一種新型DNA納米結(jié)構(gòu)的構(gòu)建與結(jié)晶

呂家臻， 黃 震

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 成都610065)

1 引 言

DNA不僅可以作為遺傳信息的載體， 還可以作為納米材料．核酸納米材料在生物傳感器、活細(xì)胞成像、生物遞送系統(tǒng)等領(lǐng)域中得到了廣泛地應(yīng)用[1]．目前在藥物遞送系統(tǒng)中， 核酸納米材料已經(jīng)成為了不可或缺的一部分， 如DNA正面體可以用來遞送核酸藥物和小分子藥物等[1]．19世紀(jì)80年代， Seeman 提出了分支DNA技術(shù)， 為二維和三維核酸納米材料的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)[2]．分支DNA的靈感來源于生命體內(nèi)的一些特殊的DNA結(jié)構(gòu)， 如復(fù)制叉的三臂結(jié)構(gòu)， Holliday的四臂結(jié)構(gòu)[2]．DNA納米材料的構(gòu)建主要有三種方法：基于黏性末端的構(gòu)建， 單鏈DNA的堆砌和DNA折紙術(shù)[3-4]．雖然， 構(gòu)建DNA納米材料的技術(shù)越來越成熟， 但是目前得到核酸納米材料的結(jié)構(gòu)大都沒法精確測定， 主要是由于在高濃度條件下， DNA鏈容易聚集成高聚體的副產(chǎn)物而不是目標(biāo)DNA納米結(jié)構(gòu)[5]．所以常用的DNA納米結(jié)構(gòu)檢測方法是凝膠電泳分析和原子力顯微鏡(AFM)， 隨著近年來冷凍電鏡技術(shù)(cryo EM)的飛速發(fā)展， 一些尺寸較大的DNA納米材料也可以用冷凍電鏡來進(jìn)行表征[6]．但是這些技術(shù)手段只能觀察到DNA納米材料的表面形貌， 沒辦法觀察到DNA納米材料的精確結(jié)構(gòu)以及原子間的相互作用．只有真正了解了原子間的相互作用才能更好地理解DNA納米結(jié)構(gòu)的形成和應(yīng)用， 包括更有效地設(shè)計(jì)DNA納米結(jié)構(gòu)．這樣才能有利于在不影響DNA納米結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性下設(shè)計(jì)合適的藥物分子結(jié)合位點(diǎn)．而X射線晶體衍射法為DNA納米材料的解析提供了一個(gè)強(qiáng)有力的手段[7]．

眾所周知， 得到高質(zhì)量的單晶和相位的確定一直是結(jié)構(gòu)生物學(xué)中的兩大難題[8-9]．硒核酸已經(jīng)被許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)在晶體生長和相位確定中具有很大的優(yōu)勢[10-11]．硒原子和氧原子屬于同族元素， 具有相似的性質(zhì)．硒原子通過取代氧原子可被引入核酸且對(duì)核酸結(jié)構(gòu)幾乎沒有影響[12]．核苷酸中不同位置的硒修飾包括堿基和糖環(huán)都可以通過化學(xué)有機(jī)合成得到大量純度較高的亞磷酰胺單體．得到的硒修飾的亞磷酰胺單體再通過DNA固相合成得到較大量的硒代核酸， 并可通過高效液相色譜(HPLC)純化的得到純度較高的硒核酸[10]．得到的硒核酸便可以用于DNA納米結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究．為了提高該DNA納米結(jié)構(gòu)的晶體質(zhì)量和對(duì)其相位的確定， 對(duì)該Holliday基序中的一條核酸鏈的進(jìn)行硒代修飾， 得到了硒代修飾的DNA納米結(jié)構(gòu)， 同時(shí)也生長出了相應(yīng)的高質(zhì)量單晶．此外， 該DNA納米結(jié)構(gòu)容易生長成為較大的單晶， 有希望應(yīng)用于中子衍射研究[13]．

2 材料與方法

2.1 材 料

天然的亞磷酰胺單體購于GenePharm公司．2SeT亞磷酰胺單體由硒核酸研究所提供．天然的DNA寡核苷酸(Nat-DNA oligos)購于生工公司.Nat-DNA oligos購于生工公司并采用HPLC純化.

2.2 方 法

2.2.1 Nat-DNA oligos和2SeT-d DNA oligo Nat-DNA oligos和2SeT-d DNA oligo樣品的質(zhì)譜分析由生工公司提供．2SeT-d DNA oligo合成和純化．采用DNA固相合成的方法， 從3′端向5′端化學(xué)合成得到大量的2SeT修飾的DNA oligo．將干燥過的2SeT亞磷酰胺單體和天然的pac-dA， dC， dT亞磷酰胺單體分別用溶解乙腈溶解；pac-dG在用溶解乙腈溶解的同時(shí)需要額外加入25%的無水甲苯， 劇烈震蕩使其溶解．稱取33 mg的universal-CPG beads于合成柱中， 設(shè)置好DNA合成儀的參數(shù)后， 輸入要合成的2SeT修飾的DNA 序列 82SeT-d， 并選擇不脫掉5′端的最后一個(gè)亞磷酰胺單體的DMTr， 開始合成2SeT修飾的DNA oligo， 合成過程中觀察每一步亞磷酰胺單體脫掉5′保護(hù)基團(tuán)DMTr時(shí)的顏色， 顏色的深淺反應(yīng)合成效率的高低.合成結(jié)束后采用超溫和脫保護(hù)的方法來純2SeT修飾的DNA oligos．將上一步得到的載有DNA oligo的 beads轉(zhuǎn)移到2 mL的離心管中， 向離心管加入1 mL的含有0.05 mol/L的甲醇溶液， 室溫(25 ℃)反應(yīng)過夜(12 h)， 此時(shí)DNA 已經(jīng)從beads上斷裂溶解到甲醇溶液中， 離心將上清液經(jīng)0.22 μm的濾頭轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的2 mL離心管中， 并用1 mL的超純水涮洗beads 三次， 每次0.333 mL， 將三次涮洗后的超純水也都經(jīng)濾頭轉(zhuǎn)移到和裝上清液的同一個(gè)離心管中， 混勻.將以得到的約2 mL的樣品分成兩份轉(zhuǎn)移1 mL到另一個(gè)新的2 mL的離心管．用注射器的針頭將上述兩個(gè)裝有1 mL樣品的離心管蓋戳空并用液氮凍實(shí)， 將其放入冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥至體積到0.5 mL以下， 取出樣品放入4 ℃冰箱， 用裝有C18反向柱的HPLC純化．在buffer A(20 mmol/L 三乙胺乙酸鹽)， buffer C(20 mmol/L三乙胺乙酸鹽， 50%乙腈)的梯度轉(zhuǎn)換下， 大約條件中30%乙腈的時(shí)候， 帶有DMTr的DNA oligos 被洗脫出來， 用50 mL的離心管收集樣品， 將收集到的樣品冷凍干燥至全干．用 1 mL的10%的乙酸， pH 4.0～4.5 分3次刷洗50 mL離心管， 將洗脫下來的約1 mL 的樣品放在40 ℃下反應(yīng)2～2.5 h 去掉DNA 5′端的保護(hù)基團(tuán)DMTr．反應(yīng)結(jié)束后， 調(diào)樣品的pH≈7， 并用等體積的三氯甲烷萃取樣品中去掉的DMTr 3次．將經(jīng)萃取后的樣品經(jīng)過C18的脫鹽柱除掉樣品中的鹽分， 最后濃縮得到大量較純的2SeT修飾的DNA oligos．純化得到的DNA序列信息和質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)見表1．

表1DNAoligos的序列信息和電噴霧質(zhì)譜檢測數(shù)據(jù)

Tab.1SequenceinformationandelectrosprayionizationmassspectrometrydataofDNAoligos

StrandsSequence (5′-3′)Calculated M/ZMeasured M/Z [M-H+]-sGAGCAGCCTGTACGGACATCA6 440.26 440.4mACACCGTACACCCGTACACCGT6 320.16 319.3aGCGCTACGGACATCA4 562.04 562.5bGCGCGTACACCGTA4 248.84 249.0cGAGCAGCCTGTAC3 959.63 960.0dTCTGATGTGGCTGC4 285.84 285.482SeT-dTCTGATG (2SeT) GGCTGC4 348.84 348.4

2.2.2 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 配制10×的TAE/Mg2+buffer: 400 mmol/L Tris，20 mmol/L EDTA, 200 mmol/L冰乙酸， 和125 mmol/L氯化鎂， 調(diào)pH 8.0， 將10×的TAE/Mg2+buffer 稀釋至1×用于電泳緩沖液．將各個(gè)DNA鏈稀釋至30 μmol/L， 10 μL DNA三角形反應(yīng)體系包括：3 μL a鏈， 3 μL s鏈， 1 μL m鏈， 2 μL ddH2O和1 μL 10×TAE/Mg2+buffer．10 μL DNA二聚體納米結(jié)構(gòu)反應(yīng)體系包括：2 μL a鏈， 2 μL b鏈， 2 μL c鏈， 2 μL d鏈， 1 μL ddH2O和1 μL 10×TAE/Mg2+buffer．10 μL單鏈反應(yīng)體系：3 μL單鏈， 6 μL ddH2O， 1 μL 10×TAE/Mg2+buffer．將上述反應(yīng)體系置于95 ℃， 2 min, 讓其自然冷卻至室溫．取上述10 μL反應(yīng)體系中的2 μL加到配制好的12%的PAGE， 在冰水浴中或者4 ℃條件下150 V 電泳40 min．

2.2.3 Nat-DNA納米結(jié)構(gòu)和82SeT-d-DNA納米結(jié)構(gòu)晶體生長 用懸滴法來生長DNA納米結(jié)構(gòu)晶體， 5～10 μL的液滴包括：0.1 mmol/L DNA納米結(jié)構(gòu)， 30 mmol/L二甲基砷酸鈉(pH 6.5)， 50 mmol/L氯化鎂， 50 mmol/L硫酸銨， 5 mmol/L乙酸鎂和25 mmol/L Tris (pH 8.5) ．液滴置于24孔板中， 加0.6 mL的硫酸銨作為池液， 在16 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～6 d即可得到天然的DNA納米結(jié)構(gòu)和2Se-dT修飾的DNA納米結(jié)構(gòu)晶體．

3 結(jié)果與分析

3.1 DNA納米結(jié)構(gòu)的構(gòu)建

目前利用X-射線晶體衍射法解析出來的DNA納米材料的晶體結(jié)構(gòu)屈指可數(shù)．自組裝DNA三角形是較早利用X-射線晶體衍射法解析出來的DNA納米結(jié)構(gòu)[14-16]．該DNA三角形利用Holliday基序作為拐角， 通過一條單鏈DNA將三條邊固定在一起(圖1A)．對(duì)DNA三角形進(jìn)行改造， 將其拐角處的Holliday基序截?cái)啵?并引入黏性末端到該Holliday基序中(圖1B)， 使其能夠自組裝成為一種DNA納米結(jié)構(gòu)， 該基序可能形成一種二聚體DNA納米結(jié)構(gòu)或是一種三聚體的DNA三角形結(jié)構(gòu)(圖1C， 圖1D)．通過對(duì)該DNA納米結(jié)構(gòu)中的d鏈進(jìn)行硒代修飾(圖1E)， 來幫助其晶體的生長和結(jié)構(gòu)解析中相位的確定， 希望能對(duì)該新型的DNA納米結(jié)構(gòu)進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析， 以便發(fā)現(xiàn)該新型DNA納米結(jié)構(gòu)和該Holliday基序組裝的三維結(jié)構(gòu)， 從而更深入地認(rèn)識(shí)DNA納米材料的組裝規(guī)律．

3.2 8-2SeT-d DNA oligo的純化和質(zhì)譜檢測

利用HPLC來純化5′端帶有DMTr的2SeT-d DNA oligo．由于5′端帶有DMTr的2SeT-d DNA oligo極性較5′端沒有DMTr的DNA小， 可以利用C18的反向柱進(jìn)行分離純化， 用極性較大的水和極性較小的乙腈作為緩沖溶劑， 緩沖液在30 min內(nèi)從15%的乙腈轉(zhuǎn)變?yōu)?0%的乙腈．所以5′端沒有DMTr的DNA也就是合成反應(yīng)中的非目的產(chǎn)物就會(huì)率先從C18反向柱中洗脫下來， 大概3～5 min被洗脫下來而．5′端帶有DMTr的2SeT-d DNA oligos則會(huì)在更小的極性條件下(大概30%的乙腈)被洗脫下來．82SeT-d DNA oligo在19.4 min被洗脫下來(如圖2A)， 最后純化得到0.1～0.2 μmol的82SeT-d DNA oligo, 足以用于DNA三角形晶體生長實(shí)驗(yàn)．此外， 最后對(duì)82SeT-d DNA oligo進(jìn)行電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)檢測來驗(yàn)證硒原子是否穩(wěn)定存在于DNA oligo 中， 測得82SeT-d DNA oligo的荷質(zhì)比為4 348.4 (如圖2B， 表1)， 而通過計(jì)算得到的荷質(zhì)比為4 348.8．可以認(rèn)為成功合成了82SeT-d DNA oligo， 且純度較高．

圖1 DNA 納米結(jié)構(gòu)的構(gòu)建

A.DNA三角形的序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)；B．將DNA三角形結(jié)構(gòu)中Holliday基序截?cái)嗖⒁隒GCG黏性末端；C．帶有黏性末端的Holliday基序通過三次重復(fù)組裝成為一個(gè)三聚體的DNA三角形結(jié)構(gòu)；D．帶有黏性末端的Holliday基序通過兩次重復(fù)組裝成一個(gè)二聚體的DNA納米結(jié)構(gòu)；E．2SeT 在d鏈中修飾的位置

Fig.1 Construction of DNA nanostructure

A.Secondary structure of DNA triangle；B．Holliday motifs in DNA triangle structure were truncated and introduced into CGCG sticky ends；C．Holliday motif with a sticky end is assembled into a triangular DNA structure by three repetitions；D．Holliday motif with a sticky end is assembled into a dimer DNA nanostructure by two repetitions；E．2SeT modification site in strand d

圖 2 82SeT-d DNA oligos的HPLC純化峰圖和電噴霧質(zhì)譜檢測圖Fig.2 HPLC purified peak map and electrospray mass spectrometric map of 82SeT-d DNA oligos

圖 3 DNA 三角形和DNA納米結(jié)構(gòu)的非變性凝膠電泳

1：DNA Ladder；2：d鏈；3：s鏈；4：m鏈；5：d鏈+s鏈+m鏈， 即DNA三角形；6：a鏈；7：b鏈；8：c鏈；9：a鏈+b鏈+c鏈+d鏈， 即DNA二聚體納米結(jié)構(gòu)；10：DNA三角形

Fig. 3 Nondenaturing gel electrophoresis of DNA triangular and DNA nanostructures

1：20 bp DNA Ladder；2：Strand d；3：Strand s；4：Strand m；5：Strand d + Strand s + Strand m， namely DNA triangle；6：Strand a；7：Strand b；8：Strand c；9：Strand a + Strand b + Strand c + Strand d， namely DNA dimer nanostructure；10：DNA triangle

3.3 DNA三角形和DNA二聚體納米結(jié)構(gòu)的凝膠電泳分析

用酶標(biāo)儀對(duì)組成DNA三角形的三條鏈d， s， m和組成DNA二聚體納米結(jié)構(gòu)的四條鏈a， b， c， d進(jìn)行定量， 將它們都稀釋到30 μmol/L, 將d∶s∶m 按3∶3∶1， a∶b∶c∶d按1∶1∶1∶1混合反應(yīng)， 并加入退火緩沖液從95 ℃退火至室溫后， 進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳， 且凝膠電泳要在低溫下進(jìn)行．凝膠電泳檢測的DNA三角形條帶和DNA二聚體納米結(jié)構(gòu)條帶如(圖3)， 可以看出， DNA三角形條帶的凝膠遷移速率比DNA二聚體納米結(jié)構(gòu)的遷移速率要小， 這說明角單元并沒有組裝成一個(gè)更大的三聚體DNA三角形， 而是形成了一個(gè)更小的聚合物可能是二聚體的DNA納米結(jié)構(gòu)也可能只是一個(gè)DNA單體．DNA三角形的大小是126 nt， DNA二聚體納米結(jié)構(gòu)的大小為112 nt， 而該DNA單體則是56 nt．從DNA三角形凝膠電泳條帶和Marker的位置來分析， 該角單元應(yīng)該是組裝成為了一個(gè)112 nt 的DNA二聚體納米結(jié)構(gòu)， 而不是一個(gè)56 nt 的DNA單體結(jié)構(gòu)．

3.4 天然的DNA二聚體納米結(jié)構(gòu)和硒代的DNA二聚體納米結(jié)構(gòu)的結(jié)晶

對(duì)Nat-DNA二聚體納米結(jié)構(gòu)和82SeT-d-DNA二聚體納米結(jié)構(gòu)進(jìn)行晶體生長研究．將Nat-DNA二聚體納米結(jié)構(gòu)和82SeT-d-DNA二聚體納米結(jié)構(gòu)分別和結(jié)晶緩沖液混勻后， 用懸滴法在16 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～6 d， 即可得到相應(yīng)的DNA二聚體納米結(jié)構(gòu)晶體．結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 不管是Nat-DNA二聚體納米結(jié)構(gòu)還是82SeT-d-DNA二聚體納米結(jié)構(gòu)都會(huì)生長成質(zhì)量較高的立體晶體(圖4)．方塊狀的晶體大小都在200 μm左右， 立體性較好而且晶體表面較光整， 能夠用于x-射線晶體衍射進(jìn)行結(jié)構(gòu)測定， 并有希望得到較高分辨率的晶體結(jié)構(gòu)；同時(shí)得到了2SeT-DNA二聚體納米結(jié)構(gòu)晶體， 可以很容易進(jìn)行相位確定， 幫助DNA二聚體納米結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)解析．

圖 4 Nat-DNA二聚體納米結(jié)構(gòu)和2SeT-DNA二聚體納米結(jié)構(gòu)

4 討 論

以前的實(shí)驗(yàn)研究表明硒原子在一定程度上能夠幫助晶體生長和得到高分辨率的晶體結(jié)構(gòu)[10]．硒原子具有比氧原子更強(qiáng)的非極性， 從而在晶體生長的過程中能夠把周圍的一些水分子給擠出結(jié)構(gòu)外， 從而使核酸結(jié)構(gòu)的堆積的更加緊密， 能增加分子之間的相互作用， 幫助晶體的生長[11]．通過合理的引入硒原子到DNA二聚體納米結(jié)構(gòu)中也得了質(zhì)量較高的單晶， 有希望獲得高分辨率的DNA納米結(jié)構(gòu)．本文通過對(duì)DNA三角形進(jìn)行改造， 并合理的引入黏性末端到雙交叉DNA Holliday基序上， 成功構(gòu)建了一種新型的DNA二聚體納米結(jié)構(gòu)， 為DNA納米結(jié)構(gòu)的構(gòu)建提供一種很好的策略．

總之， 通過對(duì)DNA三角形的改造成功地構(gòu)建了一種新型DNA納米結(jié)構(gòu)．該DNA二聚體納米結(jié)構(gòu)的晶體生長實(shí)驗(yàn)中， 發(fā)現(xiàn)該DNA二聚體納米結(jié)構(gòu)能夠生長成單晶， 說明該結(jié)構(gòu)能夠以較高的純度穩(wěn)定存在．從凝膠電泳的分析中發(fā)現(xiàn)， 該DNA納米結(jié)構(gòu)甚至比之前的DNA三角形產(chǎn)率更高， 結(jié)構(gòu)可能更穩(wěn)定， 更有利于解析得到高分辨的晶體結(jié)構(gòu)， 以便發(fā)現(xiàn)該新型DNA納米二聚體結(jié)構(gòu)和該Holliday基序組裝的三維結(jié)構(gòu)， 從而更深入地認(rèn)識(shí)DNA納米材料的組裝規(guī)律， 為以后的DNA納米結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)和優(yōu)化奠定結(jié)構(gòu)信息基礎(chǔ)．此外， 通過硒原子的引入可以幫助得到更多的高質(zhì)量核酸晶體以及核酸的結(jié)構(gòu)解析， 為DNA納米結(jié)構(gòu)領(lǐng)域提供更多的信息， 幫助優(yōu)化并完善DNA納米結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)．