LncRNA　CCAT2/miR-145/p70S6K1分子軸調(diào)控口腔鱗癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移

陸偉　王永武　淦岷　段青云

[摘要] 目的 研究長(zhǎng)鏈非編碼RNA CCAT2（CCAT2）、microRNA-145（miR-145）和p70S6K1在口腔鱗細(xì)胞癌（Oral squamous cell carcinoma，OSCC）組織中的表達(dá)水平，并探討CCAT2/miR-145/p70S6K1分子軸對(duì)OSCC細(xì)胞侵襲遷移的影響。 方法 收集2018年1月～2019年6月在我院進(jìn)行手術(shù)治療的52對(duì)OSCC組織和癌旁正常組織，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CCAT2、miR-145和p70S6K1的相對(duì)表達(dá)水平。敲低OSCC細(xì)胞中CCAT2和p70S6K1的表達(dá)，并通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)OSCC細(xì)胞侵襲遷移的改變。 結(jié)果 CCAT2和p70S6K1在OSCC組織中表達(dá)顯著高于癌旁正常組織（P<0.05），而miR-145在OSCC組織中表達(dá)顯著低于癌旁正常組織（P<0.05）。雙熒素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，miR-145靶向抑制OSCC細(xì)胞中CCAT2和p70S6K1的表達(dá)。敲低CCAT2抑制OSCC細(xì)胞體外遷移和侵襲，抑制miR-145和促進(jìn)p70S6K1的表達(dá)，而miR-145-inhibitor上調(diào)敲低CCAT2的OSCC細(xì)胞中p70S6K1的表達(dá)。此外，敲低p70S6K1抑制OSCC細(xì)胞體外遷移和侵襲。 結(jié)論 LncRNA CCAT2/miR-145/p70S6K1可以調(diào)控OSCC細(xì)胞侵襲遷移，在OSCC體內(nèi)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用，是治療OSCC的潛在靶點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞] 長(zhǎng)鏈非編碼RNA CCAT2;miR-145;p70S6K1;口腔鱗癌

[中圖分類(lèi)號(hào)] R739.8 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-9701（2020）30-0053-05

LncRNA CCAT2/miR-145/p70S6K1 molecular axis regulates invasion and metastasis of oral squamous cell carcinoma

LU Wei ? WANG Yongwu ? GAN Min ? DUAN Qingyun

Department of Stomatology， Affiliated Hangzhou First People's Hospital， Zhejiang University School of Medicine， Hangzhou ?310006， China

[Abstract] Objective To research the expression level of long noncoding RNA CCAT2（CCAT2）， microRNA-145（miR-145） and p70S6K1 in oral squamous cell carcinoma（OSCC）， and investigate the impacts of CCAT2/miR-145/p70S6K1 molecular axis on invasion and migration of OSCC cells. Methods A total of 52 pairs of OSCC tissues and normal tissues adjacent to cancer from January 2018 to June 2019 were collected. The relative expression levels of CCAT2， miR-145 and p70S6K1 were detected by real-time fluorescence quantitative PCR. The expressions of CCAT2 and p70S6K1 in OSCC cells were knocked down， and the changes of invasion and migration of OSCC cells were detected by Transwell test. Results The expression levels of CCAT2 and p70S6K1 in OSCC were significantly higher than those in normal tissues adjacent to cancer（P<0.05）， while the expression of miR-145 in OSCC was significantly lower than that in normal tissues adjacent to cancer（P<0.05）. The results of double luciferase gene report showed that miR-145 targeted inhibited the expression levels of CCAT2 and p70S6K1 in OSCC cells. CCAT2 knockdown inhibited invasion and migration of OSCC cells in vitro， inhibited miR-145 and promoted the expression level of p70S6K1. Meanwhile， up-regulation of miR-145-inhibitor knocked down the expression level of p70S6K1 in OSCC cells with CCAT2. In addition， knocking down p70S6K1 inhibited invasion and migration of OSCC cells in vitro. Conclusion The LncRNA CCAT2/miR-145/p70S6K1 can regulate the invasion and migration of OSCC cells and play a role in the in vivo metastasis of OSCC， which is a potential target for the treatment of OSCC.

[Key words] Long noncoding RNA CCAT2; miR-145; p70S6K1; Oral squamous cell carcinoma

大部分口腔癌屬于鱗狀上皮細(xì)胞癌，即口腔鱗狀細(xì)胞癌（Oral squamous cell carcinoma，OSCC），約占頭頸部惡性腫瘤患者的90%[1]。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是OSCC最主要的臨床特點(diǎn)，也是OSCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的主要誘因[2]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA CCAT2（CCAT2）首次發(fā)現(xiàn)在大腸癌組織中，隨后被證實(shí)在卵巢癌、胃癌、宮頸癌及食道鱗狀細(xì)胞癌中異常，并且參與調(diào)控癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[3]。此外，劉英等[4]在OSCC組織中同樣發(fā)現(xiàn)CCAT2高表達(dá)，且與OSCC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但并未揭示CCAT2在OSCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的作用。以往研究已證實(shí)，CCAT2可以抑制癌細(xì)胞中miR-145的表達(dá)[5]，而p70S6K1是miR-145的靶基因[6-7]。本研究則進(jìn)一步探討CCAT2/miR-145/p70S6K1分子軸對(duì)OSCC細(xì)胞侵襲遷移的影響，為其應(yīng)用于OSCC治療提供較精準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018年1月～2019年6月在我院進(jìn)行手術(shù)治療的52對(duì)OSCC組織和癌旁正常組織。所有OSCC患者在收集組織前未進(jìn)行化療、放療或靶向治療。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，所有參與本研究的患者或其家屬對(duì)本研究?jī)?nèi)容知情。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR ?向組織或細(xì)胞中加入適量的RNAiso（TARAKA，Japan）以提取RNA。根據(jù)GoTaqR qPCR Master Mix試劑盒（promega，USA）說(shuō)明書(shū)制備20 μL RT-qPCR系統(tǒng)，并使用ABI 7500熒光定量PCR儀器進(jìn)行擴(kuò)增。以β-actin為內(nèi)參，用2-△t△t法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。見(jiàn)表1。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞轉(zhuǎn)染 ?在6孔板中接種1×106 SCC-154細(xì)胞;24 h后，按照LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑盒（ThermoFisher SCIENTIFIC，USA）說(shuō)明書(shū)所示的轉(zhuǎn)染步驟將miR-NC、miR-145-mimic、miR-145-inhibitor或小干擾RNA（si-NC、si-CCAT2-1、si-CCAT2-2、si-p70S6K1-1和si-p70S6K1-2）分別轉(zhuǎn)入SCC-154細(xì)胞內(nèi)。

1.2.3 Transwell細(xì)胞遷移與侵襲 ?Transwell小室（Thermo Fisher SCIENTIFIC，USA）被用于評(píng)估OSCC細(xì)胞增殖和遷移能力。取1×104個(gè)轉(zhuǎn)染后的SCC-154細(xì)胞接種到24孔Transwell的上室中，加無(wú)血清培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。24 h后，取出并去除培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次，然后加入甲醇固定30 min后干燥。干燥后的膜片經(jīng)結(jié)晶紫染色20 min后，在顯微鏡下計(jì)數(shù)下室細(xì)胞數(shù)目。

1.2.4 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) ?將野生型（WT）或突變型（MUT）的基因序列克隆到pmirGLO質(zhì)粒上以獲得pmirGLO- p70S6K1 WT/MUT和pmirGLO-CCAT2 WT/MUT，然后使用LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒與miR-NC、miR-145-inhibitor或miR-145-mimic一起轉(zhuǎn)入SCC-154細(xì)胞中。48 h后，根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒（碧云天生物，中國(guó)）說(shuō)明所述步驟檢測(cè)熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

研究數(shù)據(jù)由Grahpad Prism 5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。兩組差異比較使用t檢驗(yàn)，多組間通過(guò)單因素方差分析進(jìn)行差異比較;Pearson法用于分析兩組數(shù)據(jù)間的相關(guān)性，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA CCAT2在OSCC組織和細(xì)胞中表達(dá)升高

如圖1所示，CCAT2在52例OSCC組織中相對(duì)表達(dá)水平為（2.520±0.123）（t=12.013，P<0.001）（圖1A）;在TNM分期為Ⅰ+Ⅱ和Ⅲ+Ⅳ期OSCC組織中相對(duì)表達(dá)水平分別為（2.147±0.134）和（3.095±0.169）（t=4.433，P<0.001）（圖1B）;在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和未轉(zhuǎn)移OSCC組織中的相對(duì)表達(dá)水平分別為（3.287±0.153）和（2.129±0.124）（t=5.723，P<0.001）（圖1C）。此外，CCAT2 NOK細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著低于4種口腔鱗癌細(xì)胞系，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）（圖1D）。

2.2 敲低LncRNA CCAT2抑制OSCC細(xì)胞遷移和侵襲

如封三圖1所示，敲低CCAT2顯著抑制了遷移和侵襲的SCC-154細(xì)胞數(shù)目（P<0.001）。

2.3 LncRNA CCAT2與miR-145靶向結(jié)合

生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，CCAT2與miR-145具有相互結(jié)合的基因序列（圖2A）。qPCR結(jié)果顯示，miR-145在52例OSCC組織中相對(duì)表達(dá)水平是正常組織的（0.489±0.023）倍（t=12.170，P<0.001）（圖2B）;且miR-145在4種口腔鱗癌細(xì)胞高表達(dá)（圖2C）。Pearson法分析顯示，在52例OSCC組織中，CCAT2的相對(duì)表達(dá)水平與miR-145相對(duì)表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.545，P<0.001）（圖2D）;同樣，敲低CCAT2將顯著提高SCC-154細(xì)胞中miR-145的表達(dá)水平（t=12.790、12.350，均P<0.001）（圖2E）。熒光素基因報(bào)告系統(tǒng)顯示，在miR-145-mimic降低CCAT WT熒光素酶活性（t=11.563，P<0.001），而不影響CCAT MUT熒光素酶活性（t=0.912，P=0.413）（圖2F）。

2.4 LncRNA CCAT2通過(guò)miR-145在OSCC細(xì)胞中調(diào)節(jié)p70S6K1表達(dá)

生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，p70S6K1與miR-145具有相互結(jié)合的基因序列（圖3A）。p70S6K1在52例OSCC組織中相對(duì)表達(dá)水平是正常組織的（2.295±0.102）（t=12.092，P<0.001）（圖3B）;且經(jīng)Pearson法分析顯示，在OSCC組織中，p70S6K1的相對(duì)表達(dá)水平與miR-145相對(duì)表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.511，P<0.001）（圖3C）。此外，熒光素酶基因報(bào)告系統(tǒng)顯示：轉(zhuǎn)入miR-145-mimic降低p70S6K1 WT熒光素酶活性（t=10.071，P<0.001），而不影響p70S6K1 MUT熒光素酶活性（t=1.173，P=0.306）（圖3D）。此外，經(jīng)Pearson法分析顯示，在52例OSCC組織中，p70S6K1的相對(duì)表達(dá)水平與CCAT2相對(duì)表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.646，P<0.001）（圖3E）。敲低CCAT2可以降低p70S6K1的表達(dá)水平（t=13.201，P<0.001）;然而，相比較單獨(dú)轉(zhuǎn)入si-CCAT2，p70S6K1在共同轉(zhuǎn)入si-CCAT2和miR-145-inhibitorc的SCC-154細(xì)胞中表達(dá)更高（t=11.352，P<0.001）（圖3F）。

2.5 敲低p70S6K1抑制OSCC細(xì)胞遷移和侵襲

敲低p70S6K1可顯著抑制遷移和侵襲的SCC-154細(xì)胞數(shù)目，經(jīng)單因素方法分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。見(jiàn)封三圖2。

3 討論

盡管lncRNA不編碼蛋白，但近年研究證實(shí)LncRNA可以通過(guò)對(duì)靶基因的調(diào)控而參與調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)行為[8]。近年來(lái)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的LncRNA與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)，且研究發(fā)現(xiàn)LncRNA可以用作某些腫瘤的啟動(dòng)子[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA CCAT2在OSCC組織中高表達(dá)，這與劉英等[4]研究一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，在OSCC組織中高表達(dá)的CCAT2與OSCC患者TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)有關(guān)。但劉英等[4]研究卻發(fā)現(xiàn)，盡管淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移OSCC患者CCAT2的表達(dá)高于OSCC患者淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移患者，但差異不顯著，分析可能是由于兩份研究納入病例不足引起。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，敲低CCAT2抑制OSCC細(xì)胞在體外的侵襲和遷移能力。這與之前的很多研究結(jié)論是一致的，如LI等[10]發(fā)現(xiàn)CCAT2通過(guò)Wnt途徑促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的增殖和轉(zhuǎn)移;WU等[11]研究發(fā)現(xiàn)CCAT2通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

以往研究已經(jīng)表明[5]，CCAT2抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞中miR-145的表達(dá)。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，miR-145在OSCC細(xì)胞中低表達(dá)，并且與CCAT2表達(dá)呈負(fù)相關(guān);體外研究表明，敲低OSCC細(xì)胞中CCAT2促進(jìn)miR-145表達(dá)，miR-145同樣靶向抑制CCAT2表達(dá)。miR-145已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤組織中低表達(dá)，并發(fā)揮抑癌基因的作用，如miR-145在膀胱癌中充當(dāng)腫瘤抑制因子的作用而直接調(diào)節(jié)FSCN1的表達(dá)[12];miR-145在乳腺癌組織中低表達(dá)，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期以及腫瘤大小有關(guān)[13]。此外，miR-145還被發(fā)現(xiàn)抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，如SACHDEVA M和MO YY在細(xì)胞中研究miR-145的功能時(shí)發(fā)現(xiàn)，miR-145抑制細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[14];Al-Haidari等[15]發(fā)現(xiàn)，miR-145通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控人類(lèi)抗原R的表達(dá)而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移。結(jié)合本研究說(shuō)明，CCAT2可能通過(guò)抑制miR-145的表達(dá)而促進(jìn)OSCC的侵襲遷移。

本研究結(jié)果還顯示，p70S6K1在OSCC組織中高表達(dá)，且與miR-145表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與CCAT2表達(dá)呈正相關(guān);體外研究顯示，CCAT2通過(guò)抑制miR-145的表達(dá)而促進(jìn)OSCC細(xì)胞中p70S6K1的表達(dá)。p70S6K1蛋白在很多與惡性腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)的信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用，如SIRT7通過(guò)DBC1/SIRT1軸激活A(yù)kt和p70S6K1而促進(jìn)甲狀腺腫瘤的發(fā)生及癌細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)移[16];口服芹菜素通過(guò)AKT/P70S6K1/MMP-9途徑抑制原位卵巢腫瘤模型癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[17]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，敲低p70S6K1的表達(dá)可抑制OSCC細(xì)胞的侵襲和遷移能力。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA CCAT2和p70S6K1在OSCC組織和細(xì)胞中高表達(dá)，miR-145低表達(dá);而體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，LncRNA CCAT2/miR-145/p70S6K1可以調(diào)控OSCC細(xì)胞侵襲遷移。因此，LncRNA CCAT2/miR-145/p70S6K1分子軸可以作為治療OSCC患者的潛在靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2020-06-28）