單細(xì)胞測序技術(shù)在惡性腫瘤研究中的應(yīng)用進(jìn)展*

劉慧萍 崔恒 昌曉紅

隨著中國人口的增長和社會老齡化，惡性腫瘤已成為嚴(yán)重威脅人群健康、影響人類生存質(zhì)量的主要疾病之一。2019年1月國家癌癥中心發(fā)布的中國最新癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)報(bào)告中指出，近十幾年中國惡性腫瘤的發(fā)病和死亡均呈上升態(tài)勢，5年生存率雖呈上升趨勢，但與發(fā)達(dá)國家相比仍存在較大差距[1]。因此，探索惡性腫瘤發(fā)病規(guī)律、提高生存率仍然是亟待解決的問題。近年來，單細(xì)胞測序技術(shù)作為一種新興的測序技術(shù)可在單個(gè)細(xì)胞的不同組學(xué)水平上對惡性腫瘤異質(zhì)性、腫瘤演變以及臨床診治等多個(gè)方面進(jìn)行深入地研究[2]，為惡性腫瘤的研究提供了一個(gè)全新的視角。

1 單細(xì)胞測序技術(shù)概述

1.1 單細(xì)胞測序技術(shù)流程

單細(xì)胞測序技術(shù)是通過將組織或體液中的細(xì)胞群分離成單個(gè)細(xì)胞并對其遺傳物質(zhì)進(jìn)行高通量測序分析的技術(shù)手段，主要流程為單細(xì)胞的分離提取、核酸擴(kuò)增和測序并數(shù)據(jù)分析[3]。與傳統(tǒng)測序技術(shù)不同，單細(xì)胞的獲取是該技術(shù)的關(guān)鍵，也是后續(xù)步驟的基礎(chǔ)。目前，常用的單細(xì)胞分離方法主要有：單細(xì)胞顯微操作、流式細(xì)胞儀分選、激光捕獲顯微切割（laser capture microdissection，LCM）和微流控芯片技術(shù)等[4]。其中，單細(xì)胞顯微操作對設(shè)備要求低但獲取細(xì)胞量少、易損傷細(xì)胞，難以廣泛應(yīng)用；流式分選技術(shù)通過熒光標(biāo)記獲取細(xì)胞，簡便快捷，但液流和標(biāo)記會對細(xì)胞造成一定損傷；LCM可以直接從組織切片中分離出靶細(xì)胞，操作方便，但可能會損傷細(xì)胞；而微流控技術(shù)是僅需要少量液滴就可達(dá)到較高的細(xì)胞分離效率，但對設(shè)備要求較高。不同分離方法優(yōu)缺點(diǎn)各異，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行靶細(xì)胞的分離。成功獲取單個(gè)靶細(xì)胞后，進(jìn)行核酸提取、擴(kuò)增、構(gòu)建文庫等操作，然后再利用不同測序方法獲取基因組、轉(zhuǎn)錄組等數(shù)據(jù)。后續(xù)應(yīng)用各種算法對上述數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選、處理、計(jì)算和模擬就可獲得單個(gè)細(xì)胞的生物學(xué)信息。

1.2 單細(xì)胞測序技術(shù)的發(fā)展

近年來，單細(xì)胞測序技術(shù)得到了快速發(fā)展和成熟，已在基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和表觀遺傳等多個(gè)組學(xué)水平完成測序。目前，基因組測序技術(shù)有全基因組測序、全外顯子測序等；轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)主要有Smart-seq[5]、Smart-seq2[6]、10×Genomics[7]等；蛋白質(zhì)組學(xué)主要有SCoPE-MS[8]等；表觀遺傳學(xué)測序技術(shù)有ATAC-seq[9]等；多組學(xué)測序技術(shù)有G&T-seq[10]、REAP-seq[11]、scTrio-seq[12]等。其中，Smart-seq 技術(shù)是2012年美國和瑞典科學(xué)家共同開發(fā)的能檢測mRNA全長的技術(shù)，Picelli等[6]對Smart-seq技術(shù)的純化步驟和覆蓋度進(jìn)行了改進(jìn)，稱為Smart-seq2，但這兩種技術(shù)的通量均較低；相較于上述技術(shù)而言，F(xiàn)red Hutchinson癌癥中心開發(fā)的10×Genomics是一種集分選、擴(kuò)增、建庫于一體的技術(shù)[7]，能夠一次性分離500～10 000個(gè)細(xì)胞，但不能獲得mRNA全長；近期還有研究將空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)相結(jié)合，互為補(bǔ)充，稱為單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)[13]，實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)與細(xì)胞空間信息的重疊，可直接觀測不同部位細(xì)胞基因表達(dá)的差異。SCoPE-MS是Slavov Nikolai團(tuán)隊(duì)于2018年利用超聲裂解細(xì)胞建立的質(zhì)譜分析單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)測序技術(shù)。ATAC-seq是由Buenrostro團(tuán)隊(duì)開發(fā)的一種檢測染色質(zhì)開放程度的技術(shù)，可用于表觀遺傳學(xué)的研究而且所需細(xì)胞量少、操作時(shí)間短。除此以外，單細(xì)胞多組學(xué)的同步測序分析也已成為現(xiàn)實(shí)。如G&T-seq可以對單個(gè)細(xì)胞的DNA和RNA 平行測序，從而展現(xiàn)基因變異與基因功能之間的關(guān)系；REAP-seq 采用寡核苷酸交聯(lián)抗體來檢測細(xì)胞RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平，可為轉(zhuǎn)錄后的研究提供線索；而scTrio-seq可以同時(shí)對細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組、基因組、染色質(zhì)狀態(tài)、DNA 甲基化進(jìn)行測序；不過，目前上述幾種技術(shù)的樣本僅局限于新鮮完整的細(xì)胞。

總之，不同組學(xué)的測序技術(shù)可以在不同水平識別細(xì)胞之間的差異及功能，多組學(xué)測序技術(shù)更是可以組合各組學(xué)信息深入挖掘異質(zhì)性的機(jī)制。雖然各種技術(shù)在測序成本、通量、深度、靈敏度及樣本要求等方面各有局限，但也在不斷改進(jìn)完善中。

1.3 單細(xì)胞測序技術(shù)的應(yīng)用

隨著單細(xì)胞測序技術(shù)方法的不斷進(jìn)步，該項(xiàng)技術(shù)已在生物醫(yī)學(xué)的不同領(lǐng)域展示出廣泛的應(yīng)用前景。目前，已在病原微生物學(xué)、生殖醫(yī)學(xué)及腫瘤學(xué)等[3]多個(gè)學(xué)科研究中應(yīng)用，并取得豐富的成果。相較于傳統(tǒng)測序技術(shù)，單細(xì)胞測序技術(shù)有下述幾點(diǎn)優(yōu)勢[14]：1）對單個(gè)細(xì)胞的性質(zhì)和功能進(jìn)行研究，揭示異質(zhì)性；2）對細(xì)胞譜系及之間的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行描述；3）探索數(shù)量稀少的特殊細(xì)胞的特性如循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）等。單細(xì)胞測序技術(shù)是一種強(qiáng)大的傳統(tǒng)測序技術(shù)的互補(bǔ)工具。基于這種技術(shù)的獨(dú)特優(yōu)勢以及迅猛發(fā)展，該項(xiàng)技術(shù)已越來越多地為多種惡性腫瘤如白血病[15]、黑色素瘤[16]、乳腺癌[17]、結(jié)直腸癌[18]、肺癌[19]、肝癌[20]和卵巢癌[21]等研究提供新的突破和機(jī)遇，成為一種可以更深層次探索惡性腫瘤性質(zhì)的強(qiáng)有力檢測工具，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

2 在惡性腫瘤基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用

2.1 揭示腫瘤異質(zhì)性

腫瘤異質(zhì)性是指在生長過程中，腫瘤細(xì)胞內(nèi)存在不同基因型的細(xì)胞群從而導(dǎo)致其表型的不一致性[22]。異質(zhì)性為惡性腫瘤的主要特征之一，可使腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移以及藥物敏感性等方面產(chǎn)生差異。Bian等[18]通過對12例Ⅲ～Ⅳ期結(jié)直腸癌患者原發(fā)灶、癌旁、轉(zhuǎn)移灶組織的1 900個(gè)細(xì)胞進(jìn)行scTrioseq 測序分析，精準(zhǔn)鑒定了結(jié)直腸癌兩個(gè)不同特征的細(xì)胞譜系及15個(gè)細(xì)胞亞群，發(fā)現(xiàn)不同譜系的細(xì)胞在DNA甲基化、染色體拷貝數(shù)變異等方面均存在差異，這種差異在各組學(xué)之間也存在較強(qiáng)的對應(yīng)關(guān)系。有研究對16例急性髓系白血病患者和5例健康捐獻(xiàn)者的骨髓細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，詳細(xì)全面地展示了不同類型不同分化狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞圖譜[15]。同時(shí)研究人員還在同1例患者樣本中發(fā)現(xiàn)了有不同基因譜的多個(gè)亞克隆存在的情況，其中一種克隆主要是與分化相關(guān)，另一種克隆則與腫瘤免疫抑制狀態(tài)有關(guān)。

上述研究提示，單細(xì)胞測序技術(shù)在揭示腫瘤異質(zhì)性問題上存在獨(dú)特的優(yōu)勢，能發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的多種亞型，進(jìn)而再對各類亞型細(xì)胞的性質(zhì)進(jìn)行分析比較，為腫瘤異質(zhì)性的進(jìn)一步解決提供了可能，也促進(jìn)了精準(zhǔn)治療的推廣。

2.2 探討腫瘤發(fā)生發(fā)展規(guī)律

多年來，有關(guān)惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及演變過程的研究頗多但具體機(jī)制尚未明確。諸多研究利用單細(xì)胞測序技術(shù)鑒定出一些在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用的細(xì)胞亞群及異?；颉?017年，Yang 等[23]通過對3例膀胱癌患者的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞全外顯子測序，在膀胱癌干細(xì)胞中鑒定出21個(gè)關(guān)鍵的腫瘤突變基因，包括之前未在膀胱癌中描述過的6個(gè)基因，其中ARID1A、GPRC5A和MLL2的共突變增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的自我更新能力并對腫瘤發(fā)生起到促進(jìn)作用。同年，Gao 等[24]收集1例結(jié)直腸癌患者的原發(fā)腫瘤細(xì)胞和CTCs，并對這些細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞全基因組測序發(fā)現(xiàn)，CTCs的拷貝數(shù)變異（copy number alteration，CNA）情況與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移位非常類似，這項(xiàng)研究結(jié)果有力支持了CTCs在腫瘤多種轉(zhuǎn)移途徑中發(fā)揮的作用。

單細(xì)胞測序技術(shù)能鑒別出一些腫瘤細(xì)胞特有的突變基因，有助于挖掘腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移的潛在關(guān)鍵因子，也為判斷是否有轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的高風(fēng)險(xiǎn)提供了理論依據(jù)，有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

2.3 描述腫瘤微環(huán)境

腫瘤細(xì)胞與其所處的微環(huán)境為一個(gè)相互作用、共同進(jìn)化的整體。腫瘤微環(huán)境主要由腫瘤細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)等組成[25]。腫瘤微環(huán)境對于腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移具有重要意義。Winterhoff等[21]將漿液型卵巢癌組織進(jìn)行酶消化并去除免疫細(xì)胞后，對66個(gè)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序主要鑒定出卵巢癌上皮細(xì)胞和腫瘤相關(guān)間質(zhì)細(xì)胞兩種亞群，并對這兩個(gè)亞群細(xì)胞的特征進(jìn)行描述，同時(shí)將這些特征與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）聯(lián)系，為漿液型卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移等的研究提供新思路。2018年，Zhang等[26]對12例結(jié)直腸癌患者的外周血、癌及癌旁組織的T細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序分析，通過對T細(xì)胞受體這一標(biāo)簽進(jìn)行追蹤揭示結(jié)直腸癌中20種不同功能特性的T細(xì)胞亞類，其中CD8+耗竭T細(xì)胞主要表現(xiàn)為高度的克隆增殖以及低遷移能力，有助于探索腫瘤T細(xì)胞耗竭的機(jī)制。1年后，該團(tuán)隊(duì)又將SMARTseq2和10×Genomics 這兩種技術(shù)相結(jié)合對肝癌原發(fā)灶、癌旁、淋巴結(jié)、外周血和腹水5個(gè)部位的免疫細(xì)胞進(jìn)行測序分析，首次公布了肝癌不同組織間免疫微環(huán)境的細(xì)胞圖譜及其動態(tài)遷移、轉(zhuǎn)化的特征以及跨組織腫瘤浸潤免疫細(xì)胞的動態(tài)過程，對于肝癌的免疫治療具有潛在應(yīng)用價(jià)值[27]。

單細(xì)胞測序技術(shù)全面地展現(xiàn)了腫瘤微環(huán)境中各組成部分的特有特征，并明確腫瘤細(xì)胞與微環(huán)境各組分之間的相互作用，尤其是腫瘤與免疫細(xì)胞的關(guān)系，有助于探索腫瘤免疫治療的潛在新靶點(diǎn)。

3 在惡性腫瘤臨床治療中的應(yīng)用

3.1 分析腫瘤耐藥機(jī)制

化療為惡性腫瘤主要治療方法之一，而化療過程中耐藥細(xì)胞的出現(xiàn)可導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。Kim等[28]通過對20例行新輔助化療的三陰性乳腺癌患者樣本進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和基因組測序，分析化療前、中、后腫瘤細(xì)胞的克隆進(jìn)化過程。研究結(jié)果顯示，在化療過程中部分克隆消失，部分克隆持續(xù)存在，而且有部分細(xì)胞在化療前已有部分抗藥相關(guān)基因的表達(dá)，該結(jié)果為三陰性乳腺癌的原發(fā)耐藥提供了證據(jù)支持。除此之外，Prieto-Vila等[17]也對多種乳腺癌細(xì)胞系及其衍生耐藥細(xì)胞系進(jìn)行單細(xì)胞基因譜分析，其在耐藥細(xì)胞系上觀察到EMT及與干細(xì)胞特性相關(guān)基因表達(dá)的上調(diào)，還在未經(jīng)處理的親本細(xì)胞群中發(fā)現(xiàn)少數(shù)與耐藥細(xì)胞群相似基因表達(dá)譜的細(xì)胞。

上述研究提示，單細(xì)胞測序技術(shù)可對腫瘤耐藥細(xì)胞進(jìn)行譜系追蹤，并有助于探索腫瘤異質(zhì)性及腫瘤干細(xì)胞在腫瘤耐藥機(jī)制中發(fā)揮作用，同時(shí)挖掘關(guān)鍵的耐藥基因，為腫瘤耐藥的靶向治療提供理論基礎(chǔ)。

3.2 明確腫瘤分型、指導(dǎo)治療

近年來，隨著分子生物學(xué)及免疫學(xué)的發(fā)展，腫瘤來源及分型也愈加明確，靶向治療及免疫治療也為惡性腫瘤的精準(zhǔn)化、個(gè)性化治療帶來新希望。Hu等[29]通過對6 000個(gè)非卵巢癌患者的正常輸卵管上皮細(xì)胞進(jìn)行Smart-seq2測序分析，不僅為驗(yàn)證高級別漿液性卵巢癌的“輸卵管起源”學(xué)說[30]提供理論支持，同時(shí)通過起源細(xì)胞標(biāo)記基因的組合提出一種與卵巢癌預(yù)后穩(wěn)定相關(guān)的腫瘤分型方法，為分期個(gè)性化治療提供了新思路。Puram 等[31]對18例頭頸鱗癌患者的原發(fā)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移位的細(xì)胞進(jìn)行測序分析，根據(jù)腫瘤中不同類型基質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞的存在對頭頸鱗癌的分子亞型進(jìn)行重新定義，同時(shí)還鑒定了一群有EMT 特征的腫瘤前沿細(xì)胞，這群細(xì)胞與腫瘤病理分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。Guo 等[19]通過對14例非小細(xì)胞肺癌患者外周血、癌及癌旁組織中的T淋巴細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，鑒定不同組織間T細(xì)胞亞群分類，分析了藥物靶基因表達(dá)情況，為特異性靶向T細(xì)胞亞群的免疫治療方法提供新的靶標(biāo)。

單細(xì)胞測序技術(shù)可以推動惡性腫瘤分型的進(jìn)一步明確，也可發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞特有的表面標(biāo)記，為不同腫瘤亞型的靶向治療和免疫治療方法提供參考，促進(jìn)腫瘤個(gè)性化臨床治療的發(fā)展。

4 展望

綜上所述，腫瘤異質(zhì)性是惡性腫瘤研究的熱點(diǎn)、難點(diǎn)，也是腫瘤診治的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。單細(xì)胞測序技術(shù)通過對成千上萬甚至更多個(gè)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行高通量測序，可以全面繪制腫瘤細(xì)胞的圖譜、完成細(xì)胞譜系的追蹤、精確比較不同腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，實(shí)現(xiàn)對惡性腫瘤多角度、多層次且全面直觀的認(rèn)識，從而指導(dǎo)臨床診斷及治療等。雖然單細(xì)胞測序技術(shù)仍存在部分缺點(diǎn)，如耗時(shí)長、費(fèi)用居高不下、樣本要求高和某些技術(shù)誤差等，但隨著技術(shù)的不斷改進(jìn)，上述缺點(diǎn)也會被逐漸改善。單細(xì)胞測序技術(shù)可能會成為惡性腫瘤研究的重要手段，在臨床工作中具有廣闊的應(yīng)用前景。