A亞型患者血型鑒定流程及輸血策略研究

楊璇 郭思維 洪強(qiáng)

ABO血型是最早發(fā)現(xiàn)的、免疫原性最強(qiáng)的血型系統(tǒng)，正確的血型鑒定是確保輸血安全的首要條件[1-3]。A亞型在ABO血型中最常見,A1型占大多數(shù), 少數(shù)為Aint、A2。此外，還有A3、Ax、Am、Aend、Ael等[4]。本文運(yùn)用血清學(xué)和分子生物學(xué)方法對1名A2亞型患者進(jìn)行血型鑒定，分析其血清學(xué)特征，進(jìn)行家系調(diào)查，并進(jìn)一步延伸，探究其它A亞型的鑒定方法和安全輸血策略。

1 材料與方法

1.1 研究對象

患者李某，男，63歲，因右側(cè)面部腫物半年住院治療。術(shù)前備血行血型鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)其正定A型反定O型，正反定型不一致。其家系成員共5人，包括患者及其配偶、兒子、女兒以及外孫女。血液檢測經(jīng)患者及家屬知情同意。

1.2 試劑與儀器

ABO血型檢測卡： 長春博迅，抗-A、抗-B 、抗-A1、抗-H試劑、ABO反定細(xì)胞：上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司，抗AB：法國Diagast公司，人源抗-A由本實(shí)驗(yàn)室制備（多人份抗篩陰性效價(jià)≥128的B型血漿）?？谷饲虻鞍卓ǎ何靼嘌来靼材裙?，凝聚胺試劑盒：珠海貝索生物技術(shù)有限公司。由天津秀鵬生物技術(shù)有限公司完成ABO基因PCR-SSP分型和測序。

1.3 方法

1.3.1 血型血清學(xué)試驗(yàn) 抽取全部成員EDTA-K2抗凝的靜脈全血2 mL，鑒定患者血型采用凝膠微柱法與試管法，血清不規(guī)則抗體篩查采用鹽水法、凝聚胺法與卡式抗人球蛋白法，檢測唾液中ABH血型物質(zhì)。必要時(shí)，使用人源抗-A進(jìn)行紅細(xì)胞吸收放散試驗(yàn)，以驗(yàn)證紅細(xì)胞表面是否存在弱A抗原。家族其他成員ABO血型鑒定采用試管法。以上均嚴(yán)格按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[5]的要求進(jìn)行。

1.3.2 ABO基因分型 由天津秀鵬公司完成基因組DNA提取，將PCR產(chǎn)物在2.5%瓊脂糖凝膠以140-150V條件下電泳15～20分鐘，凝膠紫外成像。

1.3.3 ABO基因測序 由天津秀鵬公司完成患者ABO基因第1-7外顯子的基因測序，根據(jù)NCBI網(wǎng)站提供的Names for ABO （ISBT 001） blood group alleles v1.1 171023綜合結(jié)果判定。

1.3.4 交叉配血試驗(yàn) 使用患者血漿進(jìn)行盲篩，選擇與患者不產(chǎn)生凝集反應(yīng)的A型紅細(xì)胞。或者選擇O型洗滌紅細(xì)胞進(jìn)行交叉配血試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 血型血清學(xué)結(jié)果

結(jié)果顯示，患者正定型為A型，其紅細(xì)胞與抗-A、抗-AB 均發(fā)生凝集，與抗-A1弱凝集。其反定型為O型，患者血漿與A1紅細(xì)胞弱凝集、B 細(xì)胞發(fā)生凝集，考慮其血型為A亞型?；颊吲渑?、兒子ABO 血型及抗-H 結(jié)果顯示正常，其女兒正反定型為AB型，但與抗-A1不凝集，為A2B 型，見表1。

表1 患者及其家系A(chǔ)BO 血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果

2.2 不規(guī)則抗體篩查

抗篩陰性，未檢出不規(guī)則抗體。

2.3 ABO基因分型結(jié)果

結(jié)果顯示：1,2,4,6,7,8,9,11孔陽性，對照ABO基因PCR-SSP分型結(jié)果表，該患者為A205O1，見圖1。

圖1 患者ABO基因PCR-SSP結(jié)果

2.4 ABO 1-7 外顯子測序結(jié)果

測序結(jié)果： A205/O01

2.4.1 EXON1～5測序結(jié)果 沒有發(fā)生突變。

2.4.2 EXON6測序結(jié)果 第261號(hào)堿基鳥嘌呤（G）缺失,導(dǎo)致第88位氨基酸發(fā)生移碼突變（Thr/Pro）。見圖2。

2.4.3 EXON7測序結(jié)果 第467號(hào)發(fā)生單個(gè)堿基替換，胞嘧啶（C）突變?yōu)樾叵汆奏ぃ═）,導(dǎo)致第156位氨基酸改變（Pro/Leu）見圖3。第1009號(hào)發(fā)生錯(cuò)義突變，堿基鳥嘌呤（A）突變?yōu)橄汆堰剩℅），導(dǎo)致第337位氨基酸改變（Arg/Gly）。見圖4。

2.5 輸血方案

選擇A2型紅細(xì)胞、血小板及血漿進(jìn)行輸注。筆者認(rèn)為亦可使用O型洗滌懸浮紅細(xì)胞、A 型血漿和血小板進(jìn)行輸注。

3 討論

ABO血型位于第9號(hào)染色體上，包含7個(gè)外顯子，有3個(gè)主要等位基因， A基因和B基因通過編碼產(chǎn)生糖基轉(zhuǎn)移酶，進(jìn)而控制ABO血型抗原的合成[6-7]。當(dāng)前人類血型抗原基因突變庫已發(fā)現(xiàn)A2等位基因有20個(gè)，本研究該病例為第467位的單個(gè)堿基替換（C＞T）和第1009位的錯(cuò)義突變（A＞G），是典型A2O5[8]。

由于ABO 血型抗原表達(dá)的復(fù)雜性，血清學(xué)結(jié)果存在個(gè)體差異，不同的基因型之間差異微小，相同的基因型亦略有不同。同時(shí)，也容易受主客觀因素的影響。例如本研究該病例基因型在中國漢族人群中較為常見[9]，該類患者的紅細(xì)胞通常不與抗-A1產(chǎn)生凝集反應(yīng)，但是該病例卻與抗-A1存在弱凝集反應(yīng)，因此無法精準(zhǔn)分型，需借助分子生物學(xué)的方法。分子生物學(xué)的應(yīng)用解決了血清學(xué)的局限性，為準(zhǔn)確鑒定血型和快速尋找合適的血液創(chuàng)造條件，提高輸血的安全性[10]。

圖2 患者ABO基因第6外顯子261號(hào)堿基缺失

圖3 患者ABO基因第7外顯子467號(hào)堿基突變詳情

圖4 患者ABO基因第7外顯子1009號(hào)堿基突變詳情

筆者認(rèn)為，實(shí)際工作中出現(xiàn)正定型結(jié)果和反定型結(jié)果不一致的情況時(shí)，首先應(yīng)排除人為因素、技術(shù)問題，排除年齡、疾病及治療的影響[11]，參考ABO 疑難血型三步分析法及AABB 指南[12]，歸納總結(jié)后進(jìn)一步建立試驗(yàn)。正常A型及AB型紅細(xì)胞與抗-A1的凝集強(qiáng)度可達(dá)到4+， A2、A3、Am、Ax、B（A）等亞型的紅細(xì)胞與抗-A1幾乎不反應(yīng)，但Ax、Bx型紅細(xì)胞與抗-AB反應(yīng)強(qiáng)度與抗-A、抗-B相比有明顯增強(qiáng)[13]。類孟買血型也存在紅細(xì)胞A或B抗原缺失或弱表達(dá)，其血清學(xué)表現(xiàn)與Am、Ax、Ael、Bm、Bx 等ABO亞型十分相似，可應(yīng)用抗-H加以區(qū)分[14]。唾液A、B、H 物質(zhì)檢測和紅細(xì)胞的吸收放散試驗(yàn)可幫助證實(shí)是否存在弱A抗原或弱B抗原[15]。

對于ABO亞型患者,同型供血者無疑是最好的選擇，但實(shí)際工作中難以實(shí)現(xiàn)。本研究該病例為A2亞型，據(jù)相關(guān)報(bào)道，A2亞型約占A型人群20%[16]。就當(dāng)前現(xiàn)狀，若血清中未檢出抗-A1抗體，A2亞型常常漏檢，因此無法從血站直接獲取同型血液。筆者認(rèn)為，對于有條件的地區(qū)，可以用抗-A1試劑隨機(jī)篩選A型獻(xiàn)血者，選擇與其不反應(yīng)的紅細(xì)胞進(jìn)行輸注。而條件有限的地區(qū)，為了避免溶血反應(yīng)或同種抗體產(chǎn)生，以盡可能減少異型紅細(xì)胞血型抗原為輸入原則, 避免輸入含有其血漿中的抗體所對應(yīng)的紅細(xì)胞抗原的紅細(xì)胞以及含有其紅細(xì)胞血型抗原對應(yīng)的抗體的血漿，可選擇O型洗滌紅細(xì)胞和亞型對應(yīng)的正常血型的血漿、冷沉淀及血小板進(jìn)行交叉配血。因此，筆者認(rèn)為，其他A亞型患者在難以篩選同型供血者的情況下，亦可為其提供O型洗滌紅細(xì)胞、A型血漿和A型血小板進(jìn)行輸注。