嘌呤能離子通道型受體7及其在周?chē)窠?jīng)再生中的作用

何宛俞，黃積根，鄧禮勤，丁林威，張全鵬

1.海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院16級(jí)生物技術(shù)本科班，海南 ?？?571199；2.海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院17級(jí)生物技術(shù)本科班，海南 ?？?571199；

3.海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院18級(jí)生物技術(shù)本科班，海南 ?？?571199；

4.海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院解剖學(xué)教研室，海南 ?？?571199；

5.海南省熱帶腦科學(xué)研究與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571199

嘌呤能離子通道型受體7 (purinergic ligand-gated ion channel 7 receptor，P2X7R)是嘌呤受體的一個(gè)亞型，是腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)門(mén)控的非選擇性離子通道[1]，在P2XR家族中，P2X7R在炎癥細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞的激活中起著重要作用[2]。

1 P2X7R的結(jié)構(gòu)和分布

P2X受體家族是由胞外ATP激活的離子化陽(yáng)離子通道，允許陽(yáng)離子如Ca2+、K+和Na+通過(guò)，ATP-P2X信號(hào)能使胞外Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致神經(jīng)組織中的離子遷移與細(xì)胞死亡[3]。人類(lèi)P2X7R 定位于染色體12q24，由P2X7基因編碼P2X7R，其含有13 個(gè)外顯子，由595 個(gè)氨基酸殘基組成，有3 個(gè)同源亞基，每個(gè)亞基含有兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域環(huán)和一個(gè)糖基化的胞外環(huán)，胞外環(huán)上有ATP結(jié)合位點(diǎn)，胞內(nèi)含有一個(gè)長(zhǎng)鏈羧基端(C 端)和一個(gè)短鏈氨基端(N 端)，其中C 端為P2X7R 主要的功能結(jié)構(gòu)域[4]。這種受體主要表達(dá)于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞[5]和哺乳類(lèi)動(dòng)物神經(jīng)節(jié)中的衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞[6]。

2 P2X7R的功能

2.1 P2X7R促神經(jīng)生長(zhǎng)和促細(xì)胞增殖的作用 正常情況下，胞外ATP的濃度受到胞外ATP酶和ADP酶的嚴(yán)格調(diào)控，其濃度一直處于低水平[7]。神經(jīng)細(xì)胞受到損傷后釋放ATP，促進(jìn)周?chē)窠?jīng)再生軸突定向的生長(zhǎng)、促進(jìn)再生軸突成熟、保護(hù)脊髓神經(jīng)元和預(yù)防失神經(jīng)支配的肌肉萎縮[8]。ATP-P2X7R 可通過(guò)MAPK/ERK 胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)細(xì)胞的增殖[9]。MAPK/ERK 通路通過(guò)多種磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。同時(shí)有研究表明，周?chē)窠?jīng)損傷后，ATP 促進(jìn)雪旺細(xì)胞的增殖，在受損神經(jīng)形成Büngner帶，促進(jìn)軸突的生長(zhǎng)和伸長(zhǎng)[10]，干擾P2X7R基因促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖[7]。shRNA抑制P2X7R基因抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡，間接提示P2X7R有促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活功能[11]。

2.2 P2X7R 與細(xì)胞損傷 細(xì)胞受到損傷時(shí)可引起P2X7R膜的通透性發(fā)生改變，如在低濃度的二價(jià)陽(yáng)離子環(huán)境下，經(jīng)過(guò)高濃度激動(dòng)劑的長(zhǎng)時(shí)間或反復(fù)刺激，P2X7R的膜通透性會(huì)發(fā)生改變，陽(yáng)離子通道轉(zhuǎn)變?yōu)榉沁x擇性的膜通道，可通透分子量達(dá)900 kDa左右的分子和離子[如：熒光素黃(lucifer yellow)、溴化乙錠等]。分子量較大的有機(jī)陽(yáng)離子可通過(guò)這種通道進(jìn)入細(xì)胞，改變了離子通透性，誘導(dǎo)細(xì)胞骨架重排，最終導(dǎo)致細(xì)胞溶胞死亡[12-13]。神經(jīng)細(xì)胞受損會(huì)導(dǎo)致ATP 的濃度增高，P2X7R膜孔形成，表達(dá)P2X7R的鄰近細(xì)胞死亡，最終導(dǎo)致壞死細(xì)胞的數(shù)量增高[14]。在P2X7R介導(dǎo)下，膠質(zhì)細(xì)胞釋放出的ATP作為神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞通訊中的信號(hào)分子，膠質(zhì)細(xì)胞受ATP刺激，其形態(tài)發(fā)生改變，P2X7R表達(dá)增加，在ATP持續(xù)刺激作用下可導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡，從而阻止炎癥反應(yīng)的持續(xù)存在[15]。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，活化的Akt會(huì)通過(guò)磷酸化細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)來(lái)介導(dǎo)下游應(yīng)答，包括細(xì)胞的存活、生長(zhǎng)、增殖、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過(guò)程[16]。當(dāng)膠質(zhì)細(xì)胞受到損傷時(shí)，釋放的ATP作用于膠質(zhì)細(xì)胞上的P2X7R，使P2X7R活化，釋放谷氨酸和ATP，調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性[17-18]。ATP的釋放可使膠質(zhì)細(xì)胞中細(xì)胞因子表達(dá)增強(qiáng)，膠質(zhì)細(xì)胞間隙連接參與了神經(jīng)保護(hù)過(guò)程，特別是谷氨酸毒性引起的損傷和保護(hù)神經(jīng)元免受氧化應(yīng)激[19]。ATP通過(guò)肥大細(xì)胞釋放組胺、前列腺素，通過(guò)免疫細(xì)胞產(chǎn)生和釋放細(xì)胞因子來(lái)參與炎癥的發(fā)展[20]。

2.3 小結(jié) 有證據(jù)表明，當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞受到損傷后，其分泌的ATP 會(huì)作用于膠質(zhì)細(xì)胞膜上的P2X7R，形成ATP-P2X7R信號(hào)通路，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞軸突的生長(zhǎng)和伸長(zhǎng)，促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)[6]。同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道，膠質(zhì)細(xì)胞受到損傷后也會(huì)分泌ATP，促使膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生形變，P2X7R 的表達(dá)升高，最終導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞死亡[15]。ATP的釋放可以使膠質(zhì)細(xì)胞上的細(xì)胞因子的表達(dá)升高，可保護(hù)神經(jīng)元免受氧化應(yīng)激和谷氨酸毒性介導(dǎo)的細(xì)胞損傷[19]。因此，P2X7R 在周?chē)窠?jīng)再生中的功能尚未完全明確。

3 P2X7R 在周?chē)窠?jīng)再生中具體作用的研究方法

在活體動(dòng)物模型中，可以通過(guò)P2X7R基因敲除來(lái)使機(jī)體分泌細(xì)胞因子和能力下降，緩解炎癥反應(yīng)[21-22]，但敲除P2X7R基因仍能夠檢測(cè)到該蛋白的陽(yáng)性表達(dá)[23]。在研究腫瘤細(xì)胞時(shí)，可以通過(guò)shRNA轉(zhuǎn)染抑制P2X7R基因表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖能力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。在研究正常的在體細(xì)胞時(shí)，將P2X7R-shRNA 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至靶細(xì)胞，抑制P2X7R 蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，提高細(xì)胞增殖活性；還可以采用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定干擾P2X7R基因，該基因被抑制后，細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖活性明顯升高[7]。而P2X7R抑制劑BBG和激動(dòng)劑2'(3')-O-(4-苯甲?；?腺苷5'-三磷酸三乙基銨鹽(Bz ATP)也是研究P2X7R功能丟失和功能獲取后觀察其功能的一種常用方法。P2X7R 抑制劑有Briliant Blue G(BBG)、AZD9056、A438079、CE224 和535[24]、oxidized ATP[25-26]，其中BBG是最常用的抑制劑，P2X7R激動(dòng)劑有Bz ATP、ATP、2-MeSATP、α,β-meATP[27]，其中，研究P2X7受體功能最常用的激動(dòng)劑是Bz ATP。

4 P2X7R抑制劑BBG和激動(dòng)劑Bz ATP

4.1 BBG 的作用機(jī)理 P2X7 受體抑制劑BBG可拮抗抑制膠質(zhì)細(xì)胞上的P2X7R發(fā)生變構(gòu)，使ATP不能與其結(jié)合，中斷了ATP-P2X7R 的信號(hào)通路，使神經(jīng)細(xì)胞免受ATP誘發(fā)的興奮性損傷，減少炎性介質(zhì)的釋放，降低了細(xì)胞的死亡率[13，28]。P2X7受體活性通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞的存活和增殖，調(diào)節(jié)增殖和分化途徑，而抑制劑則可能導(dǎo)致分化和軸突的形成，抑制神經(jīng)元死亡率的增長(zhǎng)[3]。這個(gè)機(jī)制意味著當(dāng)ATP和P2X7R受體結(jié)合時(shí)，其他藥物就很難與該受體結(jié)合，也防止了受體和抑制劑的結(jié)合[29]。

4.2 BBG 的使用方法及優(yōu)缺點(diǎn) 在無(wú)菌條件下稱(chēng)取1.7 g BBG，加PBS 溶液溶解后調(diào)整濃度至100 mmol/L，于-20℃儲(chǔ)存，用時(shí)再稀釋成100 nmol/L濃度，可用于細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)[12]。也可用BBG 腹腔注射，劑量為5 mg/100 g[30]。BBG 具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)滲透壓和pH 值較穩(wěn)定，染色效果好；(2)不是熒光染料，不會(huì)產(chǎn)生光毒性；(3)染色所需要的濃度低；(4)是新型的生物染色劑，無(wú)生物毒性[31-33]。在配置BBG 時(shí)，微量的BBG 粉末需要用到大量的溶劑來(lái)進(jìn)行稀釋?zhuān)趯?shí)驗(yàn)中難以把控其劑量。

4.3 Bz ATP 的作用機(jī)理 Bz ATP 是最有效的P2X7受體激動(dòng)劑，Bz ATP誘導(dǎo)的痛覺(jué)過(guò)敏僅由P2X7受體激活介導(dǎo)其誘導(dǎo)劑量依賴(lài)性的機(jī)械超負(fù)荷[34]。ATP激活膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞膜上P2X7受體，形成非選擇性陽(yáng)離子通道，這時(shí)K+、Na+和Ca2+等離子跨膜性流動(dòng)具有很強(qiáng)的選擇性，在這一環(huán)境下P2X7 受體的激活使離子通道擴(kuò)張，形成可以允許分子量達(dá)900 kDa 左右的分子和離子通過(guò)的孔道，大分子物質(zhì)可順利通過(guò)并改變細(xì)胞的功能狀況，其始動(dòng)環(huán)節(jié)是ATP 介導(dǎo)P2X7受體構(gòu)象發(fā)生了改變，形成離子通道[35-36]。

4.4 Bz ATP 的使用方法及優(yōu)缺點(diǎn) 在無(wú)菌條件下，5 mg Bz ATP加入PBS溶液，調(diào)整濃度至1 mmol/L，于-20℃儲(chǔ)存，用時(shí)再稀釋成100 μmol/L 濃度[12]。Bz ATP 腹 腔 注 射 的 劑 量 為5 μg[30]。P2X7R 激 動(dòng) 劑Bz ATP(100 μmol/L)刺激細(xì)胞后，在增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平和遷移的同時(shí)，既不影響細(xì)胞增殖，也不引起膜孔開(kāi)放[37]。P2X7受體激動(dòng)劑效價(jià)最好的是Bz ATP，該物質(zhì)是穩(wěn)定的ATP類(lèi)似物，其效價(jià)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于ATP，其激活人和大鼠P2X7受體的效能是ATP的50倍[38-39]。機(jī)體的損傷可引起P2X7R活化，神經(jīng)細(xì)胞釋放大量的ATP，作用于衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞上的P2X7R并使其活化。P2X7R活化機(jī)制如下：(1)通過(guò)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的胞吐機(jī)制從神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)出ATP，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的K+和Ca2+的遷移；(2)神經(jīng)細(xì)胞釋放ATP，其作用于衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞上的P2X7R并使其活化，促進(jìn)炎癥介質(zhì)的釋放；(3)炎癥介質(zhì)的釋放直接或間接使細(xì)胞損傷、死亡和凋亡[40-41]。

5 展望

蛋白的功能可以通過(guò)其激動(dòng)劑和抑制劑的干預(yù)來(lái)達(dá)到研究目的，還可以通過(guò)基因敲除來(lái)消除或減弱該蛋白的表達(dá)以及通過(guò)轉(zhuǎn)染的方式來(lái)增強(qiáng)該蛋白的表達(dá)。但是在體動(dòng)物的模型研究中，發(fā)現(xiàn)機(jī)體的P2X7R基因并不可以完全的敲除掉，但P2X7R的基因敲除可以減弱ATP-P2X7R 信號(hào)通路而引起的炎性反應(yīng)。衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的相互作用的機(jī)制復(fù)雜，目前尚不完全闡明清楚，本文為研究衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞P2X7R在神經(jīng)再生中的具體功能提供方法學(xué)支持。