帕金森病的非人靈長類動物模型研究進(jìn)展

宋凈洋 車祥源 邢紅霞

1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南衛(wèi)輝 453100；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南新鄉(xiāng) 453000

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是中老年人群中常見的神經(jīng)退行性疾?。?］，以中腦黑質(zhì)多巴胺（dopamine，DA）能神經(jīng)元退行性變性死亡以及路易小體的形成為主要病理生理特征。PD 的發(fā)病機(jī)制目前尚未闡明，可能與環(huán)境、遺傳、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、免疫異常、細(xì)胞凋亡等諸多因素有關(guān)。目前PD的治療主要以改善癥狀的藥物治療為主，但仍然缺乏有效的根治措施，到了疾病晚期階段，患者往往生活難以自理，因此給PD 患者其所在的家庭及社會都帶來沉重的負(fù)擔(dān)。要進(jìn)行PD 疾病的研究，通常需要構(gòu)建理想的PD 動物模型。嚙齒類動物與人的差異較大，而非人靈長類（non-human primates，NHPs）的行為能力和神經(jīng)解剖學(xué)復(fù)雜性非常類似于人類，因此NHPs的使用無疑是研究PD 的關(guān)鍵工具。因此筆者主要針對PD 的NHPs 動物模型做一介紹。

1 現(xiàn)有PD 動物模型

PD 的研究過程中有兩個(gè)主要困難：一是缺乏完整的參與神經(jīng)退行性過程的分子機(jī)制，二是缺乏擁有充分的可進(jìn)行方法評估的預(yù)測模型。第一個(gè)困難可以通過在眾多類型PD 動物模型中研究得出。而第二個(gè)困難目前尚未解決。目前通過基因改造和神經(jīng)毒素的干預(yù)產(chǎn)生的PD 動物模型并沒有產(chǎn)生在行為和病理結(jié)果上均可預(yù)測的PD 動物模型。

最近，通過將外源基因引入NHPs 基因組或改變NHPs 的內(nèi)源基因，產(chǎn)生了幾種NHPs 轉(zhuǎn)基因動物模型［2］。雖然NHPs 轉(zhuǎn)基因動物模型有助于了解PD 的發(fā)病機(jī)制，但是由于NHPs 與嚙齒類動物比較壽命長，因此對NHPs 的PD 模型發(fā)病機(jī)制的研究需要很長的時(shí)間。而當(dāng)前可用的遺傳模型也不能完全誘導(dǎo)出具有明顯神經(jīng)退行性變的PD 表型［3］，神經(jīng)毒性模型則可以通過破壞黑質(zhì)紋狀體通路誘導(dǎo)出具有明顯神經(jīng)退行性變的PD 表型［4］。NHPs 動物模型是一種公認(rèn)的PD 模型，現(xiàn)在研究大多通過使用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶（MPTP）和6-羥基多巴胺（6-OHDA）誘導(dǎo)黑質(zhì)紋狀體神經(jīng)元選擇性變性誘導(dǎo)PD 模型［5］，這些模型可以通過神經(jīng)毒素的全身或局部給藥來發(fā)揮作用［6］。

2 NHPs 中經(jīng)典PD 動物模型

2.1 NHPs 中MPTP 誘導(dǎo)PD 動物模型

MPTP 是高度親脂性化合物，它可以快速穿過血腦屏障。MPTP 毒性的潛在機(jī)制是單胺氧化酶B 將MPTP 轉(zhuǎn)化為陽離子MPP+，該陽離子可通過黑質(zhì)致密部進(jìn)入DA 能神經(jīng)元。MPP+主要通過阻斷線粒體復(fù)合體Ⅰ的活性導(dǎo)致ATP 消耗和氧化應(yīng)激增加［7］，從而誘導(dǎo)PD 模型。但采用MPTP 誘導(dǎo)的急性神經(jīng)毒性模型無法復(fù)制出與PD 路易小體相似的的蛋白質(zhì)聚集體，即使長期、大劑量的MPTP 誘導(dǎo)的靈長類PD 動物模型也無法復(fù)制出α-突觸核蛋白聚集的病理現(xiàn)象［8-9］。

與其他可用的PD 模型比較，MPTP 模型不需要熟練的立體定位技術(shù)，其在生化、解剖學(xué)和行為學(xué)方面與人類PD 癥狀具有較大的相似性。但與6-OHDA模型比較，在首次注射MPTP 后的24 h 內(nèi)MPTP 模型可出現(xiàn)因?yàn)樾呐K毒性而引起的劑量依賴性死亡［10］。此外，盡管MPTP 本身并不直接有害，但其代謝產(chǎn)物MPP+具有劇毒，所以采用MPTP 處理動物模型時(shí)對處理動物的人員有嚴(yán)重的安全隱患［11］，所以需要具有嚴(yán)格安全設(shè)備的實(shí)驗(yàn)室。

2.2 NHPs 中6-OHDA 誘導(dǎo)PD 動物模型

6-OHDA 是一種兒茶酚胺能神經(jīng)毒素，廣泛用于誘導(dǎo)嚙齒動物和NHPs 動物中DA 能神經(jīng)元的死亡［12］。6-OHDA 不能透過血腦屏障，所以需要將6-OHDA立體定位直接注入到目標(biāo)大腦區(qū)域。兒茶酚胺能神經(jīng)元可以通過單胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白選擇性吸收6-OHDA，通過增加活性氧的產(chǎn)生誘導(dǎo)交感神經(jīng)元的丟失，破壞能量代謝和神經(jīng)元的活動從而誘導(dǎo)PD 模型［13］。

在NHPs 動物中，將6-OHDA 注入到黑質(zhì)紋狀體束或紋狀體內(nèi)會導(dǎo)致典型的帕金森樣運(yùn)動缺陷，這與黑質(zhì)區(qū)酪氨酸羥化酶（TH）陽性細(xì)胞的丟失有關(guān)。除了將6-OHDA 立體定位直接注入到目標(biāo)大腦區(qū)域外，也可以全身給藥以模擬心臟自主神經(jīng)功能失調(diào)狀態(tài)［14］。靜脈注射6-OHDA 會引起心臟兒茶酚胺能神經(jīng)支配的喪失和循環(huán)兒茶酚胺水平的降低［15］，但在6-OHDA 模型中仍然沒有觀察到路易小體或α-突觸核蛋白的聚集體。

3 NHPs 中新型PD 動物模型

經(jīng)典的PD 動物模型（6-OHDA 和MPTP 模型）雖然能夠模擬人類PD 的病理生化改變，但不能模擬PD 主要的病理生理特征，即細(xì)胞內(nèi)路易小體的形成。而α-突觸核蛋白是形成路易小體的重要成分，其主要由清理毒性蛋白的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin proteasome system，UPS）降解［16］。因此McNaught 等［17］構(gòu)建出一種基于抑制UPS 的PD 模型：經(jīng)PSI 系統(tǒng)（可逆性合成小肽的蛋白酶抑制因子）處理的大鼠在飼養(yǎng)中出現(xiàn)以下癥狀：活動減少、僵直、姿勢異常、震顫等的帕金森綜合征表現(xiàn)，并出現(xiàn)了與PD 相同的神經(jīng)病理學(xué)特征：黑質(zhì)中TH 陽性DA 神經(jīng)元細(xì)胞的丟失，紋狀體DA 耗竭，α-突觸核蛋白和泛素在藍(lán)斑、迷走神經(jīng)背核等的聚集積累。PSI 誘導(dǎo)出的模型和現(xiàn)有使用UPS 抑制劑乳胞素［18］實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。許多研究者使用UPS 抑制劑對嚙齒類動物和靈長類進(jìn)行全身系統(tǒng)的注射［19］，卻沒有復(fù)制出PD 模型［20］，該系統(tǒng)模型構(gòu)建的失敗可能與一系列因素，如藥物劑量、吸收的因素、藥物暴露時(shí)間、通過血腦屏障的通道、所用溶劑等相關(guān)。然而，在黑質(zhì)紋狀體內(nèi)直接注射UPS 抑制劑產(chǎn)生的初步效果與Lillethorup 等［21］描述的相一致。注射乳胞素到魚的腦脊液中構(gòu)建的模型，也出現(xiàn)蛋白聚集體、DA 神經(jīng)元的丟失等病理特征［22］。研究者在嚙齒類動物中的研究顯示TH 陽性的神經(jīng)元細(xì)胞的丟失數(shù)量表現(xiàn)出乳胞素-劑量依賴性。這提示，利用腦內(nèi)UPS 抑制體系的作用可以構(gòu)建一個(gè)與之一致并可重復(fù)的模型［23］。

利用UPS 抑制劑建立的模型能夠完整地展現(xiàn)出：PD 的運(yùn)動和非運(yùn)動臨床特征，TH 陽性神經(jīng)元細(xì)胞的丟失，黑質(zhì)區(qū)炎癥標(biāo)志物的增多，內(nèi)含α-突觸核蛋白和泛素的包涵體的聚集積累等病理特點(diǎn)。因此構(gòu)建出蛋白酶體功能障礙的NHPs 模型將對探究出PD的發(fā)病機(jī)制、疾病防治、臨床藥物有效性和安全性評價(jià)具有獨(dú)特的優(yōu)勢。

4 NHPs 中PD 動物模型評估

4.1 行為學(xué)觀察

為了更好地研究PD，需要建立可以高度復(fù)制的PD 動物模型，以解決包括大腦病理變化在內(nèi)的所有與PD 相關(guān)的問題。首先，可以使用臨床評分量表記錄典型的PD 癥狀（如正常、肌肉僵硬等）及異常的非自主運(yùn)動癥狀（如面部及全身行為等）。這些臨床評分可以通過雙盲方式觀看動物的事后視頻記錄，記錄患病動物的自發(fā)運(yùn)動能力來進(jìn)行。

4.2 正電子發(fā)射斷層掃描（PET）

PET 成像是一種相對非侵入性的神經(jīng)成像技術(shù)，可用于闡明與PD 相關(guān)的功能改變，并通過評價(jià)黑質(zhì)紋狀體DA 系統(tǒng)的完整性來提供診斷信息［24-26］。在異氟醚麻醉下，NHPs 可進(jìn)行PET 掃描，使用包括18FDOPA、18F-FP-CIT、11C-FP-CIT、11C-CFT、11C-PE2I、18F-AV-133、11C-DTBZ 等在內(nèi)的正電子發(fā)射同位素標(biāo)記的示蹤化合物，可以對體內(nèi)的生化過程進(jìn)行成像和測量［27-28］。

4.3 磁共振成像（MRI）

功能性和結(jié)構(gòu)性腦成像的快速發(fā)展使得觀察腦功能的特定變化成為可能。MRI 比PET 應(yīng)用廣泛得多，是在體內(nèi)對整個(gè)大腦進(jìn)行解剖成像最常用的系統(tǒng)。它可以非侵入性獲取PD 引起病變的功能性圖像［29］。NHPs 是進(jìn)行PD 研究的最合適的物種，目前已越來越多地通過MRI 進(jìn)行研究。MR 光譜也可以用作非侵入性工具，通過測量某些代謝物的存在和濃度來評估與神經(jīng)變性和抗PD 治療相關(guān)的體內(nèi)動態(tài)變化［30］。

4.4 病理學(xué)檢測

雖然對黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)的評價(jià)是PD 研究的基本工具，但病理學(xué)檢測也很重要。我們建議在戊巴比妥深度麻醉下，行心內(nèi)灌注肝素化鹽水，然后取出大腦，固定后進(jìn)行形態(tài)學(xué)處理。猴腦的大小（與大鼠或小鼠比較）具有以下優(yōu)點(diǎn)：新鮮器官可以切片，確定區(qū)域，并且可以采集特定目標(biāo)區(qū)域的小組織樣本。也可以通過電化學(xué)檢測功能的高效液相色譜法（HPLC）檢測新鮮腦樣本、腦脊液或通過體內(nèi)微透析獲得細(xì)胞外液中的DA 和DA 代謝產(chǎn)物3，4-二羥苯酰乙酸（DOPAC）和高香草酸（HVA）的量［31］。此外，還可以通過免疫組織化學(xué)方法來測定黑質(zhì)DA 能神經(jīng)元的數(shù)目。

5 結(jié)論

盡管動物模型可能無法充分反映人類疾病的特征，但它們可用于分析疾病的某些方面，而使用簡單的體外模型無法對其進(jìn)行全面研究。人們對NHPs 動物模型的興趣逐漸增加，因?yàn)樗鼈兪俏ㄒ辉谂R床試驗(yàn)前進(jìn)行臨床前評估時(shí)與人類具有高度相似性的相關(guān)物種。所以，在臨床前階段，將NHPs 用作實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ途哂性S多顯著的優(yōu)勢。本文通過對PD 的NHPs 動物模型的介紹，可以幫助研究人員根據(jù)研究的特定目的選擇合適的造模方法。在PD 的NHPs 動物模型中進(jìn)行的研究可能有助于開發(fā)用于早期診斷的工具，還有可能幫助開發(fā)旨在阻止或減慢疾病進(jìn)展的下一代PD藥物。