白癜風(fēng)皮損旁黑素細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的研究

虞海燕 岑建萍 林曉霞 何劍萍 王瑤瑤 程浩

白癜風(fēng)是一種獲得性的以局部或全身多發(fā)色素脫失斑為特征的皮膚疾病。其毀損性的外觀嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。迄今，其病因及發(fā)病機(jī)制未明，為疾病的有效防治帶來(lái)困難。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為白癜風(fēng)是一種多基因遺傳的自身免疫性疾病，在多種環(huán)境因子如氧化應(yīng)激、神經(jīng)精神和病毒等因素的激發(fā)下出現(xiàn)免疫功能紊亂，導(dǎo)致表皮黑素細(xì)胞破壞[1]。氧化應(yīng)激損傷是目前認(rèn)為導(dǎo)致黑素細(xì)胞功能損傷及黑素細(xì)胞丟失的一個(gè)重要因素[2]。現(xiàn)已知自噬有助于黑素細(xì)胞穩(wěn)定自身的氧化還原穩(wěn)態(tài)，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，是細(xì)胞維持自身穩(wěn)態(tài)的一種重要機(jī)制。細(xì)胞可通過(guò)自噬清除損傷或多余的細(xì)胞器進(jìn)行自我保護(hù)，并通過(guò)快速而相對(duì)簡(jiǎn)單的過(guò)程清除胞內(nèi)微生物而參與免疫反應(yīng)[3]。正常自噬功能有助于均衡免疫反應(yīng)，從而防止疾病發(fā)生。自噬失衡可導(dǎo)致異常的免疫反應(yīng)而產(chǎn)生疾病，研究已發(fā)現(xiàn)許多自身免疫性疾病存在自噬異常如紅斑狼瘡及炎癥性腸病等。自噬的調(diào)節(jié)對(duì)黑素細(xì)胞的生理功能也有著重要影響，紫外線(xiàn)抵抗相關(guān)基因（ultroviolet radiation resistance associated gene，UVRAG） 能激活自噬相關(guān)基因BECN1的相關(guān)通路而促進(jìn)自噬，其基因的多態(tài)性與白癜風(fēng)有關(guān)，研究非節(jié)段性白癜風(fēng)的患者發(fā)現(xiàn)UVRAG可能與白癜風(fēng)的易感性有關(guān)[4]。另外,敲除自噬相關(guān)基因BECN1可導(dǎo)致黑素聚集的下降[5]。然而，自噬在白癜風(fēng)發(fā)病中的作用尚未明了，本研究將利用原代體外黑素細(xì)胞培養(yǎng)的方法分離白癜風(fēng)患者及正常對(duì)照的黑素細(xì)胞，采用免疫印跡法檢測(cè)并比較自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的差異，分析它們與疾病可能的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 原代培養(yǎng)的白癜風(fēng)黑素細(xì)胞（白癜風(fēng)組）從泛發(fā)型白癜風(fēng)患者軀干皮損周?chē)恼Ｆつw組織中提取，所取的3例不同白癜風(fēng)樣本均來(lái)自于本院白癜風(fēng)專(zhuān)科門(mén)診的患者，由2位醫(yī)生分別確定診斷歸屬于泛發(fā)型白癜風(fēng)，并行伍德燈確定。排除標(biāo)準(zhǔn)：近3個(gè)月接受系統(tǒng)藥物治療及光療，軀干部無(wú)皮損或軀干部的皮損近1個(gè)月使用外用藥物治療者?；颊呔炇鹬橥鈺?shū)。正常的黑色素細(xì)胞（對(duì)照組）為來(lái)源于本院泌尿外科包皮環(huán)切手術(shù)3例患者所廢棄的皮膚組織。

1.2 方法

1.2.1 原代黑素細(xì)胞培養(yǎng)方法 皮膚組織去除皮下組織，經(jīng)0.25%Dispase酶4℃共育過(guò)夜，分離表皮與真皮，用0.25%胰蛋白酶溶液消化表皮10min，用移液器輕輕吹打。細(xì)胞懸浮液經(jīng)細(xì)胞過(guò)濾器過(guò)濾后1 000r/min離心10min，收獲細(xì)胞。黑素細(xì)胞在加有100μg/ml選擇抗生素G418（美國(guó)Gibco公司）的黑色素細(xì)胞培養(yǎng)液（美國(guó)Sciencell公司）中選擇性生長(zhǎng)。細(xì)胞孵育于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中，2～4代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.2.2 自噬相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫印跡法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期不同來(lái)源的黑素細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/ml，接種于10 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)48h后，用蛋白裂解液裂解細(xì)胞，測(cè)定蛋白含量，用10%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行蛋白質(zhì)分離，然后轉(zhuǎn)移到聚乙二烯二氟化物膜，將膜移至含有封閉液5%的脫脂奶粉的平皿中室溫封閉2h，然后分別與相應(yīng)的抗微管相關(guān)蛋白輕鏈 3（microtubule-associated protein-1 light chain 3，LC3）抗體（美國(guó)Proteintech公司）、抗 p62抗體（美國(guó)Proteintech公司）、抗自噬相關(guān)基因5（autophagy related gene 5，Agt 5）抗體（英國(guó) Abcam 公司）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR)抗體（英國(guó)Abcam公司）或抗β-actin抗體（美國(guó)Cell signalling Technology公司）共育過(guò)夜，用TBST緩沖液4℃搖床上洗滌4次，再與連接有辣根過(guò)氧化物酶的二抗共育4h。用ECL試劑盒對(duì)信號(hào)進(jìn)行可視化。使用掃描密度分析圖像軟件對(duì)條帶進(jìn)行密度掃描。

1.2.3 酪氨酸酶活性測(cè)定 采用改良的多巴胺法[6]。調(diào)整培養(yǎng)黑素細(xì)胞的濃度為1×105/ml，將150ml接種于96孔板中。置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）洗滌細(xì)胞2次，再于每孔加入50μl 1%Triton X-100/PBS裂解細(xì)胞，每孔加入100ml 1%L-DOPA置37℃孵育4h后，使用酶標(biāo)儀測(cè)量吸光度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Graphpad prism6統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞LC3Ⅱ/Ⅰ及p62蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)圖1。

圖1 兩組黑素細(xì)胞LC3Ⅱ/Ⅰ及p62蛋白表達(dá)（a：蛋白表達(dá)電泳圖；b：灰度分析圖，與對(duì)照組比較，**P＜0.01）

由圖1可見(jiàn)，白癜風(fēng)組LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)值為2.71±0.08，顯著高于對(duì)照組 1.01±0.18，白癜風(fēng)組 p62 蛋白表達(dá)值為 0.45±0.03，顯著低于對(duì)照組 0.71±0.08，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.36、5.12，均 P＜0.01）。

2.2 兩組細(xì)胞Atg5和mTOR蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)圖2。

由圖2可見(jiàn)，白癜風(fēng)組Atg5蛋白表達(dá)值為0.74±0.03，顯著高于對(duì)照組 0.49±0.02，白癜風(fēng)組 mTOR 蛋白表達(dá)值為 0.23±0.02，顯著低于對(duì)照組 0.39±0.04，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.01、7.22，均 P＜0.01）。

2.3 兩組細(xì)胞酪氨酸酶活性比較 白癜風(fēng)組酪氨酸酶活性為 0.646±0.002，明顯低于對(duì)照組 0.784±0.006（t=36.51，P＜0.01)。

圖2 兩組黑素細(xì)胞Atg5和mTOR表達(dá)（a：蛋白表達(dá)電泳圖；b：灰度分析圖，與對(duì)照組比較，**P＜0.01）

3 討論

自噬是維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的一個(gè)重要途徑，也是細(xì)胞清除自身破損細(xì)胞器和降解長(zhǎng)壽蛋白必不可少的一個(gè)方式[3]，自噬的調(diào)節(jié)對(duì)黑素細(xì)胞的生理功能有著重要的影響。本研究結(jié)果顯示，白癜風(fēng)患者皮損旁的黑素細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3Ⅱ/Ⅰ上調(diào)、p62蛋白表達(dá)降低。LC3是可靠的自噬標(biāo)志物[7]，它有兩種存在形式LC3Ⅰ和LC3Ⅱ，當(dāng)發(fā)生自噬時(shí)，部分LC3Ⅰ型轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3Ⅱ型，LC3Ⅱ含量或 LC3Ⅱ和 LC3Ⅰ比值與自噬活性呈正相關(guān)。在自噬過(guò)程中，與之結(jié)合的適配器蛋白p62/SQSTM1被消耗，因此，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的增高伴隨p62蛋白的下降提示有自噬的增高。本研究結(jié)果提示，體外培養(yǎng)的白癜風(fēng)皮損旁黑素細(xì)胞存在有自噬功能的活化。另外，Atg5是自噬體形成過(guò)程中所需的一種關(guān)鍵蛋白，在自噬囊泡的形成過(guò)程中，Atg12聯(lián)合Atg5然后與Atg16結(jié)合構(gòu)成Atg12-Atg5-Atg16復(fù)合體而附集于膜上輔助自噬囊泡的形成，而mTOR是自噬的一個(gè)重要調(diào)節(jié)蛋白，它可以通過(guò)磷酸化使UNC-51樣酶失活而抑制自噬，因此，自噬通路的活化常常伴隨Atg5蛋白的表達(dá)增高及mTOR蛋白的下調(diào)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,白癜風(fēng)黑素細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Atg 5的表達(dá)升高、mTOR蛋白表達(dá)降低，提示白癜風(fēng)患者皮損旁的黑素細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)具有自噬通路的活化。

自噬的調(diào)節(jié)對(duì)于黑素細(xì)胞黑素的形成具有雙向調(diào)節(jié)作用[8]。用雷帕霉素誘導(dǎo)自噬可以顯著增加黑色素指數(shù)、酪氨酸酶活性以及與黑素體生物合成相關(guān)的幾種蛋白的表達(dá)，用siRNA抑制并下調(diào)LC3可以降低黑色素含量和酪氨酸酶活性[9]。敲除自噬相關(guān)基因BECN1可導(dǎo)致黑素含量及黑素顆粒的數(shù)量下降[5]。提示促進(jìn)自噬可以增加黑素細(xì)胞合成黑素的功能。然而，與之相反，一種公認(rèn)的黑素抑制劑白藜蘆醇是通過(guò)誘導(dǎo)自噬而抑制黑素刺激素所誘導(dǎo)的黑素合成，而敲除ATG5可顯著抑制白藜蘆醇介導(dǎo)的抗黑素生成以及其誘導(dǎo)的自噬[10]。波長(zhǎng)為585nm的發(fā)光二極管（light-emitting diode，LED）光調(diào)能通過(guò)誘導(dǎo)黑素細(xì)胞的自噬而抑制黑色素生成，并與光的劑量呈劑量依賴(lài)性[11]。此外，抑制黑素小體在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)也可以誘導(dǎo)自噬并降解黑素，以茶堿作用于黑素細(xì)胞或下調(diào)黑素體運(yùn)輸?shù)牡鞍踪|(zhì)的表達(dá)，可觀察到酪氨酸酶表達(dá)水平顯著下降，以及LC3Ⅱ表達(dá)增高和p62表達(dá)下降[12]。白癜風(fēng)患者皮損旁的黑素細(xì)胞所顯示的自噬標(biāo)記物L(fēng)C3Ⅱ高表達(dá)，底物p62低表達(dá)以及酪氨酸酶活性的下降，提示白癜風(fēng)皮損旁的黑素細(xì)胞自噬激活可能與其黑素合成功能的下降有關(guān)。

現(xiàn)有的證據(jù)表明自噬有助于黑素細(xì)胞穩(wěn)定自身的氧化還原穩(wěn)態(tài)，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，自噬缺陷的黑素細(xì)胞對(duì)于紫外線(xiàn)照射后產(chǎn)生的氧化損傷以及黑素細(xì)胞的早衰起著一定作用[13]，Atg7缺失的黑素細(xì)胞顯示有明顯的生長(zhǎng)停滯、氧化損傷和多功能適配蛋白p62的堆積[13]。在白癜風(fēng)的發(fā)病中，氧化應(yīng)激損傷可能是導(dǎo)致黑素細(xì)胞功能損傷及黑素細(xì)胞丟失的一個(gè)重要因素[2]，氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的活性氧和活性氮是維持自噬的主要細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子[14]。因此，我們推測(cè)本研究所顯示的體外培養(yǎng)白癜風(fēng)黑素細(xì)胞所呈現(xiàn)的自噬增高可能是黑素細(xì)胞穩(wěn)定自身氧化還原平衡，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷的一種自身保護(hù)機(jī)制。自噬在白癜風(fēng)發(fā)病中的作用可能與黑素細(xì)胞氧化還原平衡破壞有關(guān)[15]。但其詳細(xì)機(jī)制還需進(jìn)一步的研究闡明。

綜上所述，來(lái)自于泛發(fā)型白癜風(fēng)皮損旁的黑素細(xì)胞呈現(xiàn)有自噬通路的激活同時(shí)伴有黑素形成所需的酪氨酸酶活性降低，提示黑素細(xì)胞中自噬的活化可能與黑素細(xì)胞功能異常及白癜風(fēng)的發(fā)病有關(guān)，推測(cè)自噬的增高可能是機(jī)體對(duì)于氧化還原失衡的一種自身保護(hù)機(jī)制?；诒狙芯康臉颖玖枯^少，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量研究證實(shí)，同時(shí)自噬在白癜風(fēng)發(fā)病中的具體作用也需進(jìn)一步的研究闡明。