOPD 動(dòng)物模型[35-36]。

3.1.5 基因控制模型

COPD 具有遺傳和環(huán)境易感性,遺傳性α1-抗胰蛋白酶缺乏(AATD)盡管只占很小一部分,卻很好的解釋了遺傳與環(huán)境的相互作用致使個(gè)體傾向于發(fā)生 COPD[37],不過(guò)尚不明確這些基因究竟是COPD 發(fā)病的基因或僅僅是致病基因的標(biāo)記。 目前基因調(diào)控模型主要包括自然變異的COPD 模型,如緊皮、蒼白、斑點(diǎn)型小鼠[38]。 轉(zhuǎn)基因 COPD 模型如將刪除肺上皮神經(jīng)纖毛蛋白1(Nrp1)的基因缺失小鼠暴露于煙霧中12 周制備的 Nrp1 基因缺失型COPD 動(dòng)物模型,發(fā)現(xiàn)上皮Nrp1 在維持正常肺泡結(jié)構(gòu)中的作用,可用于研究 Nrp1 表達(dá)失調(diào)在慢阻肺發(fā)展中的機(jī)制[39];與成年吸煙者COPD 風(fēng)險(xiǎn)及肺功能下降相關(guān)的基因編碼金屬蛋白酶 12(MMP12)[40]。 Nakashima 等[41]通過(guò)誘導(dǎo)氣道上皮Na+通道 b 亞基(bENaC-Tg 老鼠)建立了 COPD 大鼠模型,以探索C57BL/6 J 基因型小鼠與bENaC-Tg小鼠表現(xiàn)出的彌漫型肺氣腫模型穩(wěn)定表達(dá)炎性和衰老樣標(biāo)記物的差別。

現(xiàn)已制備的COPD 模型包括α1-抗胰蛋白酶、TGF-β、人趨化因子受體6、Klotho 基因、胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)突變和肺表面活性物質(zhì)D 等敲除鼠。 COPD 基因改造模型獲得的動(dòng)物模型具有遺傳穩(wěn)定性和重復(fù)性,允許從細(xì)胞分子易感性水平上來(lái)分析特定性的調(diào)控作用及其功能,對(duì)于COPD 的預(yù)防和治療提供重要的工具,但其不能產(chǎn)生人類(lèi)COPD 的幾種特定表現(xiàn),因而限制了其轉(zhuǎn)化應(yīng)用價(jià)值。

3.1.6 植入他莫西芬

一直以來(lái),國(guó)內(nèi)外關(guān)于性別與COPD 易感性及急性加重是否相關(guān)存在很大爭(zhēng)議。 相關(guān)研究表明：與吸煙男性相比,40 ～50 歲女性吸煙者的肺功能下降快于男性吸煙者, 并且 COPD 風(fēng)險(xiǎn)增加了50%[42-43]。 Tam 等[44]將雄性,雌性和卵巢切除的C57BL/6 小鼠先煙霧暴露6 個(gè)月,然后給雌性小鼠植入他莫昔芬,暴露2 周后進(jìn)行第二次干預(yù),每只小鼠再次植入75 mg 他莫昔芬顆粒繼續(xù)暴露4 周后成功制備雌激素缺乏的COPD 模型,證明了雌激素可能參與了煙霧暴露雌性小鼠中獨(dú)特的氧化劑/TGF-β 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)軸失調(diào)。 為尋找雌激素信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游的治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),用于探索女性COPD 的干預(yù)治療提供了新的理論指導(dǎo)。

3.1.7 免疫相關(guān)型模型

吸煙一直被認(rèn)為是發(fā)生COPD 最重要的危險(xiǎn)因素,但戒煙2 年后氣道炎癥仍在持續(xù),該現(xiàn)象與自身免疫性疾病的特征相似。 相關(guān)研究表明CS 暴露可顯著降低患者SP-D 的肺泡水平,尼古丁可導(dǎo)致人氣道上皮細(xì)胞中 SP-D 水平降低[45]。 Sorensen等[46]通過(guò)誘導(dǎo)上皮Na+通道b 亞基的氣道特異性過(guò)表達(dá)的小鼠(bENaC-Tg 小鼠)3 周建立了SP-D 基因敲除的COPD 小鼠,為研究肺部炎癥和先天免疫以及進(jìn)行肺表面活性物質(zhì)穩(wěn)態(tài)研究提供了建?；A(chǔ)。 Hirota 等[47]研究了由氣道上皮NLRP3 炎性小體介導(dǎo)的PM10 暴露的先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)模型,證明了肺NLRP3 炎性體在介導(dǎo)PM10 暴露相關(guān)的先天性而非適應(yīng)性免疫反應(yīng)中的重要性,用于研究PM10 暴露加劇氣道疾病的機(jī)制。

3.2 復(fù)合因素

單一造模方法難以模擬出符合臨床的COPD模型,并且耗時(shí)較長(zhǎng)。 為了盡可能全面真實(shí)地模擬COPD 的發(fā)病過(guò)程及病理特點(diǎn),多數(shù)研究者傾向于采用復(fù)合因素構(gòu)建COPD 動(dòng)物模型。 近年來(lái)常用的復(fù)合因素造模方式包括：煙霧+LPS,煙霧+細(xì)菌/病毒感染,煙霧+PM2. 5,煙霧+彈性蛋白酶,彈性蛋白酶+脂多糖,氯化鈣+山黎豆類(lèi)制等聯(lián)合方式。

舒家澤等[48]通過(guò)煙草煙霧口鼻暴露聯(lián)合脂多糖的方法成功建立慢性阻塞性肺疾病及相關(guān)肺動(dòng)脈高壓(COPD.PH)的小鼠模型,可用于研究減輕肺動(dòng)脈高壓的治療策略,并提示4 周即可形成COPD大鼠模型。 Shu 等[49]利用機(jī)動(dòng)車(chē)尾氣(MVE)和氣管內(nèi)滴注脂多糖(LPS)13 周成功建立了COPD 動(dòng)物模型,并出現(xiàn)了心室和血管病理變化。 Mebratu等[50]將大鼠暴露于CS2 個(gè)月后感染甲型流感病毒(IAV)/呼吸道合胞病毒(RSV)/病毒衍生物肌苷-聚胞苷酸[poly(I：C)]以及聯(lián)合銅綠假單胞菌+肺炎鏈球菌及流感嗜血桿菌建立了COPD 細(xì)菌/病毒感染模型[51],表明CS 引起的炎癥反應(yīng)和氣腫改變的程度取決于病毒感染的類(lèi)型。 這些動(dòng)物模型可能有助于研究不同病毒加劇CS 誘導(dǎo)的炎癥和肺氣腫的機(jī)制。 Wang 等[52]將 C57BL/6 基因型小鼠聯(lián)合暴露于PM2.5 和CS/CSE40 周成功制備 COPD模型,提出在 COPD 的背景下,PM2.5 可加劇 CS/CSE 誘導(dǎo)的炎癥。 Geraghty 等[53]使用 EcoHIV 的野生型小鼠2 個(gè)月誘導(dǎo)建立了COPD 模型,再現(xiàn)了人類(lèi)HIV 相關(guān)COPD 的幾種病理生理特征,可用于確定HIV 相關(guān)COPD 的關(guān)鍵參數(shù)并測(cè)試該疾病的未來(lái)療法。 陳敏等[54]通過(guò)煙熏+間歇低氧8 周成功構(gòu)建大鼠COPD-OSAHS 重疊綜合征模型,為開(kāi)展OS基礎(chǔ)研究提供了參考。

復(fù)合因素建立的COPD 模型,可從多方面探究疾病的發(fā)生發(fā)展及病理生理過(guò)程,使建立COPD 合并癥模型成為可能。 需要注意的是復(fù)合因素建模對(duì)動(dòng)物的耐受性要求較高,在選擇造模動(dòng)物時(shí)需全面考慮。

4 COPD 模型的評(píng)估

目前用于判斷COPD 模型是否造模成功的評(píng)估內(nèi)容主要包括：動(dòng)物行為學(xué)改變[55],如觀察皮毛光澤度、活動(dòng)情況、反應(yīng)靈敏度、精神狀況、進(jìn)食進(jìn)水量、呼吸狀況、體重變化、死亡情況、呼吸道變化等,由于影響因素較多,缺乏統(tǒng)一的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),評(píng)估時(shí)多與其他方法聯(lián)合使用。 測(cè)定肺功能(有創(chuàng)和無(wú)創(chuàng)測(cè)定法),其中無(wú)創(chuàng)體描測(cè)定可在生理狀態(tài)下觀察藥物等治療方法對(duì)肺功能的影響,脈沖振蕩技術(shù)可通過(guò)測(cè)定呼吸道阻力、黏性阻力,彈性阻力,慣性阻力等參數(shù)分析出是否存在氣道阻塞、部位及程度;同時(shí)還有肺動(dòng)脈儀量化氣道內(nèi)壓、肺阻力、肺順應(yīng)性等。 肺功能測(cè)定對(duì)于確定疾病模型是否出現(xiàn)氣流受限具有重要意義,且操作方便,可重復(fù)性良好,在COPD 模型的評(píng)價(jià)中應(yīng)用前景廣闊[56]。 肺部切片病理學(xué)改變可確定氣道及肺

實(shí)質(zhì)的病理變化是否符合 COPD 的典型改變[57],包括：中央氣道黏液腺增大,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);外周氣道損傷,膠原蛋白沉積及修復(fù);纖毛倒伏、變短、粘連,脫落;氣道平滑肌增厚;肺泡擴(kuò)張,肺泡壁變薄,肺大泡形成,肺泡數(shù)目顯著減少等,此方法簡(jiǎn)便、直觀、易操作,在哮喘、COPD、肺纖維化等多種肺部疾病的研究中具有重要參考意義,能夠客觀地反映病理特征及嚴(yán)重程度,應(yīng)用較多。 肺泡灌洗液分析白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞,血清IgE,BLAF 的總細(xì)胞濃度計(jì)數(shù)與分類(lèi)計(jì)數(shù)是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中常用的觀察指標(biāo)之一且準(zhǔn)確性高;免疫組化檢測(cè)呼吸道中的細(xì)胞因子(IL-8,TNF-α,IFN-γ 和 TGF-β)和趨化因子(CCL-2,CXCL1,CXCL9,CXCL10 和 CXCL11[58]等,標(biāo)本易獲取,可操作性強(qiáng),應(yīng)用廣泛。 Marcos 等[59]提出了平均線(xiàn)性截距和等效直徑以量化組織學(xué)切片中的氣腫性病變相關(guān)的區(qū)域,使用貝葉斯方法得出新型氣腫嚴(yán)重程度指數(shù)(SI)及X 射線(xiàn)顯微斷層掃描(micro-CT)評(píng)估肺氣腫等,兩種方法均可實(shí)現(xiàn)對(duì)肺氣腫的范圍及分布進(jìn)行定量分析,并可在肺功能正常的早期階段發(fā)現(xiàn)肺氣腫,有助于COPD 早期診斷與治療。 Micro-CT 分辨率達(dá)到微米級(jí)別,可無(wú)創(chuàng)、清晰的觀測(cè)樣本內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu),對(duì)肺部改變非常靈敏,可用于無(wú)創(chuàng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)肺部病理變化,展示疾病動(dòng)態(tài)過(guò)程[60]。

5 結(jié)語(yǔ)

COPD 發(fā)病率、致死率高,診斷率低并呈慢性遷延,其病因、發(fā)病機(jī)制及病理改變復(fù)雜,所以在設(shè)計(jì)模型時(shí)應(yīng)充分考慮動(dòng)物品種及各誘導(dǎo)因素的優(yōu)缺點(diǎn),最大化符合臨床,優(yōu)化從分子水平、藥物化學(xué)評(píng)估、體外測(cè)試、預(yù)測(cè)性動(dòng)物模型到最終人類(lèi)臨床試驗(yàn)的級(jí)聯(lián)測(cè)試,選擇最適用于研究目的的造模方法。

臨床實(shí)際中COPD 的發(fā)生發(fā)展及形態(tài)功能學(xué)改變復(fù)雜,常伴隨急性加重及合并癥,單一的造模方法難以模擬出符合臨床實(shí)際的COPD 模型且耗時(shí)較長(zhǎng),目前多傾向于采用復(fù)合因素構(gòu)建COPD 動(dòng)物模型,針對(duì)不同的研究目的,采用2 ～3 個(gè)誘導(dǎo)因素進(jìn)行造模,縮短造模時(shí)間,深入研究COPD 及其合并癥的相關(guān)問(wèn)題。 一直以來(lái),小鼠和大鼠因其造模價(jià)格相對(duì)便宜、飼養(yǎng)方便、品種豐富等各方面優(yōu)點(diǎn),是多數(shù)研究者造模的優(yōu)先選擇,但同時(shí)也須考慮物種之間的關(guān)聯(lián)性及可比性,使實(shí)驗(yàn)結(jié)果的臨床推廣性更佳,越來(lái)越多的學(xué)者選擇中型動(dòng)物及非靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物作為造模對(duì)象。 因造模動(dòng)物、誘導(dǎo)因素、誘導(dǎo)劑量及方式等不同,造模所需時(shí)間也有所差別,評(píng)估造模是否成功需根據(jù)造模目的,結(jié)合功能學(xué)、結(jié)構(gòu)學(xué)及肺組織中細(xì)胞數(shù)目計(jì)數(shù)等方法綜合評(píng)估,在模型評(píng)估中盡量采用評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)明確,主觀性小的評(píng)估方法,保證評(píng)估結(jié)果的準(zhǔn)確性及可重復(fù)性。

目前COPD 動(dòng)物模型的主要限制一方面體現(xiàn)在不能再現(xiàn)患者在臨床環(huán)境中實(shí)際發(fā)生的情況及相關(guān)合并癥,單一的COPD 模型沒(méi)有COPD 疾病特征的廣度,特別是疾病后期。 隨著對(duì)COPD 動(dòng)物模型研究的不斷深入,越來(lái)越多貼近臨床實(shí)際的COPD模型被建立及完善,并應(yīng)用于研究其發(fā)病機(jī)制及新的治療途徑和靶點(diǎn)。

建模另一個(gè)關(guān)鍵是急性加重,盡管感染(尤其是病毒感染)是病情加重最常見(jiàn)的病因,但各患者之間具有COPD 易感性,發(fā)作頻率,肺功能下降速度不同等個(gè)體差異性,這種情況下使用動(dòng)物模型研究COPD 加重的特殊性進(jìn)行分析面臨諸多問(wèn)題。 在臨床研究中,識(shí)別出易急性加重的COPD 患者,闡明并鑒定COPD 特定臨床表型相關(guān)性和患者病情加重的潛在機(jī)制是COPD 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中的重要部分。 然而,由于COPD 病程呈慢性遷延,急性加重后疾病的預(yù)后也有差異,但在動(dòng)物模型中我們通常使用橫斷面研究,終點(diǎn)事件出現(xiàn)后一般不再進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間跟蹤觀察,這對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的結(jié)果應(yīng)用于人類(lèi)面臨很多不確定性,動(dòng)物模型的評(píng)估效用也面臨挑戰(zhàn)。