一起由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒病原溯源

李曉路 遇 婷 廖 文 張 巍 何 穎 祝 琳

細(xì)菌性食物中毒是指進(jìn)食用被細(xì)菌或其毒素所污染的食物而引起的急性中毒性疾病，臨床表現(xiàn)為嘔吐、腹痛、腹瀉、發(fā)熱，其具有潛伏期短、起病急、病例集中的特點(diǎn)[1]。因此及時(shí)查找致病因子并采取針對(duì)性措施是處置食物中毒事件的關(guān)鍵。2018年4月，我市某高校發(fā)生一起食物中毒事件，累計(jì)發(fā)病患者10 例，經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)患者有共同進(jìn)餐史，于進(jìn)食后2 h 左右出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹部不適、腹痛、腹瀉等癥狀。所有患者發(fā)病前24 h 再無(wú)其他共同進(jìn)餐史，通過(guò)分析患者臨床癥狀、血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果，初步判斷為細(xì)菌性食物中毒。本研究采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法在采集的食物、生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)和患者嘔吐物樣本中分離出了5 株金黃色葡萄球菌，并對(duì)分離菌株進(jìn)行了腸毒素、藥物敏感性和脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）溯源分析?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株食物中毒事件中分離的5 株金黃色葡萄球菌，菌株編號(hào)及來(lái)源分別為：AS12 來(lái)源于嘔吐 物；AS13 來(lái)源于蓋澆飯；AS14 來(lái)源于豆皮；AS15來(lái)源于熟雞肉；AS16 來(lái)源于炒菜鍋壁涂抹拭子；ATCC6538 金黃色葡萄球菌、沙門菌H9812 為實(shí)驗(yàn)室保存標(biāo)準(zhǔn)菌株。

1.1.2 主要儀器與試劑主要儀器：酶標(biāo)儀（Anthos 2010）；脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀，Gel Doc XR 凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司）。

主要試劑：金黃色葡萄球菌腸毒素金標(biāo)快速檢測(cè)卡（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）；SMaⅠ內(nèi)切酶、瓊脂糖、葡萄球菌溶菌酶、蛋白酶K（大連寶生物有限公司）；抗生素（中國(guó)藥物研究所）。所有試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.2 方法

1.2.1 金黃色葡萄球菌腸毒素檢測(cè)將食物中毒事件中分離的菌株分別接種到5 ml BHI 中，36 ℃培養(yǎng)24 h，取1 ml 培養(yǎng)液加入1.5 ml EP 管中，以10 000 r/min進(jìn)行離心，時(shí)間5 min，取200 μl 上清液，加入等體積的樣品處理液，混勻，向檢測(cè)卡的3 個(gè)孔中每孔加入100 μl，按說(shuō)明書要求15 min 后判定結(jié)果。同時(shí)以BHI 作為陰性對(duì)照進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 藥物敏感試驗(yàn)采用美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）推薦的微量肉湯稀釋法進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，確定致病菌最低抑菌濃度（mimimal inhibitory concentration, MIC）[2]。根據(jù)CLSI 推薦的藥敏試驗(yàn)抗生素選擇原則確定革蘭陽(yáng)性菌適用的抗生素：苯唑西林（Oxacillin, OXA）、萬(wàn)古霉素（Vancomycin, VAN）、四環(huán)素（Tetracycline, TET）、紅霉素（Erythromyci, ERY）、氯霉素（Chloramphenicol, CHL）、克林霉素（Clindamycin, CLI）、環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin, CIP）、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑（Trimethoprim, TMP/ Sulfamethoxazole, SMZ）。將菌懸液濃度調(diào)整至0.5 麥?zhǔn)蠁挝?，?xì)菌濃度相當(dāng)于108 CFU/ml。取100 ml 稀釋于10 ml CAMHB 肉湯中，混勻（約為1×106CFU/ml），向96 孔藥敏板中加入菌懸液，每孔50 μl。同時(shí)做生長(zhǎng)對(duì)照和空白對(duì)照，另外要用ATCC6538做標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)照。36 ℃培養(yǎng)20～24 h 讀取藥敏試驗(yàn)結(jié)果。當(dāng)生長(zhǎng)對(duì)照孔中有明顯生長(zhǎng)，空白對(duì)照孔無(wú)菌生長(zhǎng)，并且質(zhì)控菌株的MIC 值在規(guī)定范圍內(nèi)結(jié)果才可接受。根據(jù)MIC 值和對(duì)應(yīng)MIC 值的解釋標(biāo)準(zhǔn)判斷被測(cè)試菌株對(duì)抗生素敏感度（S）、中介（I）、耐藥（R）。

1.2.3 PFGE 分子分型試驗(yàn)按照國(guó)家風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心提供的2016年《食源性疾病監(jiān)測(cè)工作手冊(cè)》，制備菌懸液，加入葡萄球菌溶菌素制備PFGE plug，裂解，清洗plug，使用SmaⅠ限制性內(nèi)切酶對(duì)金黃色葡萄球菌基因組DNA 進(jìn)行酶切，沙門菌H9812 作為電泳Marker，制膠進(jìn)行電泳[3]。14 ℃電泳19 h，EB染色，利用凝膠成像儀獲取圖像，運(yùn)用Bio Numerics軟件對(duì)DNA 指紋圖譜進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 金黃色葡萄球菌腸毒素結(jié)果

5 株金黃色葡萄球菌均產(chǎn)生A 型和C 型兩種腸毒素。

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

1 株來(lái)源于嘔吐物的菌株對(duì)ERY 耐藥，對(duì)OXA、VAN、TET、CHL、CLI、CIP、TMZ/SMZ 均敏感；另外4 株來(lái)源于食物和生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)的菌株對(duì)這8 種抗生素均敏感。見表1。

表1 MIC 解釋標(biāo)準(zhǔn)及判定結(jié)果

2.3 PFGE 結(jié)果

5 株金黃色葡萄球菌經(jīng)電泳凝膠成像，運(yùn)用Bio Numerics 軟件根據(jù)條帶數(shù)量及位置對(duì)圖譜進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖1?？梢钥闯龇謩e來(lái)源于嘔吐物、豆皮、熟雞肉、炒菜鍋壁涂抹拭子的4 株菌呈現(xiàn)出完全相同的分子帶型，具有100%同源性；另外1 株來(lái)源于蓋澆飯的金黃色葡萄球菌分子帶型則不相同，與上述4 株菌株具有70.59%的同源性。

3 討論

圖1 來(lái)自食物中毒樣品中的5 株金黃色葡萄球菌聚類 分析結(jié)果

金黃色葡萄球菌適應(yīng)力強(qiáng)、極易在環(huán)境中生存，并且可以通過(guò)多種方式和途徑污染食物。引起的食 物中毒在世界各國(guó)家占細(xì)菌性食物中毒的比例均較大[4]。我國(guó)20%～25%細(xì)菌性食物中毒病例由金黃色葡萄球菌引起[5]，是排在沙門氏菌和副溶血性弧菌之后的第3 大致病菌[6-7]。研究表明，造成金黃色葡萄球菌食物中毒的主要致病因子是腸毒素[8-9]。該菌一旦污染食品加工的任一環(huán)節(jié)，在適宜環(huán)境下，8～10 h甚至更短時(shí)間，便可大量繁殖并且產(chǎn)生腸毒素[10]。這種腸毒素采用一般的家庭烹飪方式無(wú)法將其滅活，100 ℃加熱30 min 仍具有活性[10-13]，因此金黃色葡萄球菌引起的食物中毒的概率較高。

本研究中食物中毒的5 株金黃色葡萄球菌均產(chǎn)生A 型和C 型腸毒素。產(chǎn)A 型腸毒素的金黃色葡萄球菌引起的食物中毒較多，是國(guó)際上及我國(guó)導(dǎo)致食物中毒菌株最常見的腸毒素類型[5,8-9,14]，食物中毒事件中70%以上金黃色葡萄球菌均產(chǎn)生一種或多種腸毒素[15]。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示食物中毒污染菌株中1 株來(lái)源于嘔吐物對(duì)ERY 耐藥，對(duì)OXA、VAN、TET、CHL、CLI、CIP、TMZ/SMZ 均敏感。另外4 株來(lái)源于食物和生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)的菌株對(duì)這8 種抗生素均敏感。鑒于目前金黃色葡萄球菌對(duì)部分抗生素產(chǎn)生耐藥性，臨床治療使用抗生素應(yīng)結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果，以達(dá)到更好的治療效果，亦能減少耐藥菌株出現(xiàn)。

PFGE 是以核酸分析為手段的檢測(cè)細(xì)菌染色體結(jié)構(gòu)特征的基因分型技術(shù)，具有重復(fù)性好、特異度高、結(jié)果容易判斷的優(yōu)點(diǎn)，且不受細(xì)菌表型性狀干擾，被認(rèn)為是細(xì)菌分子流行病學(xué)研究的“金標(biāo)準(zhǔn)”。在國(guó)外該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于食源性致病菌的病例監(jiān)測(cè)、分子流行病學(xué)研究及暴發(fā)疫情的處理過(guò)程中，在疫情控制方面可發(fā)揮重要作用[16-19]。本研究中，2 株食物來(lái)源和1株生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)來(lái)源菌株與1 株患者來(lái)源菌株100%同源，表明該種食物與此次食物中毒直接相關(guān)，另外1 株食物來(lái)源菌株與患者來(lái)源菌株70.59%同源，表明這種食物與此次食物中毒可能相關(guān)。由此可以斷定本次食物中毒是因?yàn)槎蛊ず碗u肉中污染了金黃色葡萄球菌，烹炒加工過(guò)程中炒菜鍋也受到了該菌的污染，但是普通的烹飪方式并沒有將其消除，以至于發(fā)生了此次食物中毒事件。蓋澆飯中檢出的金黃色葡萄球菌與患者來(lái)源的菌株同源性沒有達(dá)到100%，可能與此次檢測(cè)過(guò)程中同一來(lái)源樣品只溯源1 株菌有關(guān)，如果多溯源幾株菌株，結(jié)果可能會(huì)有所不同。

此次將PFGE 分子分型技術(shù)應(yīng)用于金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件中在本地區(qū)尚屬首次。通過(guò)PFGE 將來(lái)源于患者、食物和生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)樣本中檢出的金黃色葡萄球菌串聯(lián)在了一起，展示了其的遺傳關(guān)系，揭示了樣本之間的流行病學(xué)關(guān)系，明確地展示出了傳染源和傳播途徑，為相關(guān)部門處理此次事件提供了強(qiáng)有力依據(jù)。